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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE” INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA

Integrantes: Guasumba Yadira Maila Alexis Sanmartín Kerly Fecha: 15/Febrero/2018

Práctica N°: 12 NRC: 3312

1. Tema: Observación del control microbiano efectuado por agentes físicos 2. Palabras clave: punto termal de muerte, tiempo termal de muerte, filtración, incineración 3. Resumen Se realizaron cuatro ejercicios para observar el control microbiano efectuado por agentes físicos. El primer ejercicio trata los efectos de la temperatura en el crecimiento microbiano, manejándose a 4, 21, 35 y 50°C en caldo nutritivo y solución salina, en el que E. coli y S. aureus crecieron normalmente al ser microorganismos mesófilos y estar en su rango de temperatura. En el ejercicio dos, se midió los efectos letales de la temperatura, sin poder identificarse el punto termal de muerte, ya que a los 10 minutos, ninguna murió; el tiempo de muerte termal para E. coli y S. aureus fue de 30 minutos. En el ejercicio tres se observó que la bacteria no crece luego del proceso de filtración. Lo mismo sucedía con el ejercicio cuatro, ya no creció luego de incinerar el asa de cultivo con el que se inoculó. 4. Introducción Antecedentes La esterilización destruye o elimina toda forma de vida bacteriana sobre un objeto (Tortora, 2007). En el tiempod e los griedos, ya se usaba fuego y calor para esterilizar y desinfectar (Prescott, Harley, & Klein, 2004). Los principales agentes o

procesos físicos para el control microbiano son la remoción, aplicación de temperaturas altas, temperaturas bajas, desecación e irradiación (Strainer, 1996). Justificación Esta práctica se llevó a cabo para analizar el efecto de los agentes físicos en el crecimiento microbiano, mediante varias pruebas que afectaran a la población y permitirá rectificar el conocimiento adquirido por bibliografía. Marco teórico Los agentes físicos son condiciones o propiedades físicas que causan un cambio en el crecimiento microbiano, como ejemplos se tiene la humedad, temperatura, presión osmótica, pH, radicaciones y los filtros (Olivas, 2004). Los microorganismos tienen una temperatura ideal de funcionamiento: temperatura óptima de crecimiento, el rango varía de máxima a mínima, y son muy variados para diversas bacterias. Dependerá de si se trata de bacterias psicrófilas (crecen en 0-30°C), mesófilas (20-45°C) o termófilas (>45°C). El efecto letal sobre las bacterias se consigue por frío o calor (Botella & García, 2004). La destrucción de microorganismos más eficaz es por medio del calor. Para medir la eficacia se usa el punto de muerte térmica (PMT) que describe la temperatura más baja en la que la bacteria muere en 10 minutos. Otro parámetro a usar, es el tiempo de muerte térmica (TMT) que es el tiempo más corto en que se destruye al organismo a una temperatura específica (Prescott, Harley, & Klein, 2004). Para esterilizar líquidos contaminados, tales como sueros sanguíneos, medios de cultivo, soluciones de vía intravenosa, entre otros, se usa filtros de porosidad menor al tamaño de las bacterias y que sean retenidas para que el líquido quede estéril (Romero, 2007). Los filtros millipore de purificación, utilizan membranas de ósmosis inversa para purificar el agua (I.C.T, 2009). Estas membranas son mezclas de nitrato de celulosa y acetato de celulosa (Romero, 2007). La incineración se usa como proceso ideal de esterilización para materiales contaminados, que son resistentes a altas temperaturas; además de aplicarse a productos en los que no preocupa su destrucción tales como gasas, ropa

contaminada, entre otros. El flameado o fuego directo es el principal método usado en los laboratorios de microbiología para la esterilización de asas de siembra. El flameado con alcohol se puede usar para las bandejas, pinzas de algodón y otros alicates que no resisten altas temperatura (Negroni, 2009).

Objetivos 

Objetivo general:

Observar el control microbiano efectuado por agentes físicos

en el

crecimiento microbiano. 

Objetivos Específicos: o Analizar las consecuencias del incremento de la temperatura y el tiempo de exposición de los microorganismos para su crecimiento. o Determinar el punto termal de muerte y el tiempo termal de muerte para los diferentes microorganismos. o Comparar el crecimiento microbiano después de realizar filtración e incineración.

Hipótesis Los agentes físicos alteran el crecimiento de los microorganismos.

5. Métodos y materiales En el laboratorio de Docencia de Microbiología en la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE se realizó la práctica de observación del control microbiano efectuado por agentes físicos bajo la supervisión de Alma Koch, el 06 de Febrero del 2018 con la participación de los estudiantes del curso 3312. Ejercicio 1: Efectos de la temperatura en el crecimiento bacteriano. Se rotuló 4 tubos de ensayo con medio caldo nutriente a diferentes temperaturas: 4°C, 21°C, 35°C, 50°C, posteriormente se sembró en cada uno de los medios con un asa bacteriológica, el microorganismo que se utilizó es Staphylococcus aureus,

todo el procedimiento se lo realizó cerca del mechero. Se incubo a las temperaturas indicadas por 24 horas.

Ejercicio 2: Efecto letales de la temperatura Se rotuló 5 cajas Petri con medio agar nutriente con diferentes tiempos: 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos y una caja para el control, se rotuló dos tubos de ensayo con medio caldo nutriente uno para el control y en el otro tubo se sembró el microorganismo Staphylococcus aureus. Se calentó agua en un vaso de precipitación hasta llegar a una temperatura de 80°C, temperatura que se debe mantener constante durante todo el ejercicio para ello se utilizó un termómetro, posteriormente se colocó el tubo de control y el tubo que se sembró durante 10 minutos, una vez que transcurrió el tiempo se sembró en la caja correspondiente, se calentó durante 10 minutos más y se sembró en la caja de 20 minutos, el mismo procedimiento se repite hasta inocular la caja de 40 minutos. Se incubo a 37 °C por 24 horas.

Ejercicio 3: Filtración Se dividió en dos partes iguales una caja Petri con medio de cultivo EMB, se realizó siembra por estrías en la mitad de la caja antes de la filtración, posteriormente se tomó un mL de cultivo liquido con el microorganismo Escherichia coli, mediante un filtro milipore que se acopló a una jeringa, se presionó lentamente el embolo permitiendo el paso del medio por el filtro, se recogió el medio filtrado en un tubo estéril y como paso final se inoculó en la otra mitad de la caja. El procedimiento se lo realizó cerca del mechero para evitar contaminación. Se incubó a 37°C por 24 horas.

Ejercicio 4: Incineración Se rotuló una caja Petri con medio EMB, se dividió en dos partes iguales y se sembró en la mitad de la caja el microorganismo Escherichia coli antes de ser incinerada y la otra mitad de la caja después de ser incinerada en la llama luego de haber tomado la muestra de forma regular. El procedimiento se lo realizó cerca del mechero para evitar contaminación. Se incubó a 37°c por 24 horas.

6. Resultados Ejercicio 1: Efectos de la temperatura en el crecimiento bacteriano En el ejercicio 1 correspondiente a los efectos de la temperatura en el crecimiento de Staphylococcus aureus y Escherichia Coli. En caldo nutriente, se observó crecimiento bacteriano, turbidez, de ambos microorganismos y en todas las temperaturas, como se indica (Tabla 1).

Tabla 1: Efectos de la temperatura en el crecimiento bacteriano en caldo nutriente

Microorganismo

Temperatura (°C) 4

21

35

50

Staphylococcus aureus

1

2

3

3

Escherichia coli

1

1

3

2

*Sin crecimiento (0); Crecimiento: escaso (1); medio; medio (2); abundante (3)

Caldo nutriente Crecimiento bacteriano

3.5 3 2.5 2 S. Aureus

1.5

E. Coli

1 0.5 0 4

21

35

50

Temperatura (°C)

Gráfica 1: Temperatura vs crecimiento microbiano en caldo nutriente

En el caso de los tubos con solución salina, se observó crecimiento de Staphylococcus aureus en todas las diferentes temperaturas. Escherichia Coli solamente creció a la temperatura de 50°C (Tabla 2).

Tabla 2: Efectos de la temperatura en el crecimiento bacteriano en solución salina

Microorganismo

Temperatura (°C) 4

21

35

50

Staphylococcus aureus

1

2

3

3

Escherichia coli

0

0

0

1

*Sin crecimiento (0); Crecimiento: escaso (1); medio; medio (2); abundante (3)

Solución salina Crecimiento bacteriano

3.5 3 2.5 2 S. Aureus

1.5

E. Coli

1 0.5 0 4

21

35

50

Temperatura (°C)

Gráfica 2: Temperatura vs crecimiento microbiano en solución salina

Ejercicio 2: Efectos letales de la temperatura Se observó crecimiento S. aureus y E. coli para todas las temperaturas, a 10 y 20 minutos de exposición, en cambio que a partir de 70°C en un tiempo de 30 minutos, ya no hubo turbidez en el tubo de caldo nutriente (Tabla 3).

Tabla 3: Efectos letales de la temperatura Microorganismo

Temperatura

Control

(°C)

Tiempo (min) 10

20

30

40

E. coli

50

+++

+

+++

++

+++

E. coli

60

+++

+++

+++

+

+++

E. coli

70

++

++

++

-

+++

S. aureus

80

++

+

+

-

-

S. aureus

Ebullición

+++

+++

++

-

+

*Sin crecimiento (-); Crecimiento: escaso (+); medio; medio (++); abundante (+++)



Punto termal de muerte de cada organismo

A los 10 minutos, no murió ninguno de los microorganismos, se vio turbidez en los tubos. Se diferenció una reducción del crecimiento de E. coli a los 50°C y de S. aureus a los 80°C. 

Tiempo termal de muerte de cada organismo

Para E. Coli, el TMT es de 30 minutos a 70°C. Para S. Aureus, el TMT es de 30 minutos a 80°C.

Ejercicio 3: Filtración En la caja Petri con agar EMB que se dividió en dos partes, la primera se sembró antes de realizar la filtración se observó crecimiento, mientras que en la segunda mitad, en que se sembró el filtrado no presentó ningún crecimiento, lo que indica que el filtro milipore retuvo las bacterias de la muestra de Escherichia coli Figura 3. El crecimiento de E. coli fué de color verde metálico y las colonias de color negro (Figura 1).

Figura 1. Filtración: lado izquierdo se sembró antes de la filtración, existió crecimiento y en el lado derecho sin crecimiento se sembró la muestra filtrada

Ejercicio 4: Incineración La caja Petri con agar EMB correspondiente el ejercicio cuatro, fue dividida en partes, la primera se sembró E. coli siguiendo el procedimiento rutinario, luego de la incubación se observó crecimiento, a diferencia de la otra mitad donde se incineró el asa bacteriológica antes de sembrar, no presentó crecimiento alguno, sugiere que al exponer al fuego a E. coli hasta que el asa esté incandescente es un método sencillo de esterilización (Figura 2).

Figura 2. Incineración: lado izquierdo se sembró antes de la incineración del asa, existió crecimiento y en el lado derecho sin crecimiento se sembró con el asa incinerada.

7. Discusión La Staphylococcus aureus es un microorganismo mesófilo, que tiene un rango de temperatura de entre 6.5 a 46°C para su crecimiento, siendo de 20-37°C la óptima (Prescott, Harley, & Klein, 2004). También puede crecer en soluciones salinas (Fetsch, 2017). Escherichia Coli tiene un rango de 10-45°C para su crecimiento, además de que es osmotolerante (Infante, 2012). Se observa aumento de la turbidez en el caldo nutriente para los dos microorganismos, a medida que sube la temperatura, debido a que se encuentra dentro de su rango. En la solución salina, también hubo aumento de crecimiento para S. aureus pero no para E. coli. El tiempo de muerte térmica a 57.3°C de E. coli, es de 20-30 minutos, para S. aureus, a 60°C la TMT es de 18.8 minutos (Vázquez, 2007). Valor aproximado al obtenido en el experimento, en que dejó de reproducirse la escherichia, que fue de 30 minutos a 60°C. En cambio que el TMT de S. aureus, fue de 30 minutos a 80°C, valor alejado del dato bibliográfico, para obtener valores concordantes se necesita manejar S. aureus en todas las temperaturas para conocer su valor. En el agar EMB, en la parte que se sembró antes de la filtración se observó crecimiento, de color verde metálico y las colonias de color negro, el agar EMB es un medio de cultivo diferencial y selectivo que permite aislar, detectar bacilos Gram negativos (Strainer, 1996), como lo es E.coli, además el medio de cultivo indica que es un microorganismo fermentador de lactosa porque sus colonias fueron de color negro con brillo metálico (Britania, 2015). En la otra división de la caja Petri donde se sembró la muestra filtrada no se observó crecimiento, la filtración es el único métodos de remoción con el que se puede eliminar todos los microorganismos presentes (Ramos, 2012), para esto se utiliza filtros con poros tan pequeños que pueden retener los microorganismo, este método se aplica cuando no se desea perder las características

de sustancias que con otros

métodos de esterilización lo hacen (Santambrosio, 2009). La filtración se lleva a cabo para esterilizar materiales sensibles al calor, como medios de cultivos, soluciones azucaradas, vacunas (Aquiahuatl, 2004) .

La longitud de E. coli es de aproximadamente de 3 μm (Rodríguez, 2013), el filtro milipore con un tamaño de poro de 0.22 μm contiene una membrana de Fluoruro de polivinilideno hidrofílico (PVDF) hidrofílica, para filtración no estéril, se utiliza en muestras biológicas y soluciones de proteínas (Reshes, 2008); la porosidad de este filtro no permite el paso de las bacterias, por lo que se considera un instrumento de esterilización (Merck, 2017).

En la caja Petri con agar EMB del ejercicio 4, en la mitad en la que se sembró con el asa bacteriológica expuesta en la llama del mechero hasta la incandescencia no mostró crecimiento lo que puede señalar que es un método de esterilización, una de los métodos más sencillos de esterilización en el laboratorio es el flameado, se lo utiliza para esterilizar asas de siembra, para lo cual se calienta el alambra al rojo vivo

con la llama del mechero, lo que

determina la incineración de los microorganismos tanto en su forma vegetativa como esporulada (Fraile, 2011), el fuego es una oxidación rápida de un combustible que desprende energía en forma de luz y calor (Campbell N., 2007) destruye a los microorganismo mediante la desnaturalización de sus enzimas, los cambios resultantes de la estructura tridimensional de estas proteínas producen su inactivación (Prats, 2006).

8. Conclusiones Los microorganismos siguen creciendo en los diferentes medios, debido a que la temperatura manejada permanece dentro del rango de crecimiento de E. coli y S. aureus, ambas son bacterias mesófilas. El tiempo de muerte térmica permite conocer el tiempo que necesita exponerse las bacterias para que estas mueran, a una temperatura definida; a 60°, la E. coli, debe estar media hora y S. aureus unos 20 minutos, se aplican estos conocimientos para la desinfección de materiales. Los agentes físicos con mayor influencia sobre los microorganismos son la temperatura, incineración, ya que al exponer una muestra con bacterias a alguno de estos agentes, se produce la inhibición de su crecimiento, al sufrir

desnaturalización de sus proteínas lo que culmina en su muerte, lo cual se evidencia en los medios de cultivo al no presentar crecimiento alguno. La filtración es un método que requiere de una membrana cuya tamaño de poro deber ser lo suficientemente pequeño para retener a los microorganismos, con lo que se va obtener un filtrado estéril, el éxito de este proceso no va a depender sólo de una correcta selección del filtro de membrana sino del conocimiento del tamaño de microorganismo a filtrar, ya que si es menor al poro este método es vuelve inservible.

9. Bibliografía Aquiahuatl, M. (2004). Manual de prácicas de laboratorio de Microbiología general. México: Reverté. Botella, A., & García, J. (2004). Manual de auxiliar de enfermería. España: Mad. Britania. (2015). E.M.B. agar. Obtenido de http://www.britanialab.com.ar/esp /productos/b02/embagar.htm Campbell N., R. J. (2007). Biología. España: Panamericana. Fetsch, A. (2017). Staphylococcus aureus. London: Elsevier. Fraile, R. (2011). Microbiología en ciencias de la salud. España: Elsevier. I.C.T. (2009). Filtración de laboratorio: Guía de productos. España: Instrumentación Científica Técnica, S-L. Infante, V. (2012). Solución salina como medio de cultivo de vista de las bacteriemias nosocomiales. Revista de Investigación científica, 120-125. Merck. (2017). Filtro Millex 0.22μm. Obtenido de https://www.merckmillipore. com/INTL/en/product/Millex-GV-Filter-0.22nbspm-PVDF-33nbspmm-nonsterile,MM_NF-SLGV033NS Microbiología Estomatol+ogica. (s.f.). Negroni, M. (2009). Microbiología estomatológica. Buenos Aires: Médica Panamericana. Olivas, E. (2004). Manual de practicas de microbiología básica y microbiologia de alimentos. Ciudad Juarez: Universidad autonoma de ciudad Juarez.

Prats, G. (2006). Microbiología clínica. España: Panamericana. Obtenido de España Prescott, L., Harley, J., & Klein, D. (2004). Microbiologia. España: McGraw Hill Interamericana. Ramos, M. V. (2012). Manual de laboratorio de Microbiología general. México: UAM. Reshes, G. (2008). Cell Shape Dynamics in Escherichia coli. United States: Biophys. Rodríguez, E. G. (2013). Bacteriología general. Costa Rica: UCR. Romero, R. (2007). Microbiología y parasitología humana. México: Médica Panamericana. Santambrosio, E. (2009). Siembra y recuento microbiano. Argentina: UTM. Strainer, R. (1996). Microbiología. España: Reverté. Tortora, G. (2007). Microbiology. Madrid: Médica panamericana. Vázquez, M. (2007). Fundamentos de la determinación de parámetros cinéticos para microorganismos de interés en tratamiento térmico de alimentos. Temas selectos de Ingeniería de Alimentos, 1-14.