FACULTAD DE INGENIERÍA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA
Tema Nº 08: HIDROLISIS DE CARBOHIDRATOS, PROTEINAS y LIPIDOS
RESPONSABLE (S): TALAVERA QUISPE, Silvia Alessandra COLQUI LAZO, Christel PEREZ HINOJOSA, Linda LAGOS ARIAS, Ibrahim CALDERON CONDORI, Leonel CONDORI ESPINAL, Jorge Miguel
DOCENTE: Biologa. Mercy Rojas Moreno HUANCAYO – PERÚ
2016
INTRODUCCIÓN Los compuestos orgánicos hacen referencia a todos aquellos compuestos o especies químicas que en su composición contienen carbono y que se asocian de una u otra forma a la vida, aunque esta es un definición por excelencia no todos los compuestos que contienen carbón se consideran orgánicos es el caso de anhídrido carbónico, los carbonatos y los cianuros. Las macromoléculas más representativas son: Carbohidratos, Lípidos3 y Proteínas. En el presente informe se muestra la gran diversidad de las bacterias las cuales constan de enzimas, y estas poseen propiedades fisiológicas y bioquímicas, las mismas que evidencian en la expresión de los genes del ADN de la bacteria, para detectar dichas propiedades existen pruebas bioquímicas, estas nos sirven para detectar si la bacteria puede degradar ciertos medios los cuales contienen proteínas, lípidos o carbohidratos. Realizar estas pruebas es muy importante en la microbiología, ya que nos permite establecer diversos criterios para poder clasificarlos adecuadamente para su clasificación taxonómica y de esta forma identificar el tipo de bacteria. Y esto se detallara a lo largo del presente informe.
CANTIDAD
EQUIPOS/MATERIALES y REACTIVOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA:
16 08 16 01 08 08 04 04 04
Asas bacteriológicas (01 asa/mesa) Asas bacteriológicas con punta en aguja (01 asa/mesa) Tubos 4 ml de CBF + Glucosa con campana durham (2 tubos/mesa) Tubos 4 ml de TSI (2 tubos/mesa) Placas con Agar Almidón. (1 placa/mesa) Tubos 4 ml de Agar urea (2 tubos/mesa) Matraz con 100 ml de agar nutritivo (1 solo matraz para 1er y 2 turno) Placas con agar lecitina (1 placa/mesa) Placas con agar tributirina (1 placa/mesa) Tubos inclinados de AN sembrados con E. coli de 24 h (1 tubo/mesa) Tubos inclinados de AN sembrados con B. subtilis de 24 h (1 tubo/mesa) Botellas de alcohol de 70° para desinfección de las mesas. (1 botella/mesa)
CANTIDAD
04 04 16
DESCRIPCIÓN
DESCRIPCIÓN
04
Asas bacteriológicas (01 asa/mesa)
04 16
Asas bacteriológicas con punta en aguja (01 asa/mesa) Tubos 4 ml de CBF + Glucosa con campana durham (2 tubos/mesa)
16
Tubos 4 ml de TSI (2 tubos/mesa)
08
Placas con Agar Almidón. (1 placa/mesa)
16
Tubos 4 ml de Agar urea (2 tubos/mesa)
01 08
Matraz con 100 ml de agar nutritivo (1 solo matraz para 1er y 2 turno) Placas con agar lecitina (1 placa/mesa)
08
Placas con agar tributirina (1 placa/mesa)
04 Tubos inclinados de AN sembrados con E. coli de 24 h (1 tubo/mesa)
04
Tubos inclinados de AN sembrados con B. subtilis de 24 h (1 tubo/mesa)
04
Botellas de alcohol de 70° para desinfección de las mesas. (1 botella/mesa)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a.
HIDROLISIS DE CARBOHIDRATOS
A. CALDO BASE DE FERMENTACIÓN (CBF) Peptona Extracto de carne NaCl Rojo fenol 1/500 Agua destilada *Ajustar a pH 7,2 0,1
10g. 3g. 5g. 12,5ml. 1000ml.
Se autoclava y luego se añade el carbohidrato requerido para la identificación (glucosa 1% ). Servir en tubos estériles de 13*100mm con campana Durham. Siembra: Inocular la bacteria en cada tubo con el asa bacteriológica. Preparar 2 tubos diferentes, y sembrar en cada tubo los siguientes microorganismos: En el CBF + glucosa : sembrar E. coli y B. subtilis. Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. B. Agar TSI Extracto de carne Extracto de levadura
3g 3g
Peptona Peptona Proteasa Dextrosa Lactosa Sucrosa Sulfato de fierro Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Agar Rojo de fenol
15g 5g 1g 10g 10g 0.2g 5g 0.3g 12g 0.024g
Esterilizar en autoclave a 121ºC- 124ºC por 15 minutos. Servir 3.5ml/tubo e inclinar los tubos, de tal manera que se forme el pico de flauta. Si es medio preparado es para hidratar, suspender 65 g de medio base en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullición hasta disolver completamente. Llenar hasta la tercera parte de los tubos Esterilizar en autoclave a 121ºC- 124ºC por 15 minutos y servir en tubos inclinados, de tal manera que se forme el pico de flauta. Tapar con algodón cada tubo. Siembra: Para sembrar en el medio, se hace una picadura profunda y al retirar el asa se estría en el pico de flauta. Tapar el tubo con algodón. Preparar 2 tubos, y sembrar en cada tubo los siguientes microorganismos: 1. E. coli 2. B. subtilis Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.
C. AGAR ALMIDON Agar común Almidón
1000ml 2g
*Ajustar a pH 7,2 0,1 Disolver en el agua todos los componentes y ajustar el pH a 7.2. Estelirizar en la olla a presión durante una hora y posteriormente repartir en placas de Petri estériles. Siembra: Dividir la placa en 2 mitades y sembrar por puntura. Sembrar en cada placa los siguientes microorganismos: 1. Bacillus subtilis 2. E. coli Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. Después de la incubación se debe agregar lugol a toda la placa para hacer la lectura.
b.
HIROLISIS DE PROTEINAS
A. AGAR UREA Peptona 1g. NaCl 5g. Glucosa 1g. Rojo fenol 6ml (1/500) Agar agar 15g Urea 20g. Fosfato monobásico de potasio 2g. Agua destilada 1000ml *Ajustar a pH 7,2 0,1 Prodedimiento. Disolver 15g de agar en 900ml. de agua destilada y esterilizar a 121ºC a 15lb por 15 minutos. Luego enfriar a 50º-55ºC. En los 100ml restantes se agregan 20g de urea y esterilizar por filtración. Finalmente se le agrega el agar. Servir 2.5 ml/tubo e inclinar. Siembra: A partir del cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Preparar 2 tubos, y sembrar en cada tubo los siguientes microorganismos: 3. E. coli 4. B. subtilis Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. En este medio de cultivo, solo crecen aquellos microorganismos que pueden utilizar la urea como única fuente de carbono. Los gérmenes que producen urea producen un viarje del indicador hacia el rojo y turbidez del medio de cultivo.
B. AGAR CASEINA Agar común…………………………………………1000 ml Caseína ……………………………………………... 2,5 g ClCa 2…………………………………………………0,05 g Leche en polvo ……………………………………….10 g *Ajustar a pH 7,2 0,1 Suspender los ingredientes, calentar hasta disolución y mantener 10 minutos. Esterilizar en autoclave y servir en placas. Se puede agregar 5-10 g de leche descremada para reforzar la turbidez. Este medio se usa para la investigación de microorganismos proteolíticos. Estos son capaces de degradar la caseína y aparecen con un halo transparente alrededor de las colonias. Si el halo no
es visible agregar ácido acético 1N, que refuerza la opacidad del medio por desnaturalización de la caseína y se destaca el halo de degradación. c.
HIDROLISIS DE LIPIDOS
A. AGAR LECITINA Agar común Glucosa Emulsión de yema de huevo
1000ml 2g 100 ml
*Ajustar a pH 7,2 0,1 Emulsión de yema de huevo: Sumergir el huevo en una solución alcohólica al 70% durante 30 minutos.
Luego se hace un orificio en la cascara, con ayuda de una pinza estéril,
posteriormente se elimina la clara de huevo. Colocar la yema en una probeta estéril y se agrega a la misma un volumen igual de NaCl 0.85%. Con una bagueta estéril se disuelve toda la suspensión (en condiciones de asepsia) y mezclar con en el agar lecitina previamente preparado. Se sirve en placas estériles. Siembra: A partir del cultivo puro de 18-24 horas, sembrar por puntura el microorganismo en la mitad de la placa cada microorganismo. Sembrar en cada placa los siguientes microorganismos: 5. Bacillus subtilis 6. E. coli Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. o hasta observar desarrollo. 3. Observar la presencia o ausencia de halos de precipitado insoluble o traslúcido alrededor del área de crecimiento de los microorganismos testeados. Bacillus subtilis, no posee la enzima lecitinasa, la cual es una fosfolipasa que hidroliza la lecitina de la yema de huevo, cuyos productos precipitan dando un halo blanco alrededor de las colonias.
B. AGAR TRIBUTIRINA Peptona
0,5g
Extracto de levadura
0,3g
Tributirina
1,0ml
Agar agar
1,5g
Agua destilada
100ml
*Ajustar a pH 7,2 0,1 Se prepara el medio, se esteriliza en la autoclave y se sirve en placas. Siembra: Se procede a rociar caspa de la cabeza de algún compañero en cada placa conteniendo el medio Agar Tributirina. Incubación: En aerobiosis, durante 48- 72 horas a 35-37 °C. Este medio se utiliza para la identificación de microorganismos lipolíticos. La degradación de la tributirina produce halos de aclaramiento alrededor de las colonias, en contraste con el resto del medio que permanece turbio. La incubación es de hasta 72 horas en condiciones óptimas. RESULTADOS HIDROLISIS DE CARBOHIDRATOS A. CALDO BASE DE FERMENTACIÓN (CBF)
Luego de agregar el Rojo de Metilo a la muestra de E. Coli con glucosa en el caldo base de fermentación se observó que este se tornó de un color amarillo. Por lo que se obtuvo un resultado positivo acido. Luego de agregar el Rojo de Metilo a la muestra de Bacillus Subtillis con glucosa en el caldo base de fermentación se observó que este se tornó de un color rojizo. Por lo que se obtuvo un resultado negativo alcalino. B. AGAR TSI
Luego de agregar el Rojo de Fenol al agar TSI conteniendo el E. Coli, se observó cambio de color a rojizo. Por lo que se obtuvo un resultado positivo acido tanto en la lactosa, sacarosa y glucosa. Luego de agregar el Rojo de Fenol al agar TSI conteniendo el Bacilus Subtitllis, se observó cambio de color en la parte inferior y permaneció de color amarillo. Por lo que se obtuvo un resultado negativo alcalino tanto en la lactosa, sacarosa y glucosa. C. AGAR ALMIDON
Luego de agregar Lugol al agar Almidon con la siembra de B. Subtillis, se observó que en los contornos de la siembra se tornó de un color oscuro, por lo que se obtuvo una prueba positiva. Luego de agregar Lugol al agar Almidon con la siembra de E. Coli, se observó que la siembra no cambio de color y permaneció igual, por lo que se obtuvo una prueba negativa. HIDROLISIS DE PROTEINAS A. AGAR UREA
Luego de sembrar E.coli en la muestra de agar Urea, se agregó rojo de metilo y se observó que cambio a un color rojo, por lo que se obtuvo un resultado negativo acido. Luego de sembrar B. Subtilis en la muestra de agar Urea, se agregó rojo de metilo y se observó que no hubo cambio alguno en el color y en su apariencia, por lo que se obtuvo un resultado positivo acido. HIDROLISIS DE LIPIDOS A. AGAR LECITINA
Luego de sembrar B. Subtillis en la muestra de Lecitina, se siguió el procedimiento indicado. Al final se observó que la siembra no produjo lectinasa, ya que visiblemente no se observó cambio significante. Por lo que se obtuvo un resultado negativo. Luego de sembrar E. Coli en la muestra de Lecitina, se siguió el procedimiento indicado. Al final se observó que la siembra formo una zona opaca alrededor de la bacteria y si produjo lecitinasa. Por lo que se obtuvo un resultado positivo. B. AGAR TRIBUTIRINA
Luego de agregar muestras de caspa al agar tributirina, se observó que alrededor de las colonias de caspa se tornó de color claro y se pudo diferenciar claramente del resto del medio. Por lo que si se dio la degradación de la tributirina.
DISCUSIÓN
En algunos casos fue un poco difícil el reconocimiento de los cambios visuales tanto en las placas como en los tubos. Es posible que en los procedimientos, sobre todo en el caso de la hidrolisis de carbohidratos, no se siguió los pasos adecuadamente. Lo que al final dificulto la obtención de los resultados finales Sería recomendable hacer las pruebas usando el rojo de fenol para también observar en la práctica los resultados a obtener. En el caso de la siembra en las placas depende de la efectividad de la técnica para la siembra para observar mejor los resultados.
CONCLUSIÓN
Los procedimientos usados son útiles para la identificación y clasificación de bacterias y hongos. Es necesario seguir correctamente los procedimientos para la mejor obtención de resultados.
Se concluye que las proteínas son materiales polímeros que se encuentran en las células vivientes y nos sirven como materiales estructurales en el cuerpo y son fundamentales para muchos procesos vitales
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
I.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: LANSING M. PRESCOTT. 2004 Microbiología. Quinta Edicion. Mc Graw Hill. (Biblioteca UC: 616.01 / P85 2004)