Informe Extraccion Proteinas.docx

6. PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME 1. Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde explique el fundamento bioquímico de cada una de las etapas de la extracción de proteínas.

2. Explique el efecto del Buffer RIPA (teniendo en cuenta sus componentes) que permiten la posterior extracción de proteínas de la muestra. ¿Cuál es la razón por la cual las proteínas se ubican en el sobrenadante después de la centrifugación con el buffer RIPA? ¿Qué componentes se ubican en el precipitado? R// RIPA es un buffer ampliamente usado para la lisis celular y solubilización proteica debido a su contenido de sales tipo cloruro de sodio (NaCl) y Trisaminometano (Tris) y detergentes como el Tritón X-100, Dodecilsulfato sódico (SDS) y el Desoxicolato de sodio. Principios básicos tales como la ósmosis celular y la estructura fosfolipídica de la membrana fundamentan el uso de dicho buffer en este procedimiento.

3. Explique qué metodología(s) podría utilizar para analizar la calidad y calidad de las proteínas extraídas.

Cromatografía de filtración en gel La filtracion en gel separa proteínas (o ácidos nucleicos) con base en su tamaño efectivo (radio hidrodinamico). Como la cromatografía de intercambio iónico, el material de separación consiste en cuentas diminutas que se empacan en una columna a través de la cual la solución de proteína pasa lentamente. Los materiales que se emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos con enlaces cruzados (dextranos o agarosa) de distinta porosidad, lo que permite que las proteínas se difundan dentro y fuera de las cuentas. La mejor forma de describir la técnica es con un ejemplo (fig. 18-25). encuentra en solución con dos proteínas contaminantes de forma similar, una mucho más grande de 250 000 daltones, y la otra mucho más pequeña, de 75 000 daltones. Un modo en que la proteína podría purificarse consiste en pasar la mezcla por una columna de cuentas Sephadex G-150, que permite la entrada de proteínas globulares menores de 200 kDa. Cuando la mezcla de proteínas pasa por el lecho de la columna, la proteína de 250 kDa es incapaz de entrar a las cuentas y permanece disuelta en la fase solvente móvil. Como resultado la proteína de 250 kDa se extrae en cuanto el solvente de la columna (el volumen del lecho) termina de gotear. En cambio, las otras dos proteínas pueden difundirse a los intersticios entre las cuentas y su paso por la columna se retrasa. Conforme más solvente pasa por la columna, estas proteínas se mueven hacia abajo y salen por el fondo, pero lo hacen a distintas velocidades. Entre las proteínas que entran a las cuentas, las especies más pequeñas se retrasan más que las

grandes. Por consiguiente la proteína de 125 kDa se extrae en estado purificado, en tanto que la proteína de 75 kDa permanece en la columna.

4. Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de proteínas a partir de muestras biológicas Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos La extracción de proteínas es un paso esencial en la preparación de muestras en proteómica. Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y microorganismos. La sonicación es un método confiable y eficiente de extracción de proteínas que proporciona altos rendimientos de proteínas en un tiempo de extracción corto. Extracción de proteínas La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es una etapa esencial de preparación de la muestra que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y analíticas como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometría de masas, o purificación de proteínas. Ultrasónico Alteración celular, lisis y extracción. Es una técnica precisamente controlable para asegurar altos rendimientos de proteínas Extracción de proteínas del suero sanguíneo, Extracción de proteínas de tejido vegetal, extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza,

5. Realice la curva de calibración (Absorbancia vs Concentración) y describa como puede asegurarse a partir de este grafico que la solución cumple la ley de Lambert-Beer. Determine la ecuación de la curva y=mx+b con los datos obtenidos

6. Determine la concentración proteica en la muestra desconocida y en la muestra de hígado a partir de los datos de absorbancia y utilizando la ecuación obtenida en la curva de calibración.

7. Teniendo en cuenta la función del hígado, ¿Qué tipo de proteínas de expresión abundante esperaría usted en este tejido? Explique. El hígado cumple funciones importantes: almacena la energía proveniente de los alimentos, produce proteínas y ayuda a eliminar toxinas. El hígado también fabrica la bilis, un líquido que ayuda a hacer la digestión.

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La alanina aminotransferasa (ALT). Esta enzima, presente en el hígado, cumple una función en el metabolismo (el proceso que convierte los alimentos en energía). Si el hígado se lesiona, se libera ALT en el torrente sanguíneo. Los niveles de ALT son particularmente elevados cuando existe una hepatitis aguda.

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Fosfatasa alcalina (ALP). Esta enzima se encuentra en el hígado, los huesos, los intestinos, los riñones y otros órganos. Tanto los niños como los adolescentes

tienen niveles de ALP más elevados que los adultos, aún cuando están sanos, a causa del crecimiento óseo. Pero los niveles de ALP también pueden aumentar como consecuencia de infecciones virales, enfermedades hepáticas y el bloqueo de los conductos biliares. 

Aspartato aminotransferasa (AST). Esta enzima, que desempeña un papel en el procesamiento de proteínas, está presente en el hígado, el corazón, los músculos y los riñones. Cuando el hígado se lesiona o inflama, los niveles de AST en la sangre suelen ser elevados.

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Bilirrubina total y bilirrubina directa. La bilirrubina es un derivado de la degradación de los glóbulos rojos. Por lo general, pasa a través del hígado y es eliminada del organismo. Pero si esto no ocurre, a causa de una enfermedad hepática, los niveles de bilirrubina en la sangre suelen aumentar y la piel se torna amarillenta (ictericia). Los análisis de bilirrubina pueden ser total (miden el nivel de toda la bilirrubina en sangre) o directa (miden solamente la bilirrubina que ha sido procesada por el hígado y como resultado se ha unido a otras sustancias químicas).

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Albúmina y proteína total. La proteína es necesaria para formar y mantener los músculos, los huesos, la sangre y el tejido de los órganos. A veces, cuando hay un problema con el hígado, éste no puede producir proteínas y, por lo tanto, los niveles de proteínas disminuyen. Los análisis de las funciones hepáticas miden específicamente la albúmina (la proteína más importante de la sangre producida por el hígado) y la cantidad total de todo tipo de proteínas en la sangre.