Informe De Lab 3

Pàctiques de Laboratori III - Estudi de la inhibició de la lipòlisi per -hidroxibutirat i àcid nicotínic, a través de receptors PUMA-G en adipòcits de rata estimulats per adrenalina. Introducció: En aquest experiment es pretén demostrar l’efecte inhibitori de la lipòlisi a través de dos compostos, un cos cetònic com és el hidroxibutirat; i un fàrmac com és l’àcid nicotínic. Aquests compostos inhibeixen la lipòlisi a través de d’interacció amb receptors PUMA-G, que es caracteritzen per ser receptors de set dominis transmembrana. Aquests activen proteïnes G inhibidores (Gi) que disminueixen l’activitat de la adenilat ciclasa, fent que a través d’una cascada de senyals en que intervé la ptoteïna quinasa A (PKA) i en que s’acaben degradant els lípids de les gotes dels adipòcits a àcids grassos i glicerol disminueixi. Per tal de poder mesurar l’efecte real de la inhibició de la lipòlisi ho fem sobre adipòcits estimulats amb adrenalina ja que sinó la taxa basal de lipòlisi és molt minsa. L’adrenalina estimula a través dels receptors adrenèrgics i una proteïna G estimuladora (Gs), provocant l’augment de l’activitat lipolítica. Aquesta lipòlisi és mesurada a través de la producció de glicerol.

1

Materials i mètodes: Primerament, cal aïllar els adipòcits de rata del teixit adipós blanc, procurant no barrejar diferents procedències (epiridimal i lumbar). Llavors es prossegueix com està descrit. Resultats: En un experiment preliminar vàrem determinar l’efecte de l’adrenalina sobre adipòcits a diferents temps d’incubació. D’aquest experiment previ decidirem que el temps òptim per observar les màximes diferències era l’incubació de 60 minuts. Efecte de l'adrenalina 0,1 M 450 400 350

[Glicerol] ( M)

300 250 200 150 100 50 0 0

10

20

30

40

50

60

70

Temps Incubació (min) Control

Adrenalina

Lineal (Adrenalina)

Lineal (Control)

y = 0,9806x + 12,117

Recta patró de Glicerol

2

R = 0,9938 600

500

DO

400

300

200

100

0 0

100

200

300

400

500

600

M Glicerol

Per determinar les concentracions de glicerol vàrem emprar una recta patró d’Abs340 del glicerol a diferents concentracions.

2

Glicerolµ M =

( Abs340 − 12,12) 0,9806

Per tal de determinar la concentració de glicerol en relació al nombre de cèl·lules vàrem emprar les diverses mesures fetes a partir de la cambra de Neubauer. 31 22 25 30

X =

27cèl 103 µ l cèl . = 2, 7.105 ml 0,1µ l 1ml

Glicerolµ M .

103 nmol 1l 0, 75ml 105 . . . 1µ mol 103 ml 0, 7 ml 108000

Les diferents mostres consistien en: un control negatiu en que tant sols incubàvem els adipòcits sense cap compost estimulador o inhibidor de la lipòlisi, un control positiu (Adrenalina) en que estimulàvem al màxim la lipòlisi, una sèrie de mostres tractades amb adrenalina i concentracions creixents d’àcid nicotínic de l’ordre de micromolar i una altra amb -hidroxibutirat a concentracions creixents de l’ordre de milimolar. Mostres Control Control Adrenalina 0,1 M Adrenalina 0,1 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 1 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 1 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 10 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 10 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 100 M Adrenalina + Àcid Nicotínic 100 M Adrenalina + -hidroxibutirat 2mM Adrenalina + -hidroxibutirat 2mM Adrenalina + -hidroxibutirat 10mM Adrenalina + -hidroxibutirat 10mM

DO1 0,401 0,405 0,406 0,399 0,400 0,403 0,417 0,392 0,390 0,397 0,405 0,396 0,408 0,395

DO2 1,014 0,802 1,326 1,521 1,023 0,943 0,668 0,695 0,677 0,616 1,145 1,283 1,455 1,282

DO 0,613 0,397 0,920 1,122 0,623 0,540 0,251 0,303 0,287 0,219 0,740 0,887 1,047 0,887

M Glicerol 613 392 926 1132 623 538 244 297 280 211 742 892 1055 892

nmols/10^5 cèl 506 1037 585 272 248 824 982

Resultats de la inhibició de lipòlisi per -hidroxibutirat (cossos cetònics) i àcid nicotínic (fàrmac) sobre receptors PUMA-G dels adipòcits de teixit adipòs blanc de rata 1200 Adrenalina

Adrenalina + -hidroxibutirat 10mM

1000

[Glicerol] nmols/10^5 cèl

Adrenalina + -hidroxibutirat 2mM 800

Adrenalina + Àc Nicotínic 1 M

600 Control

400

Adrenalina + Àc Nicotínic 100 M

Adrenalina + Àc Nicotínic 10 M 200

0 1 Tractaments

3

Discussió i conclusions: Es pot observar clarament diferents aspectes de l’experiment en el gràfic de barres presentat anteriorment. En primer lloc, podem veure com la taxa de lipòlisi es veu doblada respecte la basal del control en estimular els adipòcits amb l’adrenalina, tal i com és d’esperar, ja que activa els receptors -adrenèrgics ( 1, 2 i 3). Aquests receptors activen proteïnes G estimuladores (Gs) a través de la dissociació de les subunitats i . Aquesta llavors activa l’activitat de la adenilat ciclasa que comença a produïr AMP cíclic. Aquest AMP cíclic s’uneix a la proteïna quinasa A (PKA) que activa tota una cascada de senyalització a través de diverses fosforilacions. En segon lloc, podem observar com en afegir una concentració d’àcid nicotínic de 1 M sobre la mateixa concentració d’adrenalina, la taxa de lipòlisi es veu disminuïda a la meitat en comparació amb la mostra en que només tenim la estimulació amb adrenalina. Aquest fet és degut a la inhibició que duen a terme els receptors PUMA-G murins en activar proteïnes G inhibidores (Gi) que redueixen l’activitat de la adenilat ciclasa. Si augmentem la concentració d’aquest inhibidor de la lipòlisi deu vegades (10 M), tant sols observem una petita disminució de prop de la meitat del cas anterior. Tornant a augmentar la concentració d’àcid nicotínic fins a 100 M podem observar que pràcticament no hi ha diferència significativa en la taxa d’inhibició de la lipòlisi respecte al cas anterior. Això significa que hi ha una progressiva saturació dels receptors PUMA-G que no permeten disminuir la taxa de lipòlisi, per més alta que sigui la concentració d’àcid nicotínic, més enllà dels 248 nanomols de glicerol per cada 105 cèl·lules. En tercer lloc, pel que fa a la inhibició de la lipòlisi a través del seus inhibidors naturals que són els cossos cetònics, en aquest cas concret pel -hidroxibutirat, veiem un efecte molt menor tot i estar treballant a unes concentracions entre mil i deu mil vegades més elevades. En aquest punt cal tenir en compte que les dades que hem obtingut entren en contradicció en tant que en augmentar la concentració de -hidroxibutirat fins a 10mM obtenim una inhibició molt menor que a concentracions més baixes com és el 2mM. Cal prendre doncs aquestes dades en un sentit més qualitatiu que quantitatiu. Aquesta diferència tant gran en les concentracions que cal treballar per tal d’obtenir l’efecte inhibitori de la taxa de lipòlisi en funció de si estem treballant amb el hidroxibutirat o l’àcid nicotínic es deu segurament a la seva estructura. Si ens fixem detingudament amb aquesta en la imatge de la introducció podrem observar com la grandària de la molècula i l’extrem carboxílic les fa molt similars de cares al reconeixement per part del receptor PUMA-G. La gran afinitat de l’àcid nicotínic per aquest receptor inhibitori de la lipòlisi l’han convertit en un fàrmac molt efectiu. En general, caldrien més rèpliques de cada mostra ja que si ens fixem en detall amb les dades obtingudes en cada cas podrem observar una gran dispersió entre elles

Bibliografia: Offermanns (2006). The nicotinic acid receptor GPR109A (HM74A or PUMA-G) as a new therapeutic target. TRENDS in Pharmacological Sciences Vol.27 No.7 July 2006

4

- Separació i detecció dels transportadors de glucosa Glut-4 i de la Caveolina 1 en les línies cel·lulars establertes: Fibroblasts 3T3-L1, els adipòcits 3T3-L1 i adipòcits aïllats de rata. Introducció: En aquesta pràctica es pretén detectar la presència de dos proteïnes lligades a la membrana com són els transportadors de glucosa GLUT-4 i la caveolina 1. Les diferents mostres en les quals volem detectar la presència d’aquestes proteïnes són els adipòcits aïllats directament des de la rata i dos línies cel·lulars establertes com són els fibroblasts 3T3 i els adipòcits diferenciats a partir d’aquesta línia. Els mètodes de detecció emprats en aquesta pràctica són diversos i comprenen tincions amb colorants com el Blau Brillant de Coomassie o el Ponseau fins a immunodetecció a través d’anticossos primaris contra les nostres proteïnes d’interès i anticossos secundaris conjugats a enzims que donen productes quimioluminiscents que es poden detectar a través d’una pel·lícula fotogràfica.

Materials i mètodes: Els materials i els mètodes emprats són exactament els que es descriuen en el mateix guió de pràctiques.

Resultats: Primerament, provàrem entre els diferents grups l’eficàcia de gels de poliacrilamida a diferents concentracions per separar proteïnes del pes molecular de les nostres proteïnes d’interès final que són la caveolina 1 i el Glut-4. Aquests foren els resultats de la separació en gel i posterior transferència a través de la tècnica d’electroblotting a una membrana de nitrocel·lulosa de l’albumina i els marcadors dels diferents pesos moleculars.

En aquesta imatge podem observar: carril 1 marcadors dels diferents pesos moleculars, del carril 2 al 8 tenim concentracions decreixents de BSA (10 a 0,1 g) i en el carril 9 fumarasa. 5

Ens entrenàrem també en calcular el pes de les proteïnes a partir de la interpolació de l’Rf d’aquestes en un gel en un diagrama de Ferguson. Les dades de Rf s’obtingueren de mesurar el recorregut de les proteïnes del marcador d’un gel tenyit amb Blau Brillant de Coomassie. Cal destacar que aquest té una molt millor resolució de les proteïnes si el comparem amb la tinció feta anteriorment de Ponseau. Proteïna marcador Miosïna -galactosidasa Albúmina bovina Ovoalbúmina Anhidrasa carbònica Inhibidor tripsina Lisozim Aprotinina Fumarasa PROB: Albúmina

PM (KDa) 194,6 116,5 97,2 50,2 37,6 29,3 20 7,1 60,8 ???

log PM 2,29 2,07 1,99 1,70 1,57 1,47 1,30 0,85 1,78 ???

Cm (4,9 front) 0,5 1,1 1,4 2,7 3,8 4,5 No tenyit No tenyit 2,6 2,5

Rf 0,10 0,22 0,29 0,55 0,77 0,92 0,53 0,51

Diagrama de Ferguson log PM = −0,9575.Rf + 2,3036

DIAGRAMA DE FERGUSON

log PM Album. = −0,9575.

2,5

PM Album. = 65,32 KDa

2 Log P.M.

2,5 + 2,3036 = 1,815 4,9

1,5 1 0,5 0 0

0,2

0,4

0,6 Rf

0,8

1

y = -0,9575x + 2,3036 R2 = 0,9664

Aquest pes aproximat que obtenim a través d’aquest mètode tant simple resulta prou precís si tenim en compte que el pes de l’albúmina esta sobre els 66 KDa.

En aquest primer experiment en que testarem gels amb diferents % de poliacrilamida, observàrem que les proteïnes de pes molecular alt se separen bé en gels de baix %, mentre que si treballem amb proteïnes de baix pes molecular, les separarem bé amb gels de alt % de poliacrilamida. Per tal de separar la caveolina 1 (29KDa) i el Glut-4 (45KDa) ens decantarem per emprar un gel al 12,5% en poliacrilamida.

6

Després d’exercitar-nos en la tècnica de la electroforesi desnaturalitzant (amb SDS, condicions reductores i calor) en un gel de poliacrilamida i de la transferència a membranes de nitrocel·lulosa amb la tècnica de electroblotting, passarem a identificar les nostres proteïnes d’interès en les mostres comentades inicialment. En aquest cas per tal de carregar a cada carril la mateixa quantitat de proteïna total de cada tipus de mostra (adipòcits de rata, línia cel·lular adipòcits i línia cel·lular fibroblasts) realitzarem una recta de patró de Bradfort. En aquest cas tornarem a tenyir un dels gels carregats amb el Blau Brillant de Coomassie. Es pot observar clarament un canvi en el patró de bandes en cadascun dels carrils. Carril 1: Marcador de fumarasa Carrils 2-3: Adipòcits de rata Carrils 4-6: Adipòcits 3T3 Carrils: 7-9: Fibroblasts 3T3 Carril 10: Marcador molecular

Aquí es pot observar el resultat de la immunodetecció amb anticossos primaris contra cadascuna de les dos proteïnes d’interès i un secundari contra el primari i conjugat amb peroxidasa de rave que produeix un producte quimioluminiscent en exposar-la als seus substrats.

Carril 1: Marcador de fumarasa (rotulat) Carrils 2-3: Adipòcits de rata Carrils 4-6: Adipòcits 3T3 Carrils: 7-9: Fibroblasts 3T3 Carril 10: Marcador molecular (Rotulat) * Lògicament els marcadors moleculars i la fumarasa no donen marca.

Posteriorment vàrem intentar analitzar les dades de la immunodetecció a través d’un software d’anàlisi d’imatge. Tanmateix, com es pot veure clarament per la imagte, aquesta pel·lícula es troba sobreexposada i dilucions d’una mateixa mostra no donen les mateixes unitat arbitràries (UA), el que fa que no tingui sentit donar els resultats.

Discussió i conclusions: Poc hi ha per concloure més enllà de constatar la diferent presència de cadascuna de les proteïnes en els diferents tipus cel·lulars analitzats. La caveolina 1 es troba present en totes les mostres mentre que el transportador Glut-4 només es troba en els adipòcits ja provinguin de la rata o de la diferenciació.

7

- Estudi de la lipogènesi en teixit adipós blanc a partir de l’incubació amb glucosa14 C marcada uniformement. Introducció: En aquesta pràctica es pretén observar com la glucosa marcada radioactivament de forma uniforme amb 14C és oxidada cap a CO2 o utilitzada per a la producció de lípids. En aquesta pràctica treballarem amb dos condicions experimentals diferents: incubarem els adipòcits de rata durant una hora amb la glucosa marcada i en presència o absència d’insulina. Amb això veurem quin és l’efecte global a curt termini de la insulina sobre els fluxos d’utilització d’aquesta glucosa marcada a través de la via glucolítica i la lipogènesi. Cal destacar que la pràctica recull els canvi en aquest dos processos a curt termini ja que pel breu temps de la incubació amb insulina no es permet que aquesta generi canvis a nivell transcripcional a partir de la regulació de l’expressió gènica.

Materials i mètodes: Els materials i els mètodes emprats són exactament els que es descriuen en el mateix guió de pràctiques. En aquesta pràctica cal destacar especialment el fet que estem treballant amb material radioactiu i com a tal comporta cert perill, així com també la dificultat per recollir el diòxid de carboni produït a través de la hiamina.

Resultats: Recull de dades de les desintegracions per minut (dpm) de cadascuna de les mostres. Lípids (dpm) Amb Insulina Sense Insulina 11346,1 26079,7 11362,2 13174,1 63548,8 106882 129169 96299,1

CO2 (dpm) Amb Insulina Sense Insulina 12874,6 29493,1 12652,3 14278,9 12811,2 28948,3 12659,1 14086,5

* La gran diferència en les desintegracions per minut entre la primera i la segona mesura en el cas dels lípids són degudes a la gran luminiscència (entre 40 i 92 unitats) que presentaven les mostres degut a la seva manipulació. Mil·ligram de teixit pesats Amb Insulina Sense Insulina 236 (1) 158 (3) 193 (2) 165 (4)

* El fet d’haver pesat un excés de teixit adipós quan en el guió estava indicat uns al voltant d’uns 100mg, tot i que s’hagi tingut en compte en els càlculs, pot haver provocat una deficient difusió de la insulina explicant així la disparitat de resultats obtinguts en mesurar les desintegracions per minut en lípids i en el diòxid de carboni. Factor de conversió per tal de passar de desintegracions per minut a quantitat de glucosa emprada utilitzada pel teixit adipós per tal de ser oxidada o per fer lipogènesi.

X .dpm 1.µ Ci 5.µ mol.glu c 103.nmol . . . .100 mg .txt.vial 2, 22.106 dpm 0,5µ Ci µ mol 8

Lípids (nmols gluc/100mg txt) Amb Insulina Sense Insulina 121 249 367 262

CO2 (nmols gluc/100mg txt) Amb Insulina Sense Insulina 24 68 36 39 24,4 67,5 36 38,4

Recull de les dades de la utilització de la glucosa per tots els grups que vàrem realitzar les pràctiques. Mostres Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Mitjana Desv Std Error Std

Lípids (nmols gluc/100mg txt) Sense Insulina Amb Insulina 123 137 108 117 204 162 271 1311 138 139 297 107 367 1212 262 249 159 125 122 713 102 305 96 392 187 193 90 101 27 35

CO2 (nmols gluc/100mg txt) Sense Insulina Amb Insulina 16 36 10 73 17 24 12 17 15 29 29 26 252 36 39 68 24 38 30 31 17 21 22 18 22 36 9 19 2 6

Les dades en negreta són les que he emprat per tal de representar els resultats en els següents gràfics degut a la seva coherència amb el que ja sabem sobre la insulina. 1

: Aquesta dada és desestimada per la pèrdua de part de la mostra durant la manipulació. : Aquesta dada és desestimada per haver agafat excessiva quantitat de teixit adipós. 3 : Aquesta dada és desestimada per ser exageradament baixa. 2

Lípids (nmols gluc/100mg txt) Sense Insulina Amb Insulina 107 238 12 133

CO2 (nmols gluc/100mg txt) Sense Insulina Amb Insulina 22 44 5 25

Efecte de la insulina en la lipogènesi 400 350 nmols gluc/100mg txt

Dades emprades Mitjana Desv Std

300 250

Sense Insulina

200

Amb Insulina

150 100 50 0 Lípids

9

Efecte de la insulina en la producció de CO2

nmols gluc/100mg txt

80 70 60 50

Sense Insulina

40

Amb Insulina

30 20 10 0 CO2

Discussió i conclusions: En aquesta pràctica podem veure clarament que la insulina com a principal hormona anabòlica fa que s’incrementi per casi el doble la taxa d’oxidació de la glucosa i la de síntesi de lípids. Aquest fet és degut a que la insulina augmenta l’activitat de determinats enzims de les via glucolítica, per exemple a través de la desfosforilació de la piruvat quinasa; així com també s’inhibeix aquells enzims de la via gluconeogènica que tenen un efecte contrari i que poden donar lloc a cicles de substrat. També la insulina a través del seus receptors posa en marxa una cascada de senyals a través de fosforilacions que fan que s’incrementi l’expressió d’alguns gens determinats de la via glucolítica (hexoquinases, PFK-I i II, piruvat quinasa L i A) i de la lipogènica. Tanmateix, aquesta regulació de l’expressió gènica no ha pogut tenir lloc amb una incubació de tant sols una hora. Cal destacar que potser degut a la poca pràctica en aquest mètode ha fet que els resultats de cadascun dels grups siguin molt dispars. Les principals fonts d’error poden haver estat la disparitat de grandària dels fragments de teixit adipós que impedia una difusió correcta i eficient de la insulina que afegíem al medi, així com també alguns errors en l’aplicació del protocol de captura del diòxid de carboni amb els papers sucats amb hiamina.

10