Informe Cinetica Enzimatica

Universidad Católica de la Santísima Concepción Facultad de Medicina / Escuela de Medicina Bioquímica

PRACTICOS Nº03 Y Nº04 Estudio de la Cinética Enzimatica INTEGRANTES Briones

CARRERA SECCIÓN DOCENTES

/Pilar L. Navarrete Yael R. Oñate Antilao María J. Pérez Fernández Carlos F. Pino Contreras / Medicina / Nº2 Dr. Reginaldo Del

Pozo,Ph. D.

FECHA Mayo de 2007

BQ Javier Grandón BQ Mirna Muñoz, M.Sc QA German Rotter / Jueves 24 de

Espacio para la intro y los objetivos… Materiales práctico Nº3//

    

Pipetas de 2, 5 y 10 ml.

  

Puntas para micropipetas

Propipeta 13 Tubos de ensayo. Gradilla. Micropipeta. 5-50µl ; 50-200 µly 200-1000µl Vaso precipitado de 50ml.

      

Vortex Vaso de incubación Cubetas Espectrofotómetro Aparato para incubación?? Soporte universal Toalla absorbente

Cronómetro

Reactivos empleados para la determinación de la actividad enzimática:

• • •

Tampón

: Glicina/NaOH 0.1M (PH 9.4), NaCl 0.1% (p/v)

Sustrato

: β-glicerofosfato de sodio 0.003M

Enzima buffer)

: Fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Merck, 0.005 g/ml

Reactivos empleados para la determinación de fosfato:

• • •

Reactivo Molibdato

: Molibdato de amonio 2.5% en

Solución Reductora aminonaftolsulfónico Solución estándar de fosfato

: Acido 1,2,4-

H2SO4 5N

: Fosfato de sodio 1µmol/ml

Método// Procedimiento actividad practica nº 1: a) Preparar 10 tubos numerados, agregando en cada uno de ellos 2ml. de Agua y 1ml. de Reactivo Molibdato (ácido); el objetivo, es que este medio ácido detenga la reacción enzimática y que el Molibdato reaccione con el fosfato liberado en la reacción dando la coloración azul, para poder cuantificar

b) En forma paralela, se agregan los siguientes componentes en un vaso de incubación:



12 ml del tampón glicina descrito anteriormente

 

12 ml de β-glicerofosfato de sodio

8.5 ml de agua destilada. Ahora, llevar el vaso de incubación al baño de incubación por 6-7 minutos hasta que la solución alcance 37ºC, esto es lo que se denomina Pre-incubación; luego que la solución alcanzó esta temperatura agregar 3.5mlde solución de enzima y agitar suavemente la mezcla. c) Al momento en que la enzima entra en contacto con la solución uno de los integrantes del grupo de trabajo comienza a medir el tiempo con un cronómetro. Simultáneamente se retira una alícuota de 3 ml para ser dispensada en el tubo Nº 1, que contiene molibdato acido y se agita en el vortex (con ello se obtiene el tiempo cero, donde no ha ocurrido la reacción cataliza por la enzima) d) Se debe mantener el vaso de incubación en el baño a 37ºC y repetir el procedimiento, es decir, sucesivamente se deben sustraer 3ml de la mezcla a los 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 y finalmente a los 60 minutos; todos se deben vaciar en sus respectivos tubos y agitar inmediatamente en el vórtex. e) Durante los lapsos de tiempo mas largos que nos quedaban buscamos y elegimos las cubetas (dentro de un rango inferior 0,015) y también preparamos un blanco con 1ml de reactivo de Molibdato y 8,6 de agua destilada; y dos estándar con 1ml de Reactivo de Molibdato, 1ml de solución de sulfato y 7,6 ml. de agua destilada. Homogenizar cada uno de ellos en el vórtex. f) Una vez listos los 10 primeros tubos completar con 3,6 ml de agua destilada cada uno de ellos y agitar en el vórtex. g) Finalmente, cuando esten todos los tubos listos se completan cada uno con 0.4 ml de solución Reductora, incluyendo al blanco y estándar, agitar en el vórtex y mantenerlos 10 minutos a temperatura ambiente. h) Luego de dejar reposar los tubos por aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, se dispensan en cubetas para su lectura en espectrofotómetro a 620 nm de longitud de onda, se observan y se analizan los resultados obtenidos. Tabla Resumen Nº1: muestra las cantidades de reactivos dispensadas para cada tubo.

Componentes Tubos N° Tiempo Incubación (min) Molibdato NH4 (ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

5

10

15

20

25

30

40

50

60

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Agua destilada (ml)

-

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

-

Alícuota incubación (ml) Solución Fosfato Std. (ml) Agua destilada

-

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

1

Solución reductora (ml)

B co.

8.6

3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6

0.4

0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

3. 6 0. 4

Std. x2

3.6 3.6

7.6

0.4 0.4

0.4

Resultados práctico nº3 // Los resultados obtenidos en la lectura con espectrofotómetro de las muestras provenientes de los tubos fueron usados para calcular la concentración del producto formado, teniendo como dato la absorbancia de nuestro estándar, de concentración 1µmol/ml. La lectura de la absorbancia del estándar (preparado en duplicado) fue: Estándar 1  0.329 ; Estándar 2  0.336 El promedio entre estas dos cifras nos da la absorbancia que corresponde a la concentración 1µmol/ml. Como la absorbancia de cada muestra es directamente proporcional a su concentración, se calcularon los valores de concentración correspondientes a cada tubo. Estos valores se ilustran en la siguiente tabla:

Tubo

Tiempo (minutos)

Absorbanci a

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 5 10 15 20 25 30 40 50 60

0.212 0.253 0.291 0.329 0.955 0.393 0.411 0.436 0.466 0.484

Cantidad de producto formado: (µmoles de PO4H-) 0.637 0.760 0.874 0.988 1.066 1.180 1.234 1.309 1.399 1.453

µmoles de PO4Hmenos µmoles de PO4H- a los 0 minutos 0 0.123 0.237 0.351 0.429 0.543 0.597 0.672 0.762 0.816

>>>Cálculo

de la concentración: Se basa en establecer una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración 1µmol/ml  0.333 muestra) × 1 X  (valor de Absorbancia de la muestra) (estándar)

X= (Absorbancia de la 0.333

Cabe destacar que este método de cálculo se emplea en todos los experimentos del presente informe, para obtener la concentración de las muestras (en el práctico nº4 se prepara un nuevo estándar)

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (minutos) 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60

Velocidad de reacción (µmoles PO4H-/5 minutos) ---------0.123 0.114 0.114 0.078 0.114 0.054 0.038 0.045 0.027

Discusión práctico nº3 // La cinética enzimática se preocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, lo que nos proporciona información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de especificidad de la enzima, “fosfatasa alcalina de ternera” utilizada en este práctico. Durante la actividad práctica observamos y cuantificamos la actividad enzimática en relación con la velocidad que tenía la enzima a medida que avanzaba el tiempo de incubación de esta. Para poder cuantificar este cambio en la actividad enzimática a través del tiempo, se midió la cantidad total de producto formado, es decir el “fosfato de sodio” en relación al tiempo transcurrido de haber sido agregada la enzima a la solución con su sustrato β-glicerofostafo de sodio, este producto se pudo medir detectando la presencia de fosfato en la solución ya que este forma un compuesto azulado al unirse al Molibdato y la solución reductora, leyendo su Absorbancia en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 620nm. Recordando de los prácticos anteriores que esta absorbancia es proporcional a la cantidad de fosfato presente en el producto; por lo que a mayor cantidad de fosfato generado por la reacción, mayor absorbancia tendrá la solución.

Reacción catalizada por la enzima Fosfatasa Alcalina de ternera

La medida de la velocidad de reacción se realiza siempre en condiciones óptimas para la enzima fosfatasa alcalina, o sea un pH=7,4 y una temperatura de 37ºC, por lo que fue de mucha importancia la preincubación de la solución; ya que solo después de 6 a 7 minutos en el baño termorregulador, sistema en el que hay agua destilada calibrada que mantiene a la Tº deseada, gracias a un termostato electrónico; comprobando que esta necesita un medio optimo para poder reaccionar y cumplir su función, que es disminuir la energía de activación, por lo que se debe continuar con la incubación, ya que un aumento en la Tº, provoca un aumento de la velocidad de la reacción hasta la Tº optima, ya que después de aproximadamente 45ºC, se comienza a producir desnaturalización térmica de la enzima, ya que esta es una proteína. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas altera su carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie, método utilizado en el practico al incorporar el reactivo Molibdato que llevaba Acido Sulfúrico 5N.,para poder cuantificar. Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos la siguiente gráfica responde a un comportamiento tipico de Michaelis-Menten: Esto se debe a que en un principio la concentración de producto era cero por lo que el equilibrio estaba estaba dezplazado a la formación de estos, por lo que cuando [S] es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S], el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax). Esto se explica ya que en un comienzo todas las enzimas todas las enzimas se encuentran desocupadas listas para formar el complejo enzima sustrato, pero con el pasar del tiempo se encuentran ocupados los sitios activos de estas enzimas, por lo que existe una disminución gradual de la velocidad de reacción, llegando a la saturación, donde hay un equilibrio entre productos y reactantes. Ser rigurosos durante el desarrollo del práctico es importante en aspectos como medir volúmenes exactos, la responsabilidad de integrante que maneja el tiempo, la lectura en el espectrofotómetro; para asi tener datos reales de la actividad de la Fofatasa Alcalina en los determinados gráficos. *****%%Errores de laboratorio se ven reflejados en los gráficos, por: Medición errónea de la alícuota Tiempo de verter alícuotas Medida espectrofotómetro, por una mala calidad de las cubetas Agitación en el vortex Error inherente humano

Tal vez se requiere mas tiempo para ver el punto de equilibrio, pero por razones prácticas no se puede.

Materiales práctico nº4 // Reactivos: * * * * * *

Buffer: Glicina/ Na OH 0.1 (ph: 9,4), NaCl 0,1% (p/v). Sustrato: β- Glicerofosfato de Sodio 6,0 mM. Enzima: Fosfatasa Alcalina de Intestino de Ternera. Reactivo de Molibdato: Molibdato de Amonio 2,5% en H2S045N. Solución reductora: Acido 1, 2,4-aminonaftolsulfónico. Solución Estándar de Fosfato: Fosfato de Na 1μmol/ml.

Implementos: * * * * * * * * * * *

13 tubos de Ensayo. Cubetas para Espectrofotómetro. Espectrofotómetro. Vórtex. Pipetas. Pro pipeta. Baño temorregulado. Gradillas. Micropipeta. Puntas para Micro pipetas. Crónometro.

Método// >>Determinación de la influencia de la concentración de SUSTRATO en la velocidad de reacción de una enzima: El Procedimiento de realizó a partir del siguiente esquema de trabajo:

1º Aplicamos todos los reactivo en orden ascendente. Poniendo particular cuidado en las VARIACIONES de concentración de Sustrato. 2º Preincubacion a 37º en Baño Termorregulado,al igual que en al actividad práctica N°3 3º “PUNTO CRÍTICO” adición de la enzima, mezcla rápida en vórtex, incubación en baño termorregulado a 37º de cada tubo por 10 minutos exactos. 4º “PUNTO CRÍTICO” Cumplidos los 10 minutos exactos en cada tubo se agregó REACTIVO de MOLIBDATO a las soluciones, en este punto se detiene la reacción enzimática, mezcla en Vórtex. 5º Adición de Agua destilada a todos los tubos 3,6 ml. 6º Preparación de solución estándar y Blanco. 7º Adición de de Solución Reductora a todos los tubos, Mezcla en vórtex. 8º Tras un periodo de 10 minutos lectura espectrofotométrica de todas las soluciones a 660 nanometros (nm) de longitud de onda. Durante los lapsos de tiempo más largos que nos quedaban buscamos y elegimos las cubetas para la lectura espectrofotometrica, cuyo material presentaba un mínimo de absorbancia. La solución Blanco y los Standares fueron preparados según el siguiente esquema de trabajo. **las mismas soluciones fueron utilizadas en ambos procedimientos experimentales.

Dato Importante  Importancia de vortereo (uso del Vórtex) Homogenización de

>>Determinación de la influencia de la concentración de ENZIMA en la velocidad de una reacción enzimática: El esquema de trabajo es el siguiente:

1º Adición de todos lo reactivos en orden ascendente ,menos la solución enzimática. 2º Incubación en baño termorregulado 37º. 3º PUNTO CRÍTICO Adición de las DISTINTAS concentraciones de enzima (pipeteamos cada tubo), mezcla rápida en Vórtex, inicio del tiempo cronometrado, incubación en baño Termorregulado 37º por 10 minutos cada tubo. 4º PUNTO CRÍTICO Tras los 10 minutos exactos de incubación de cada tubo adición del Reactivo de Molibdato, con lo cual la reacción es detenida, mezcla en vórtex. 5º Adición de 3,6 ml de agua destilada a todos los tubos, incluidos los estándar y blanco???. 6º Adición de solución reductora, mezcla en vórtex. 7º Tras 10 minutos como mínimo desde el paso previo se realizó la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro.

Todos los valores de Absorbancia medidas en el 2º experimento debieron ser sometidas a un Factor de Corrección de -0,370 otorgado por el Profesor encargado.

Dato Importante  El factor de corrección compensa el retardo de la Enzima, respecto del momento en que es aplicada a la solución, la Fosfatasa Alcalina es una enzima muy eficiente trabaja inmediatamente después de ser aplicada , de ahí que el factor de correción sea tan

Resultados práctico nº3 // Experimento nº1: Usando como referencia la Absorbancia leída del estándar (Estándar nº1 0.384; Estándar nº2 0.381) que en promedio fue de 0.383, se calculo la concentración de producto formado para cada tubo con el método ya mencionado anteriormente. Como transcurrió un tiempo de 10 minutos de reacción para todos los tubos, obtenemos así el valor de la velocidad inicial de reacción medida en µmoles de PO4H- / 10 minutos.

Tubo 1 2 3 4 5

Concentración de β-Glicerofosfato de Sodio (µmoles ) 4 3 2 1 0.5

Absorbancia

Velocidad inicial (µmoles de PO4H/10 minutos)

1.269 1.119 0.809 0.412 0.329

3.313 2.922 2.112 1.076 0.859

Calculo de la Km y Vmax aproximadas

Tubo Nº 1 2 3 4 5

1 . [β-glicerofosfato de sodio] 0.25 0.33 0.50 1.00* 2.00

>>Cálculo de la Km y Vmax exactas

1 . Velocidad Inicial 0.302 0.342 0.473 0.929* 1.164

Mediante la ecuación de la recta obtenida al graficar los recíprocos de la concentración de Sustrato y de la Velocidad inicial, se puede obtener un valor mas exacto de la Km y de la Vmax. La ecuación de la recta de la línea de tendencia de nuestro gráfico es:

y=0.486x + 0.195 En un gráfico de doble recíproco… -1 . = Intersección eje X 2.49 µmoles Km 1 . = Intersección eje y Vmax

-1 . Km

=

-0.195

0.486 1.

Vmax

=

0.195

-1 .

=

-0.401

Km

Km=

-1

.

-0.401

Vmax= 1 . 0.195

5.128 µmoles 10 minutos

Experimento nº2: En esta experiencia, los resultados de Absorbancia fueron arreglados al sumarles un factor de corrección. Luego con el resultado obtenido se calcularon las concentraciones de producto, y en consecuencia, las velocidades de reacción en cada caso. Tubo Nº

1 2 3 4 5

Preparación enzimática: Fosfatasa Alcalina (ml) 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

Absorbancia Absorbancia

+

0.427 0.584 0.748 0.858 0.950

Factor de corrección (-0.370) 0.057 0.214 0.378 0.488 0.580

Velocidad (Vmax) (µmoles PO4H/10 minutos)

0.149 0.559 0.987 1.274 1.514

Discusión práctico nº4 // >>Dadas las características de las reacciones catalizadas por enzimas cuya actividad se ve afectada por varias distintas variables: 1)Ph. 2)Temperatura adecuada. 3)Tiempo de incubación de la reacción. 4)Concentración de la enzima. 5)Concentración de sustrato 6)Presencia de activadores o inhibidores. Buffer: Glicina/ Na OH 0.1 (ph: 9,4), NaCl 0,1% (p/v), otorga el ph adecuado para la fosfatasa alcalina cuyo máximo rendimiento, como su nombre lo indica, se registra en un medio alcalino. Temperatura: 37º otorgada por el baño termorregulado, en su interior incubamos todos los tubos previo y durante la reacción enzimática, asegurándonos de otorgar a la enzima la temperatura óptima de trabajo. Tiempo de incubación: Lo logramos mediante el uso adecuado del Cronómetro. Concentración de Enzima: en el 1º experimento se mantuvo constante pues se quería medir sólo el efecto de la concentración de sustrato en la actividad de la fosfatasa alcalina. Concentración de Sustrato: En el 2º experimento de mantuvo constante pues sólo se quería medir la influencia de las variaciones en la concentración de enzima sobre la actividad de la misma. Presencia de Activadores u Inhibidores: nos aseguramos de que estas variables no existieran al preparar y medir nuestro reactivo blanco y las soluciones estándar. >> Reactivo de Molibdato y su doble función: H2SO4: Solución STOP disminuye el ph (acidifica el medio) de la fosfatasa alcalina y la desnaturaliza deteniendo la actividad enzimática y por consiguiente la reacción. Molibdato de Amonio: se une al Fosfato inorganico liberado por la fosfatasa alcalina a partir del Sustrato: βGlicerofosfato de Sodio 6,0 mM. Solución Reductora: Colorea el complejo formado entre el Fosfato formado y el Molibdato. Esto porque la forma reducida del complejo adquiere una coloracion caracteristica. Los colores mostrados en el círculo de la izquierda corresponden a la gama de colores que pudimos presenciar tras aplicar la solución reductora.

>>De la fosfatasa Alcalina:

Esta enzima hidroliza grupos fosfato de una variedad de moléculas orgánicas. Consiste de dos cadenas de polipéptidos que al plegarse, contiene regiones considerables de estructuras secundarias Alfa y Beta, así como también regiones plegadas sólidamente en forma de espiral aleatoria. ( imagen subunidad de Fosfatasa Alcalina) Esta enzima se encuentra en casi todos los los tejidos del cuerpo (con gran variedad de isoenzimas), pero es mayor su presencia en: Hígado, Vías biliares y Huesos. La cuantificación de la Fosfatasa Alcalina es de particular importancia en distintos exámenes clínicos pues su aumento sumado a otras proteínas como GAMMA GT es indicador de trastornos hepáticos tales como obstrucción de las vías biliares. La Fosfatasa Alcalina se encuentra normalmente aumentada durante el crecimiento de los huesos de niños y adolescentes, su aumento en etapas posteriores es indicador de trastornos óseos. Se ha propuesto como método no invasivo el estudio de “Isoenzimas de la Fosfatsa Alcalina en el suero de pacientes con insuficiencia renal”, en cuyo caso la distribución de las mismas se ve alterada, asociando esto a complicaciones óseas e intestinales asociadas al fallo renal.

Conclusiones

//

Podemos concluir que: La absorbancia de las muestras, está en relación directa con la concentración de fosfato liberado en la reacción, siendo éste el

Un cambio drástico en la variación de pH a la cual trabaje una enzima, es capaz de detener su acción catalítica, y por tal, detener su función, ocasionando un freno en la reacción propiamente tal.

El decremento de la variación de absorbancia entre las muestras en distintos tiempos, está relacionada con la disminución de la velocidad de reacción a medida que se viera manipulada la variable independiente; en este caso, el tiempo de cada muestra para que se llevase a cabo la reacción.

Al ir aumentando la concentración de enzima en la reacción, la velocidad de reacción va aumentando, pues le es más difícil al sustrato poder saturar la cantidad de enzima presente, y por tal, si más sustrato puede reaccionar, ésta concentración de sustrato será directamente proporcional a la velocidad de reacción que dé.

A bajos niveles de concentración de enzima, la reacción es más lenta, porque llega a un punto de saturación más fácilmente, y por tal, la baja concentración de sustrato necesario para alcanzar dicho punto, es proporcional a la baja velocidad resultante en tal reacción.

Mientras mayor sea la concentración de sustrato, más rápida será la reacción, pues la velocidad termina siendo proporcional a la concentración de sustrato, alcanzando el punto de saturación de la enzima, que corresponde al punto óptimo de su trabajo.

A bajas concentraciones de sustrato, la reacción es más lenta, pues la velocidad de reacción, donde sólo el sustrato es la variable, se hace proporcional a éste.