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Universidad Católica de la Santísima Concepción Facultad de Medicina / Escuela de Medicina Bioquímica

PRACTICO Nº06 Glucogenólisis en cortes de Hígado Integrantes

Carrera Sección Docentes

Fecha

/ Pilar L. Navarrete Briones Yael R. Oñate Antilao María J. Pérez Fernández Carlos Pino Contreras / Medicina / Nº2 / Dr. Reginaldo Del Pozo, Ph. D. BQ. Javier Grandon BQ. Mirna Muñoz, M. Sc. QA. German Rotter / Jueves 7 de Junio de 2007

Introducción// El glucógeno es un polisacárido muy importante, es la forma principal de reserva de carbohidratos en los animales, ya que permite almacenar glucosa, para ser utilizada en periodos de déficit: “hipoglicemia”, la cual puede deberse al ayuno o al ejercicio intenso. Es abundante en el hígado y en el músculo, sin embargo debido a su masa mayor, el músculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucógeno que tiene el hígado como reserva. Al compararlo con el almidón, el glucógeno es más ramificado y compacto. La función e importancia del glucógeno muscular es actuar como una fuente de fácil disponibilidad de unidades de hexosa para la glucólisis dentro del propio músculo. El glucógeno hepático sirve en gran parte para exportar unidades de hexosa para la conservación de la glucosa sanguínea, en particular entre comidas. Los animales son capaces de realizar tanto la degradación como la síntesis de glucógeno según las necesidades del organismo. La síntesis de glucógeno denominada la glucogenogénesis, se produce en la mayoría de los tejidos, pero principalmente en el músculo esquelético y en el hígado. Su degradación, para exportar glucosa al resto del cuerpo, la glucogenólisis, se produce cuando las necesidades energéticas de los tejidos demandan glucosa para obtener ATP por la vía glucolítica y contribuyendo así a la mantención de la glicemia. La velocidad de la degradación o síntesis de glucógeno define la concentración de una u otra molécula en un momento dado, ya que ambos fenómenos ocurren de manera casi simultanea en el hepatocito. A su vez, la velocidad de estos fenómenos está definida por la concentración de glucosa en la sangre y la actividad de diversas glándulas endocrinas (páncreas, suprarrenales, hipófisis).

En las células hepáticas, el glucógeno aparece en forma de grandes gránulos, constituidos por agrupaciones de simples moléculas, muy ramificadas, por lo que tiene un peso molecular muy elevado; por lo que para observar estos fenómenos podemos simular las condiciones en las cuales se producen, o sea si introducimos un trozo de hígado a una solución similar al plasma, como lo es la solución de Krebs, simulamos las condición fisiológica de hipoglicemia. El tejido hepático responderá degradando glucógeno a glucosa mediante la glucogenólisis, estas reacciones involucran la participación de enzimas, que pueden actuar como reguladoras del proceso, como en todas las vías metabólicas, ya que no se han modificado sus condiciones. Los métodos espectrofométricos nos serán útiles una vez más para determinar las concentraciones hepáticas tanto de glucógeno como de glucosa. Objetivos // Estudio del proceso de Glucogenolisis y aparición de glucosa en cortes de hígado de rata, incubados en un medio salino apropiado. Determinar cuantitativamente concentraciones de glucógeno y glucosa hepáticas en el hígado de rata Visualizar la relación entre la degradación de glucógeno y la producción y liberación de glucosa.

Materiales// Hígado de ratón

Gradilla

Vidrio reloj

Espectrofotómetro

Balanza

Cubetas

Puntas para micropipetas

Papel Filtro

Embudo

Bagueta

Baño Termorregulado

Cronómetro

Pipeta de vidrio (2ml)

Mortero de cerámica y martillo

Reactivos

Propipeta

Micropipetas (5-50 µl y 200-1000 µl)

Vortex

Tubos de ensayo

•

Solución de Krebs

•

Acido Tricloroacético 5% (TCA)

•

Reactivo de Lugol

•

Kit para determinación enzimática de glucosa (GOD- PAP)

Método// El método a seguir en esta experiencia fue la incubación de trozos de hígado (provenientes de ratas bien alimentadas) a 37ºC en Solución de Krebs durante tiempos predeterminados, luego de los cuales se medirá el contenido de Glucosa liberada al medio extracelular y la cantidad de Glucógeno presente en el tejido analizado. Esto para poder evidenciar que el fenómeno de Glucogenolisis está siendo llevado a cabo por las células hepáticas de nuestras muestras de tejido y que presenta además una evolución en el tiempo. La metodología empleada fue la siguiente: 1. Obtención de la muestra de tejido hepático de ratón. Se sacrificó una rata sana, bien alimentada y que no ha pasado periodos de stress recientemente. Luego de extraerle el hígado a la rata, se cortó el tejido en láminas relativamente delgadas.

2. Preparación de los tubos a incubar

Se pesaron tres trozos de hígado de peso similar (250 mg), los cuales se depositaron en tres tubos de ensayo distintos (rotulados como 0’ – 10’ – 30’). Luego se agregaron 2ml de solución de Krebs a cada tubo. 3. Incubación Los tubos fueron incubados a 37ºC baño Termorregulado, durante 0, minutos respectivamente.

5.

en un 10 y 30

Determinación de la concentración de Glucógeno Se toman las tres muestras de tejido separadas del sobrenadante y a cada una se le agregan 5 ml de solución TCA (cabe destacar que el tubo 0’ no fue incubado, ya que es nuestro tiempo cero por lo que de inmediato se le agrego tal solución), para detener las reacciones enzimáticas de la glucogenolisis y extraer el glucógeno. Como siempre, la mezcla se agita en el vortex. Posteriormente se vació la mezcla sobre un mortero y se trituró el tejido hasta homogenizarlo. Finalmente luego de ser filtrada, la mezcla obtenida correspondiente se emplea para preparar los tubos que serán empleados en la determinación del contenido de glucógeno. Esto se realiza mediante la reacción entre el glucógeno y el reactivo de Lugol, de la que se obtiene una coloración caoba, medible por espectrofotómetro.

Tabla resumen de tubos para determinación de Glucógeno Tubos Filtrado (ml) TCA 5% (ml) Glucógeno (ml) Reactivo de Yodo (ml)

0’ 10’ 30’ Estandar (x2) 0.5 0.5 0.5 ----1.5 1.5 1.5 1.0 ----- ----- ----1.0 0.25 0.25 0.25 0.25

Blanco ----2.0 ----0.25

Una vez preparadas y agitadas las soluciones, se dejan reposar por cinco minutos y luego se leen al espectrofotómetro a 540nm de longitud de onda. 6. Determinación enzimática de Glucosa liberada desde el tejido hepático Con el sobrenadante obtenido anteriormente de cada tubo, se preparan las soluciones con el reactivo enzimático, para obtener un complejo coloreado, el cual de acuerdo a la intensidad del color obtenido, revelara la concentración de Glucosa en la solución. Tubos Sobrenadante (µl) Estándar 20 mg% (µl) Reactivo Enzimático (ml) Agua destilada (µl)

0’ 10’ 30’ Estandar (x2) 100 100 100 --------- ----- ----100 1 1 1 1 ----- ----- -----

-----

Blanco --------1 100

Luego de preparar las soluciones, los tubos deben incubarse por 10 minutos a 37ºC en el baño Termorregulado. Transcurridos los 10 minutos, las muestras se leen al espectrofotómetro a 500nm.

Resultados// Obtención de Glucosa

Blanco 0’ 10’ 30’

mg/ml de glucosa 0 0.06 0.26 0.32

Absorbancia 0 0.162 0.714 0.863

mg/ml

Obtención de Glucosa 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

10

20 tiempo (min)

30

40

Std1 Std2

0.2 0.2

0.549 0.547

Obtención de Glucógeno

Absorbancia 0 1.420 1.361 1.050 0.369 0.365

Obtención de Glucógeno 1,2 1 mg/ml

Blanco 0’ 10’ 30’ Std1 Std2

mg/ml de glucógeno 0 0.97 0.93 0.72 0.25 0.25

0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

10

20

30

40

tiempo (min)

Discusión// Respecto de los procedimientos y reactivos: Puntos críticos del procedimiento: Uso del Vórtex: >> Vorterear vigorosamente en todos los pasos de este experimento tiene como objetivo romper la microestructura del hepatocito, exponiendo su contenido citoplasmático, para así poder medir las concentraciones de glucosa y glucógeno. >>El TCA es utilizado para detener la reacción enzimática. Su efecto especifico es e lataque a las enzimas promotoras de la reacción “glucogenolisis”, denaturandolas y variando el medio al cual ellas trabajan de manera optima, a esto se suma el hecho de que la reacción sea detenida en el tiempo exacto obteniendo solo así es posible obtenre datos fidedignos para cumplir los objetivos planteados. >> Uso del mortero, el objetivo de esta operación es básicamente: liberar el contenido de glucosa al medio, para ser cuantificada (sacrifico de los hepatocitos). >> Nuevamente los métodos espectrofotométricos son el instrumento indispensable que nos permite inferir a través de la medida de la absorbancia la concentración de los analitos de este práctico Glucosa y Glucógeno. Reactivos: >>La solución de Krebs-Henseleit: tiene una composición similar a la del plasma, la osmolaridad, la composición iónica y el valor de pH muy similar, la idea es mantener a los hepatocitos en un medio idóneo para que se siga produciendo los fenómenos de glucogenolisis, una especie de "microengaño celular”. >>La incubación a 37º se suma al objetivo planteado anteriormente. >>Detalle de la composición de la solución en milimoles por litro: NaCl 118.3, KCl 4.8, MgSO4 1.2,

KH2PO4 1.2, CaCl2 2.5, NaHCO3 25.0,

316 mOsm. pH 7.4 Glucosa 11.0

Este (valor glucosa) corresponde al valor estándar de la solución de krebs, el que se modificó en el practico, para así lograr artificialmente una situación de hipoglicemia. “Recordemos que la hipoglicemia es uno de factores que puede promover la glucogenólisis en el hepatocito”. >>Los resultados de la absorbancia nos entregaron que a medida que el tiempo transcurría, la concentración de glucosa iba aumentando, (se visualiza en grafico Glucosa v/s Tiempo), producto de la degradación del glucógeno, por lo cual podemos concluir que el glucógeno es la fuente inmediata de glucosa sanguínea. La degradación de glucógeno se encuentra a cargo de la enzima glucógeno fosforilasa, que al igual que la glucógeno sintasa se encuentra regulada por medio de fosforilación-desfosforilación. Dato interesante Ratas con stress: >>El organismo responde a los periodos de stress liberando diversas Sustancias (hormonas por ejemplo) que permitan la adaptación orgánica a estos periodos de alta demanda energética, este es el caso de la ADRENALINA secretada por la médula suprarrenal ante el stress. La adrenalina promueve el paso de glucógeno hepático a glucosa, para dar abasto a la demanda del momento, si nuestros ratones hubiesen estado estresados (por miedo), la adrenalina se habría encargado de movilizar las reservas de glucógeno hepáticas y nuestro experimento habría sido un fracaso…por falta de reactivos. Factores que promueven al glucogenólisis en el hepatocitoTABLA RESUMEN: Hormona pancreática Glucagón Hipoglicemia Determinación de glucosa: Método GOD-PAD:

Determinación de Glucógeno Hepático: El glucógeno es detectado al reaccionar positivamente con el yodo, el cual en nuestro experimento se encuentra en el reactivo de lugol, esta reacción nos entregará un color caoba. Es precisamente esta propiedad colorimétrica la que nos permite reconocer el glucógeno a traves del método espectrofotométrico

>>Alteraciones en el balance glucogenólisis y gluconeogénesis con importancia clínica:

Las "enfermedades por almacenamiento de glucógeno" son un grupo de trastornos hereditarios que se caracterizan por movilización deficiente del glucógeno y depósito de formas anormales del mismo, conduciendo a debilidad muscular e inclusive muerte.

Conclusión //



En parámetros fisiológicos normales, el hígado es el encargado de mantener los niveles de glucosa en la sangre de acuerdo a los requerimientos de las células. Este proceso es regulado por la actividad de varias hormonas, entre ellas la insulina y el glucagón. Al simular un ambiente hipoglicémico e introducir un trozo de hígado en él, los hepatocitos responden a la falta de glucosa en el medio realizando la glucogenólisis, para aumentar los niveles de glucosa y así suplir la necesidad de energía del medio. De acuerdo a esto, en el experimento los niveles de glucosa irán en aumento y los niveles de glucógeno van en descenso, ya que este se degrada para producir glucosa, como lo indican nuestros gráficos.



La relación glucógeno y glucosa es inversa a medida que disminuye el polímero glucógeno (formado por unidades de D-glucosa) aumenta la concentración de glucosa libre, los valores que obtuvimos se grafican en las curvas de concentración.



Al momento de analizar nuestros gráficos, se presentó la cuestión de que si bien los gráficos reflejan una relación inversa esta no se ajusta a ningún comportamiento matemático específico (relación lineal, exponencial etc...) Respecto de las razones que ideamos para justificar este comportamiento: La relación de GlucógenoGlucosa no es de 1: 1, se debe recordar que el Glucógeno es un polímero. Al momento de triturar en el mortero, tal vez no se logro el objetivo de exponer todo el contenido citoplasmático de los hepatocitos, aunque intentáramos hacerlo bien; dado que la reacción que permite el paso de glucógeno a glucosa ocurre en el citosol, si este no es correctamente expuesto la combinación con los reactivos (colorantes, ácidos que detiene la reacción, etc...) No se logra adecuadamente. Ineficiencias del grupo a la hora de la manipulación de los reactivos. La hipoglicemia es uno de los factores que promueven la glucogenólisis en los hepatocitos, la presencia de la hormona pancreática glucagón o de otros factores estimulantes probablemente habría arrojado resultados más notorios en el tiempo. -Sabemos que el valor de glucosa sanguínea tiene un papel fisiológico preponderante, pues representa el recurso energético principal para poner en marcha todas las maquinarias metabólicas celulares, este experimento nos reafirma su importancia, donde es notable la velocidad con que las células hepáticas responden a las variaciones de glicemia, poniendo en marcha todo un complejo mecanismo de compensación dirigido a movilizar las reservas (ya existentes) de glucosa ………



- Demostramos la importancia vital que posee el hígado en el metabolismo de la glucosa.

La concentración de glucosa obtenida del sobrenadante, va en aumento, debido a que el hígado libera glucosa al medio (Solución de Krebs), por medio de la glucogenolisis, para intentar compensar la deficiencia de glucosa en este. La liberación de glucosa al medio, el los primeros instantes, es muy rápida con una relación prácticamente lineal, como se aprecia en el gráfico Nº 1. La eliminación del extremo no reductor del glucógeno realizado por la glucógeno fosforilaza, es más rápida si el glucógeno se encuentra en un mayor grado de ramificación. Se puede concluir que de acuerdo al gráfico donde se observe una relación lineal o hiperbólica el glucógeno se encontraba más ramificado. 

Bibliografía// GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS, Carrera de Medicina 2007 Universidad Católica de la Santísima Concepción. Dr. Reginaldo del Pozo, Ph.D.; BQ Javier Grandón, BQ Mirna Muñoz, M.Sc.; QA German Rotter.

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