Importante Articulo Cientifico Microbiologia.docx

____________________________________________________________ AISLAMIENTO DE CEPAS DE Rhizobium spp; ASOCIADO A LEGUMINOSA Trifolium repens (TREBOL BLANCO) ISOLATION OF STRAINS OF Rhizobium spp; ASSOCIATED WITH LEGUMINOSA Trifolium repens (WHITE TREBOL) Wendy K. Paredes-Gil, Lina M. Pereira-Ordoñez

RESUMEN El propósito de esta investigación fue aislar cepas nativas de Rhizobium spp; a partir de nódulos de la planta leguminosa trébol blanco (Trifolium repens), extraída de la sede campos Elíseos ubicada en Norte de Santander-los patios, Colombia. Los nódulos obtenidos se llevaron al laboratorio y se sembraron en levadura manitol Agar más azul Bromotimol (YMA+AB) se realizaron repliques en levadura manitol Agar (YMA) con el fin evitar la contaminación de la siembra, se efectuaron pruebas indicativas en YMA+ azul Bromotimol (AB), pruebas de crecimiento en agar LXD, tinciones de Gram, prueba de cetolactosa en levadura lactosa agar (LIA),prueba de movilidad producción de indol y de sulfuro de hidrogeno por el microorganismo en Agar (SIM) , prueba de diferenciación de enterobacterias Agar ( TSI). Se aislaron 5 cepas de (Trifolium repens); se observaron bacilos cortos Gram negativos con reacción acida en el medio (YMA+AB), algunas cepas, no toleran las sales biliares del agar XLD; estos resultados afinan la posibilidad de establecer un estudio que permita evaluar una etapa de invernadero y campo, y el potencial de fijación de nitrógeno y promoción de crecimiento en plantas leguminosas. Palabras Clave: cepas, Rhizobium spp, nódulos, fijación, leguminosas. ABSTRACT The purpose of this investigation was to isolate native strains of Rhizobium spp; from nodules of the white clover legume plant (Trifolium repens), extracted from the Elíseos fields headquarters located in the northern city of Santander-los patios, Colombia. The obtained nodules were taken to the laboratory and mannitol Agar plus blue bromothymol (YMA + AB) yeast were replicated in yeast mannitol agar (YMA) in order to avoid contamination of the planting, indicative tests were carried out in YMA + blue Bromotimol (AB), growth tests on LXD agar, Gram stains, cetolactose test in yeast lactose agar (LIA), mobility test production of indole and hydrogen sulfide by the microorganism in agar (SIM), differentiation test Enterobacteria Agar (TSI). Five strains of (Trifolium repens) were isolated; short Gram negative bacilli with acid reaction in the medium (YMA + AB), some strains, were not tolerated bile salts of XLD agar; these results refine the possibility of establishing a study to evaluate a greenhouse and field stage, and the potential for nitrogen fixation and growth promotion in legume plants.

Keywords: strains, Rhizobium spp, nodules, fixation, legumes.

1. INTRODUCCION El género Rhizobium spp; hace parte del reino de proteobacteria, pertenece al orden Rizhobiaceae y a la subdivisión proteobacteria, los cuales se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico, se asocia simbióticamente con las plantas, específicamente aquellas pertenecientes al grupo de las leguminosas (Las leguminosas se caracterizan por ser fijadoras de Nitrógeno. Esto quiere decir que producen este elemento para su nutrición y proporcionan Nitrógeno al suelo. Para hacerlo, utilizan rizobios (Rhizobium leguminosarum) que son bacterias que forman nódulos en las raíces de las plantas) dentro de este orden también se ubica el género Agrobacterium, una eubacteria Gram negativa aerobia, que se diferencia del genero Rhizobium spp; en que no estimula la formación de nódulos de la raíz ni la fijación de nitrógeno (Atlas & Bartha; kuykendall et all., 2005). Las bacterias pertenecientes al género Rhizobium son bacilos móviles Gram negativos miden de 0.5 a 0.9 por 1.2 a 3.0 um, y a menudo contiene gránulos de Bhidroxibutirato y son pleomorfos en situaciones adversas. Es considerado un habitante prominente de la rizosfera. (kuykendall et all., Ferrera Y Alarcon,2007). Rhizobium spp., infecta nódulos en huéspedes específicos, porque la bacteria contiene un plásmido grande que codifica la información que no se utiliza cuando crece en el suelo como organismo de vida libre, pero por otra parte es vital para infectar a la planta huésped susceptible (Rincón et al., 2000;

Atlas & Bartha, 2005). Es por esto que en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, resulta una interacción muy específica entre la bacteria y la planta. La formación del nódulo es un proceso inducido por un intercambio de señales entre los dos participantes de la interacción; sustancias con efecto nitrógeno (factores de nodulación) son sintetizados por los genes de nodulación del micro simbionte (genes nod), en respuestas a la excreción por la planta de sustancias de tipo flavonoide. Los genes codificados por plásmidos influyen también en la variedad de plantas huéspedes en las que Rhizobium spp., puede formar nódulos (Atlas & Bartha, 2005; Marco et al., 2009). Algunas de las leguminosas capaces de asociarse con Rhizobium spp., son, por ejemplo, judías, tréboles, alfalfa, guisantes, entre otras. Estas plantas poseen en sus raíces pequeños. engrosamientos llamados nódulos que contienen internamente bacteroides o rizobios, conocidos también como organismos infectivos de raíces. Durante esta simbiosis, la planta suministra nutrientes y protección a los rizobios a cambio de nitrógeno atmosférico fijado (Atlas & Bartha, 2005). Las leguminosas revisten especial importancia en la agricultura, debido que contribuyen a aumentar la fertilidad de los suelos a través de la fijación de nitrógeno; se estima que la simbiosis Rhizobium-leguminosa puede fijar de 24 hasta más de 584 kg de nitrógeno/ha y abastecer en algunos casos hasta 90% de las necesidades de las plantas (Ferrera y Alarcón, 2007; Mayz et

al., 2010; Lindström et al., 2010). Para lograr un aislamiento efectivo de cepas nativas de Rhizobium spp., se recomienda realizar extracción directa de los nódulos de las plantas en estudio, ya que se puede obtener un aislado de altas proporciones. Para ello, es necesaria la utilización de medios de cultivos específicos que faciliten la diferenciación bioquímica de las especies de acuerdo con sus componentes (; Kuykendall, 2005; Küçük, Ç. Y M. Kivanç, 2008; Pérez et al., 2008).

2. MATERIALES Y METODOS

Muestreo de nódulos: se realizó en la sede campos Elíseos ubicado en Norte de Santander-los patios, Colombia. Las plantas Trifolium repens (trébol blanco) actualmente se encuentran distribuidas en toda el área del centro; es decir, no existe un cultivo establecido. Prospección de nódulos: Se recolectaron nódulos a partir de trébol blanco durante el mes de abril del año 2018, Se realizó el conteo de nódulos y se evaluó la nodulación según la estructura, la abundancia, el tamaño, el color interno y la nodulación en la raíz principal (Salazar et al., 2001; López, 2005; Martínez, 2005; Westermeyer, 2006). Procesamiento de los nódulos: Los nódulos se desinfectaron por inmersión sucesiva en alcohol al 70% por un minuto e hipoclorito de sodio al 2,5% durante cuatro minutos y posterior enjuague con agua destilada estéril (Matos et al., 2007). Se midió la viabilidad del bacteroides en el nódulo, tomando nódulos al azar, que

luego se seccionaron, y posteriormente se realizó un extendido en fresco sobre placas porta objeto a las cuales se les aplicó tinción de Gram Matos & Zúñiga, 2002; Ferrera & Alarcón, 2007).

Aislamiento primario de Rhizobium spp., a partir de Trifolium repens Los nódulos se seccionaron con un bisturí estéril, luego transferidos a placas con Levadura Manitol Agar con Azul de Bromotimol como indicador (YMA + AB), y se incubaron a 30ºC, por 7 días hasta observar crecimiento abundante alrededor de los nódulos (Mora, 1995; Bécquer et al., 2000; Rincón et al., 2000; Salazar et al., 2001; Matos y Zúñiga, 2002; Jiménez, 2007; Pérez et al., 2008). Para el recuento de las colonias crecidas y para determinar el porcentaje de nódulos obtenidos para cada especie de leguminosa se propuso la siguiente fórmula:

Donde: %R = porcentaje de recuperación NNC= número crecimiento

de

nódulos

con

TNS = total de nódulos sembrados Aislamiento secundario. Se realizó mediante siembra por agotamiento en cajas estériles con YMA + AB a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento

primario, Las cajas fueron incubadas a 30°C por 7 días, se observó el crecimiento, la morfología de las colonias, y de las células por tinción de Gram (Bécquer et al., 2000). Se realizaron observaciones cada dos días repicando las colonias típicas de Rhizobium spp., (Matos et al., 2007). Identificación de las cepas de Rhizobium spp. Se tomaron las colonias obtenidas en el aislamiento secundario. colonias con reacción ácida en el medio de cultivo YMA + AB y morfología bacilar Gram negativa; luego se realizó siembra por agotamiento en cajas con agar YMA sin Azul de Bromotimol y se incubaron a 30°C durante 7 días. Durante este tiempo se estudió las características de las colonias como forma, tamaño, color, textura y la tasa de crecimiento (Pérez et al., 2008). Evaluación del crecimiento de las cepas en Agar XLD: Se tomaron inóculos, realizando siembra por agotamiento en placas con agar XLD (Xilosa Lactosa Desoxicolato) para lograr determinar la especificidad de crecimiento de bacterias Gram negativas. Pruebas Bioquímicas: