Hplc Y Desarrollo 2009

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución 1. Definición 2. Formas de Cromatografía Líquida 3. Instrumentación 4. El cromatograma • componentes • Parámetros de retención, separación, eficiencia

2. Formas de Cromatografía Líquida Líquido - Sólido (Adsorción) Fase Unida Normal Inversa Intercambio Iónico Exclusión molecular Afinidad

Cromatografía de Adsorción •La fase estacionaria es un sólido. •El analito y la fase móvil compiten por los sitios activos de la fase estacionaria

Fases estacionarias: sílica, alumina

Cromatografía de Adsorción

• Sílica y alúmina son las fases más utilizadas • Soluto y solvente son atraídos por los sitios activos de la fase estacionaria • La separación es posible si los solutos tienen diferentes grados de atracción

Partición La separación se basa en la diferencia de afinidad (solubilidad) del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria

KD =

Conc. analito en fase estacionaria Conc. analito en fase móvil

Cromatografía de Partición • Basada en el mismo principio de extracción • Las especies más retenidas son las que tienen mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria • La separación de los solutos está basada en las diferencias de solubilidad

Tipos de fase unida Normal: La fase estacionaria es polar y el solvente es no polar Inversa: Fase estacionaria no polar y solvente polar

Cromatografía de Exclusión molecular La separación se basa en la diferencia en el volumen molecular Partículas más pequeñas son retenidas más tiempo

INTERCAMBIO IÓNICO

+++++++-

Intercambiadores Catiónicos: ácido sulfónico R- SO3-H+ ácido carboxílico R- CO-H+ Aniónicos: sales de amonio cuaternarias R-NH3+OH-

Características de los solventes •No reaccionen químicamente con analito ni la fase estacionaria •Transparente a la región UV visible •Bajas presiones de vapor •No tóxicos •Bajo costo

Clases de solventes

Aceptor de protones

Donador de protones

polares

Solventes comunes en fase reversa •Metanol •acetonitrilo •THF •agua

acido base altamente polar modificador de polaridad Todos poseen: baja viscosidad transparente al UV miscibles disponibles de alta pureza

Ventajas de la elución con gradiente • reducción del tiempo de análisis • mejor resolución • mejora forma del pico

Ventajas de la elución con gradiente • reducción del tiempo de análisis • mejor resolución • mejora forma del pico

Equipo básico HPLC

a.Reservorio y controlador de gradiente b Bomba c Inyector

d Columna e Detector f Registrador

Detectores empleados en HPLC •Indice de Refracción •Ultravioleta - Visible (DAD) •Fluorescencia •Electroquímico •Espectrómetro de masas

El cromatograma tR

1

tR

2

R.D. to

w1 tiempo (

w2 min )

Línea base Tiempo de retención (tR) Tiempo de retención corregido (tR´)

ancho del pico (w) tiempo muerto ( tRo)

OPTIMACIÓN DE PARÁMETROS Retención Separación Resolución Eficiencia:

tR, k´ α R N, H

resolución tR1

tR2

2 (tR2 tR1) R = w1 + w2

R.D. to w1

w2

tiempo (min)

Grado de separación entre dos picos Su valor óptimo es 1,5

resolución R=

k’ k’+ 1

N 4

α

α -1 selectividad

Factor de capacidad numero de platos teóricos

factor de capacidad k’ # de moléculas de soluto en fase estacionaria # de moléculas de soluto en fase móvil

a mayor k’ mayor

k’ =

tR

tR to

factor de capacidad k’ tR R.D.

K’ = tR to

to

tiempo

Para mezclas simples k’ entre 2 y 10 Para mezclas complejas k’ entre 0,5 y 20

Variación de k’ k’

k’ k’+ 1 k’

0 1 2 3 10

k’+ 1 0 0.5 0.67 0.75 0.91

K’ depende de la fuerza de la fase móvil

Número de platos teóricos N Representa la eficiencia de una columna

tR N = 16 w H= L N

2

Número de platos teóricos N N 100 200 400

N 4

2.5 3.5 5.0

Se optimiza modificando: • flujo • longitud de columna • tamaño de partícula

Factor de selectividad tr1

tr2

α =

to w1

α tr2 tr1

w2

selectividad de la fase estacionaria hacia dos solutos

Variación de α Depende de las interacciones entre fase estacionaria-soluto y fase móvil-soluto

Selectividad α α -1

α 1.00 1.05 1.10 1.50

0 0.05 0.09 0.33

Se optimiza: • Cambiando solventes • Optimizando el empaque • Cambiando fase estacionaria

valor óptimo es mayor de 1,2

Desarrollo del Método Selección de Fase Estacionaria

Desarrollo de un método • preparación de la muestra • elección del sistema cromatográfico fase móvil

fase estacionaria

• optimización del método ajuste de parámetros cromatográficos

Selección del solvente Factores a considerar: *Fuerza del solvente: medida relativa de la polaridad (Capacidad para desplazar al soluto) *Escala basada en sílica o alúmina Indice de polaridad: indice de polaridad relativo usado en fase reversa

Fuerza de solvente e índice de polaridad

Clases de solventes

Aceptor de protones

Donador de protones

polares

Ventajas de la elución con gradiente • reducción del tiempo de análisis • mejor resolución • mejora forma del pico

Elución con gradiente Se usa en Intercambio iónico fase unida adsorción *No es posible emplearlo en exclusión molecular

Clasificación de la muestra

• peso molecular • solubilidad • carácter iónico o polar

Desarrollo de un método muestra

objetivos

Sistema preliminar •Preparación de la muestra • Elección del sistema cromatográfico fase móvil fase estacionaria

•Optimización del método

Elección del Sistema Cromatográfico Muestra PM Mayor de 2000 Soluble en agua

Soluble en Solventes orgánicos

Filtración Permeación en gel en gel Exclusión molecular

PM menor de 2000

Muestra PM mayor de 2000

PM menor de 2000 Soluble en solventes orgánicos

Soluble en hexano •Adsorción •Fase Unida Normal

Soluble en metanol •Fase Unida Normal •Fase Unida Reversa

Soluble en Agua

Muestra

PM menor de 2000 Soluble en solventes orgánicos

Soluble en Agua No iónico Fase Unida Reversa

Iónico o ionizable Par iónico Intercambio iónico

resolución R=

k’ k’+ 1

N 4

α

α -1 selectividad

Factor de capacidad numero de platos teóricos

Optimización de parámetros

α

selectividad

k’

factor de capacidad

N

número de platos teóricos

R

resolución

resolución R=

k’ k’+ 1

N 4

α

α -1 selectividad

Factor de capacidad numero de platos teóricos

Optimización en Adsorción y Fase Normal Inyectar muestra. Solvente polar compuestos salen rápido

compuestos salen lento

disminuir polaridad de solvente ajustar k’

cambiar fase

cont….

Cont… ¿k’ = 2 - 10? medir α α es mayor

1.2

α menor a 1.2 cambiar fase móvil usar sílica más activa

optimizar N flujo longitud de columna

Optimización en Fase Reversa Inyectar muestra. 100% metanol compuestos salen rápido adicionar agua ajustar k’

compuestos salen lento cambiar fase continua….

Cont… ¿k’ = 2 - 10? medir α α es mayor

1.2

α menor a 1.2 cambiar fase móvil

optimizar N flujo longitud de columna