Hplc P Brev.docx

(yang ini bahas HPLC) Pengertian HPLC Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. 1. JENIS- JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-

hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat

diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 2. Beberapa kegunaan dari HPLC : ·

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

·

Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

·

Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

·

Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

·

Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

·

Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

·

Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain: ·

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah

yang tinggi. ·

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

·

Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

·

Kolom dapat digunakan kembali.

·

Waktu analisa cukup singkat.

·

HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak

stabil.

·

Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

·

Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain: ·

Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

·

Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

·

Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3

mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga. 2.

Prinsip kerja Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien. Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

Injeksi sampel Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas. Waktu retensi Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut

sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: ·

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

·

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

·

komposisi yang tepat dari pelarut

·

temperatur pada kolom Detektor Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). 1.

Perawatan HPLC Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,

namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik. Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien. ·

Stabilitas pH kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.

·

Teknik Stabilitas Fase

stasioner

didasarkan

pada

silika

stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan

tidak

secara ada

batas

mekanik

sangat

tekanan, dan

dapat

digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran

dalam

kolom,

yang

menghasilkan puncak

membelah pada

kromatogram ·

Eluen Penggunaan

pelarut

murni

non

HPLC

menyebabkan

adsorpsi

ireversibel

dari

kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut. ·

Penyimpanan Kolom 

Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhiranalisis.



Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.



Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.

Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:

(yang ini bahasan tentang epigalokatekin) Teh adalah salah satu jenis minuman yang paling dikenal di dunia. Berbagai penelitian selama dasawarsa terakhir abad 20 ini menunjukkan bukti bahwa teh dapat menjaga kesehatan tubuh manusia. Hasil studi epidemologik menunjukkan bahwa teh dan flavonoid turunan teh dapat menurunkan risiko penyakit kardiovaskuler dan arterosklerosis. Teh juga dapat digunakan sebagai agen pencegah kanker dan hasil penelitian menunjukkan bahwa teh hijau dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolorektal. Berbagai efek menyehatkan dari teh tersebut disebabkan karena kandungan senyawa fi tokimia dalam teh. Senyawa fitokimia yang banyak terkandung di dalam teh adalah katekin. Senyawa turunan katekin terbesar yang terkandung dalam teh adalah epigalokatekin galat (EGCG), yaitu 60-70% dari total katekin. Selain katekin, teh juga mengandung senyawa polifenol lain yaitu asam galat dan juga mengandung kafein. Kandungan senyawa fitokimia tersebut berbeda baik dari segi jenis, komposisi dan kadarnya antara teh hijau dan teh hitam. Struktur kimia Epikatekin, epigalokatekin, asam galat, dan epigalokatekin galat.

Berbagai metode penetapan kadar senyawa turunan katekin dalam teh telah dikembangkan, yaitu senyawa katekin, epikatekin, galokatekin galat, epikatekin galat, dan epigalokatekin

galat. Sedangkan senyawa fitokimia lain yang juga ditetapkan kadarnya adalah kafein dan asam galat. Metode yang dikembangkan adalah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) baik untuk sistem elusi gradien maupun isokratik. Berbagai pelarut fase gerak yang digunakan diantaranya air, asetonitril, metanol, etilasetat, asam asetat, dan asam orto-fosfat. Sedangkan fase diam pada umumnya menggunakan RP C-18 dengan panjang kolom bervariasi antara 12,5 cm dan 25,0 cm. Dari metode yang telah dikembangkan ternyata tidak semua telah dilakukan validasi metode dan memberikan profil kromatogram yang diharapkan. Metode yang dikembangkan Prayong dkk.(2007) belum memiliki profi l kromatogram yang diharapkan (belum ada jaminan nilai plat teori, N), sedangkan metode yang dikembangkan Saito dkk. (2006) sudah memiliki nilai N > 2000 namun belum dilakukan validasi metode. Pada metode yang telah dikembangkan sebelumnya, hampir semuanya melakukan preparasi sampel dengan ekstraksi pelarut. Mengingat bahwa sifat senyawa yang akan dianalisis adalah polar, maka pelarut yang digunakan adalah metanol, atau etanol, ataupun fase geraknya. Sedangkan detektor UV digunakan karena senyawa aktif yang akan dianalisis yaitu asam galat, kafein dan epigalokatekin galat menyerap,radiasi elektromagnetik pada daerah UV, yaitu pada panjang gelombang 210 dan 280 nm. Penggunaan detektor ini juga sangat luas dan banyak digunakan di laboratorium analisis pada umumnya. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mendapatkan metode kromatografi cair kinerja tinggi dengan sistem elusi fase gerak isokratik yang memenuhi parameter validasi meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi. Metode yang telah dioptimasi dan divalidasi akan diaplikasikan untuk menetapkan kadar asam galat, kafein, dan EGCG dalam beberapa produk teh celup (teh hijau dan hitam) yang dijual di Indonesia. Kualitas produk teh dilihat dari kandungan seyawa fitokimianya khususnya asam galat, kafein dan epigalokatekin galat. Dengan menetapkan kadar senyawa tersebut, maka standar kualitas produk dapat dijaga dan ditingkatkan supaya memiliki daya saing.

termasuk superoksida, radikal peroksi, oksigen singlet, dan radikal nitrogen seperti peroksinitrit, dan juga asam hipoklorit (Frei dan Higdon, 2003). Indonesia termasuk dalam 5 negara terbesar pengekspor teh selain India, China, Sri Lanka, dan Kenya. Produksi ekspor teh di Indonesia mencapai 6% dari total ekspor teh dunia. Selain itu, saat ini juga banyak sekali diproduksi minuman teh botol. Bahkan, minuman teh botol ini telah menjadi minuman idola bagi masyarakat Indonesia. Berbagai proses produksi tadi pastilah menghasilkan limbah teh yang cukup besar. Limbah teh tersebut selama ini belum dimanfaatkan secara khusus dan hanya dibuang begitu saja. Termasuk superoksida, radikal peroksi, oksigen singlet, dan radikal nitrogen seperti peroksinitrit, dan juga asam hipoklorit ( Frei dan Higdon, 2003). Indonesia termasuk dalam 5 negara terbesar pengekspor teh selain india, china, sri langka, dan kenya. Produksi ekspor teh indonesia mencapai 6% dari total ekspor teh dunia. Selain itu, saat ini juga banyak sekali diproduksi minuman teh botol. Bahkan, minuman teh botol ini telah menjadi minuman idola bagi masyarakat indonesia. Berbagai proses produksi tadi pastilah menghasilkan limbah teh yang cukup besar. Limbah teh tersebut selama ini belum dimanfaatkan secara khusus dan hanya dibuang begitu saja Sebuah studi di Iran menunjukkan bahwa limbah teh ternyata masih memiliki antioksidan yang tinggi (Daniells, 2005). Hal ini menunjukkan bahwa sebagian senyawa katekin khususnya EGCG dimungkinkan masih terkandung dalam limbah teh. Jika limbah teh ini diekstraksi dengan metoda yang tepat untuk mengekstraksi senyawa EGCG dalam teh dan selanjutnya melakukan purifikasinya, maka peluang untuk dihasilkan produk yang bermanfaat untuk kesehatan dan bernilai ekonomis tinggi sangat terbuka lebar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memisahkan fraksi asam fenolik limbah teh, kemudian mengidentifikasi dan menetapkan kadar EGCG fraksi asam fenolik limbah teh menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). OHOOOOHOHOHOHOHOHOH Gambar 1. Struktur kimia EGCG Metodologi Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel limbah teh berasal dari industri minuman di Jawa Tengah. EGCG (derajat HPLC, minimal 80%), asetonitril, metanol absolut dengan derajat Liquid Chromatography serta asam orto-fosfat 85% (derajat pro-analisis) (Merck), etanol (PA Merck) dan akuabides (Ikhapharmindo Putramas). Ekstraksi dan Fraksinasi Asam Fenolik Limbah Teh (Zadernoskwi dkk., 2002) Sampel yang telah didefatisasi ditimbang sebanyak 50 g. Sampel dimaserasi menggunakan pelarut etanol 50% (v/v) dan diekstrak sebanyak 6 kali masing-masing selama 1

jam sambil digoyang dengan mesin shaker. Campuran disaring dan filtrat dikumpulkan kemudian dipekatkan dengan rotaryevaporator. Ekstrak siap difraksinasi. Ekstrak sampel diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2, kemudian disari 5 kali menggunakan pelarut eter (2:1, v/v) pada suhu kamar. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik bebas (AFB). Fase air diatur pHnya sampai pH 7 dengan NaOH 2 M dan dipekatkan dengan rotaryevaporator. Residu ditambah 20 ml NaOH 4 M dan dialiri gas N2 selama 4 jam pada suhu ruang. Larutan diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2 dan disari dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik teresterifikasi (AFE). Fase air diatur pHnya sampai pH 7 dengan NaOH 2 M dan dipekatkan dengan rotaryevaporator. Residu ditambah HCl 2 M sebanyak 50 ml dan dipanaskan 95о C selama 30 menit. Setelah dingin, filtrat disari dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik glikosida (AFG). Masing-masing fraksi yang diperoleh dilarutkan ke dalam 50 ml NaHCO3 5 % (pH = 8) dan disari 5 kali dengan eter sebanyak 5 kali guna menghilangkan sisa lemak yang tertinggal pada fraksi, dan sari eter dibuang. Fase air diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2 dan disari 5 kali dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Masing-masing residu dilarutkan dengan etanol dan siap dianalisa menggunakan KCKT. Instrumentasi dan Kondisi Operasional KCKT Sistem KCKT terdiri dari HPLC Knauer GmBH-Jerman Model Smart Line Series dengan detektor UV (Smart Line UV Detektor 2500 A 5140), pompa ganda Smart Line Pump 1000 V 7603, sampel injektor dengan volume 20 μL Rheodyne Loop model A135. Kolom yang digunakan adalah Eurosphere C-18 (250 × 4,6 mm i.d., 5μm). KCKT fase terbalik yang digunakan menggunakan sistem elusi fase gerak isokratik yaitu campuran asam orto-fosfat 0,1%, air, asetonitril, metanol (14 : 7 : 3 : 1 v/v/v/v) pada pH = 4,00 dengan kecepatan alir 1,2 mL/min serta dideteksi pada panjang gelombang 280 nm. Hasil dan Pembahasan Ekstraksi dan Purifikasi EGCG Hasil yang diperoleh dalam % yield Data % yield proses fraksinasi proses fraksinasi asam fenolik ekstrak asam fenolik ekstrak limbah teh limbah teh ditunjukkan pada Tabel 1. dibawah ini : Tabel 1.

Berdasarkan hal tersebut maka validasi terhadap metode analisa yang akan digunakan menggunakan peralatan yang ada menjadi sangat penting untuk dilakukan.