Hla Et Transplantation Renale

CHU Abdelkader HASSANI SIDI BEL ABBES

M. Benhalima, Y. Meddour

Introduction (1) rejet de l’organe greffé = Obstacle majeur à la transplantation allogénique

Rejet:

résultat de la réponse immune du receveur à des molécules de surface polymorphes portées par le greffon et différentes de celles du receveur

Ces molécules = Antigènes majeurs de transplantation ou d’histocompatibilité codées par les gènes du complexe majeur d’Histocompatibilité =CMH

Complexe HLA chez l’homme (Human Leucocyte Antigen) J Dausset 1958 décrit le premier Ag sur les leucocytes =Ag Mac (Ag HLA A2 ) suite à la mise en évidence de leucoagglutinines dans le sérum de patients transfusés et de femmes multipares en 1952. Majeur :

-Rapidité du rejet - Forte réponse humorale et cellulaire (production d’Ac et de CTL ) en cas d’incompatibilité HLA entre D et R

Histo : Reconnaissance des molécules du CMH détermine la compatibilité ou l’incompatibilité entre les tissus HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Introduction (2) Autres alloantigènes : •

Antigènes ABO: Exprimés sur l’endothélium vasculaire  forte réponse humorale

•

Antigènes mineurs d’Histocompatibilité  rejet aigu cellulaire

•

Antigènes spécifiques des monocytes et des cellules endothéliales  cibles des Ac préformés ou induit par la greffe.

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Le Complexe HLA chromosome 6

Région I Télomérique : Gènes classe I : classiques A,B,C

Non classiques E,F,G

Région II Centromérique : Gènes DR, DQ, DP Région III Intermédiaire : plusieurs Gènes dont C2 ,C4, TNF Seuls gènes A,B,C ,DR, DQ, DP impliqués dans: le rejet de greffe d’organes ou de tissus la présentation de peptides antigéniques aux lymphocytes T initiant la réponse immune. HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Gènes HLA

Gène A et B codant pour la chaînes α et ß Cellules

Chaîne α

Molécules de Classe II

Molécules de Classe I

Distribution restreinte (CPA)

Distribution ubiquitaire

Ly T

-

++++

Ly B

+++

++++

Ly T activés

++

+++

Plaquettes

-

+++++

++++

++++

+++++

+++++

Monocytes, MΦ Cellules dendritiques

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Gènes HLA classe II  

 

    DP  

 

 

β1    

α1      

   

   

        DP 1à6

 

 

    DQ  

 

 

β1    

   

   

α1  

 

 

        DQ

     

1à9

     

     

     

β1    

β3 β4            

 

     

   

 

Locus DR -DRA non polymorphique : Chaînes α -DRB en nombre variable : DRBI chez tous les individus DRB3, 4 ou 5 variable

         

        DR

   

                 

   

         

β5  

α  

 

 

         

           

   

DR 51

           

           

     

DR 53 DR 52 DR 1 à 18

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Liaison étroite Transmission des gènes HLA en bloc des parents aux enfants (sauf rares recombinaisons ≈ 0,8 à 1%) Père

Mère

A1 B8 DR3 a A3 B7 DR4 b

A29 B44 DR2 c A2 B51 DR5 d

         

 A1 B8 DR3

a A29 B44 DR2 c

A1 B8 DR3 a A2 B51 DR5 d

A3 B7 DR4 b A29 B44 DR2 c

A3 B7 DR4 b A2 B51 DR5 d

 

E1 E5

E2

E3

E4

La probabilité pour deux enfants d’une même fratrie de : - partager deux haplotypes en commun est de 25%

:

- partager 1 haplotype en commun est de 50 %

:

- ne partager aucun haplotype est de 25%   

:

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HLA génoidentique

E1 et E5

HLA haploidentique

E2 et E3

HLA différent

E4

Expression Codominante Chaque enfant hérite des deux haplotypes parentaux dont l’expression est codominante. DR4

DR5

B8

DQ 2 A2

DP1

A

A3 B7 DR 4 DQ2 DP1

B

A2 B8 DR5 DQ3 DP2 DQ3

B7

A3 DP2

 chaque individu exprime 2 molécules A, 2B, 2C, 2 à 4 DR, 2DQ 2DP HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Polymorphisme extrême

100 Antigènes Plus de 1700 allèles

6

9

19

111

59

463

B38(16) B16

B*38 01

splits sérologiques B39(16)

B*39 01

46

10

21

617

179

388

B*38 15 splits alléliques B*39 041

En terme de transplantation ce polymorphisme se traduit par la difficulté à apparier deux individus HLA compatibles en dehors de la fratrie HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Polymorphisme HLA A A1 A2 A3 A23(9) A9 A10 A11 A19 A24(9) A25(10) A26(10) A28 A29 A30 A31 A32 A33 A34(10) A36 A43 A66(10) A68(28) A69(28) A74 A80

B B5 B7 B8 B16 B12 B13 B14 B15 B17 B18 B21 B22 B27 B35 B37 B38(16) B39(16) B40 B41 B42 B44(12) B45(12) B46 B47 B48 B49(21)

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DQ

DR B50(21) B51(5) B52(5) B53 B54(22) B55(22) B56(22) B56(17) B58(17) B59 B60(40) B61(40) B62(15) B63(15) B63(15) B64(14) B65(14) B67 B70 B72(70) B73 B75(15) B76(15) B77(15) B78 B81 B82 B83

DR1 DR2 DR7 DR3 DR4 DR5 DR6 DR8 DR9 DR10 DR11(5) DR12(5) DR13(6) DR14(6) DR17(3) DR18(3) DR15(2) DR16(2)

DQ1 DQ2 DQ7(3) DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(1) DQ8(3) DQ9(3)

ci é Sp

é t i f ic

é s s

r

o ol

g

s e u iq

Molécules HLA  Glycoprotéines membranaires : superfamille des immunoglobulines. Gènes

Molécule Classe I

α1

Molécule Classe II

α2

E2

α1

Gènes

β1 E2

E3

E4

α3

β2m

E3 α3

membrane cytoplasmique Gène A, B, C 8 exons

β2

Gène B Gène A 6 exons 5exons

Polymorphisme chaine Béta ++ DRA monomorphe HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Molécules HLA Structure tridimensionnelle

Domaine α 1 α 2 : cavité du peptide fond: feuillet béta Bord: hélice alpha HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Domaine α1β1 : cavité du peptide fond: feuillet béta Bord: 2 hélices alpha

Fonction des molécules HLA

• Contribution à la réponse immunitaire par la sélection, le transport et la présentation de peptides immunogènes au TCR  trio moléculaire (TCR-Peptide-CMH) impliqué dans la réponse immunitaire

Ly TCD 4

Ly TCD 8

Cα

Cβ

Vα

Vβ

Cα Vα

Cβ Vβ

Peptide du soi

α1

α3

α2

α1

Cβ

Vα

Vβ

Peptide endogène (viral, tumoral)

α1

β1

β2m α2

Cα

α3

β2

α2

Cα

Cβ

Vα

Vβ

α1

β1

α2

β2

β2m

Toutes cellules

Tolérance Le TCR reconnait l’ensemble CMH-Peptide HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

RI : CTL

Peptide éxogène

CPA

RI T helper Ctk + Ac

restriction par CMH

Molécules HLA dans la réponse allogénique Ly TCD 4 Receveur

Ly TCD 8 Receveur

Peptides allogénique + CMH allogénique

Cα

Cβ

Cα

Cβ

Vα

Vβ

Vα

Vβ

α1

α3

α2

α1

β1

α2

β2

β2m

Cellule Dendritique Donneur

Allo-reconnaissance directe

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Peptides allogénique + CMH allogénique

IMPLICATIONS Rôle dans l’immunosurveillance lors -Transformation malignes -Infections Réactions allogénique de rejet en transplantation Lors du rejet les Ag HLA II induisent la réaction immunologique de prolifération d’où l’importance des Ag HLA DR entre D/R. Les Ag HLA I constituent la cible des anticorps anti HLA et des cellules cytotoxiques

La connaissance de l’histocompatibilité entre D/R est primordiale soulignant la place du bilan immunologique dans tout programme de transplantation

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Techniques de typage HLA

DR4

DR5

Sérologique spécificités Microlymphocytotoxicité (LCT)

B8

DQ 2 A2

DP1

A

A3 B7 DR 4 DQ2 DP1

B

A2 B8 DR5 DQ3 DP2 DQ3

A3

Biologie moléculaire : ADN  allèles DP2

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- PCR-SSO (PCR-sequence specific probes) - PCR-SSP (PCR-sequence specific primers) - PCR- SBT (Sequence Based Typing)

TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE La technique de référence : Microlymphocytotoxicité = LCT (Terasaki et Mac Clelland 1964). Détecte des Ac IgG et IgM. trouve son application : Typage HLA de classe I

Typage HLA de classe II

Recherche d’anticorps anti-HLA de classe I

Recherche d’anticorps anti-HLA de classe II

Cross Match anti-classe I

Cross Match anti-classe II

Cellules mononucléaires: CMN Lymphocytes T

Lymphocytes B

Typage HLA: Ag inconnu, Cross Match: Ac inconnus… Les plaquettes, peuvent être utilisées pour l’adsorption des anticorps anti-HLA de classe I.

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LE TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE Principe: Cellule vivante = Réaction négative

+ colorant Batterie d’Anticorps anti-HLA (I, II) connus

Cellules a typer

Complément de lapin Cellule morte = Réaction positive

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TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE Résultat : Score selon l’échelle standard ASHI

“1” Reaction 0–10% Cells

“6” Reaction 51–80% Dead Cells

“2” Reaction 11–20% Dead Cells

“8” Reaction 81–100% Dead Cells

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“4” Reaction 21–50% Dead Cells

L’interprétation du phénotype HLA se fait grâce aux plans de batteries indiquant la localisation et la spécificité des sérums. Le génotype est déterminé à travers l’étude de la famille.

TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE Inconvénients: Non expression des antigènes HLA dans certaines proliférations malignes • Antisérums utilisés reconnaissent des épitopes essentiellement conformationnels privés ou publics • Réactivités croisées sur de nombreuses molécules HLA(CREG) rendent nécessaire l’utilisation de plusieurs sérums monospécifiques • Difficulté d’obtenir des sérums monospécifiques • Rareté de certaines spécificités  Un seul antigène détecté

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Typage HLA par biologie moléculaire Deux niveaux de résolution:

Typage HLA : niveau générique ou basse résolution (2 digits) Donne l’équivalent du résultat obtenu par sérologie. Typage HLA de niveau allélique ou de haute résolution ( 4 digits) détermine les sous variants alléliques HLA B* 27 05 

Motif allélique (BM) Motif générique (Sérologie ou BM) Gène étudié Le typage de niveau générique des gènes HLA –A, B et DRB1 : Suffisant en transplantations d’organes

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TYPAGE HLA PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE La connaissance des séquences spécifiques des allèles HLA permet le génotypage directement au niveau de l’ADN après son amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) La mise en évidence du polymorphisme peut se faire par deux techniques principales : PCR-SSP (Sequence Specific Primer)

: TYPAGE HLA générique et allélique classe I et II

PCR-SSO/SSO reverse (PCR Sequence specific Oligoprobe) : TYPAGE HLA générique classe I et II

PCR SSO/SSO REVERSE Techniques basées sur l’analyse du profil d’hybridation de sondes oligogonucléotidiques spécifiques complémentaires à certains motifs polymorphiques portés par un produit PCR contenant par le ou les exons polymorphique du géne : -exon 2 + 3 typage HLA I -exon 2 typage HLA I Les sondes peuvent être libres dans un tampon d’hybridation et le produit PCR fixé: PCR-SSO Le produit PCR est libre dans le tampon d’hybridation et les sondes fixéés sur un support bandelettes de nitrocellulose/ Billes :PCR SSO reverse HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Technique PCR - SSO reverse Basée sur l’hybridation de sondes spécifiques fixées sur un support solide avec le produit d’amplification marqué : ( Dynal®, LIPA) Avantages : systéme automatisable rapide

ADN pure 100ng/ml

Séquences amplifiées et marquées au cours de la PCR par incorporation de nucléotides biotinylés.

Produit de PCR marqué

Lecture au scanner Numérisation des résultats Interprétation HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

Séquences complémentaires fixées sur des Bandelettes (strip) de Nitrocellulose

Streptavidine marquée à la Phosphatase Alcaline permet la détection colorimétrique (LIPA)

Luminex: Nouvelle technologie de cytométrie de flux = PCR SSO Réverse en milieu liquide Sur chaque type de microsphére est fixé une sonde unique( jusqu’à 100 types de microsphères par puits)

Une amplification réalisée à l’aide d’amorces spécifiques biotinylées

Marquage des fragments fixés sur les billes par la SAPE puis analyse de la fluorescence émise par la phycoérythrine exitée au cytométre de flux

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le produit d’amplification est dénaturé pendant 10 minutes à température ambiante

Le produit d’amplification dénaturé est mis en contact avec le mélange de billes contenant les sondes fixées. Après lavage , seul persistent les fragment hybridés sur leur sonde spécifique

Etapes: La lecture en tubes ou en microplaques de 96 puits La positivité des réactions graduée de 1 à 8 correspond à une fluorescence plus ou moins importante Avantages : Lecture automatisée et adaptée aux grandes séries comme au typage ponctuel Un seul tube ou puits réactionnel par locus On peut tester en même temps dans une seule plaque de 96 puits 32 typages A+ B + ou 24 typages A+B+DR+DQ

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Technique PCR - SSP •

Technique non basée sur l’hybridation d’oligosondes

•

Amorces spécifiques d’un Allèle ou d’un groupe d’Allèles à étudier

•

Discrimination entre les différents allèles pendant la PCR

•

Le typage est déterminé par la présence ou l’absence du produit de PCR visualisé sur gel d’agarose avec Ethidium bromide sous UV

ADN pure 100ng/ml

Placer dans le thermocycleur et couvrir pour éviter l’évaporation

Préparation des mélanges: ADN + amorces + dNTP + Taq polymérase+ Mg Cl2

Photo d’archivage Et Interprétation

Lecture sous lampe à UV

Amplification ≈ 1h40mn

Méthode -simple rapide adaptée à l’urgence -ne détecte pas de nouveaux allèles - inadaptée aux typages en séries HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour

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