Halaman 1.docx

Halaman 1

teknik korelasi secara drastis mengurangi tinggi batas deteksi dalam waktu yang sederhana. Lihat juga: I / Kromatografi. II / Kromatografi: Cair: Teori Kromatografi Cair. Elektroforesis: Elektroforesis kapiler. Bacaan lebih lanjut Engelsma M, Kok WT dan Smit HC (1990) Penentu selektif minasi tingkat jejak fenol dalam air sungai menggunakan modulasi konsentrasi elektrokimia. Jurnal dari Kromatografi 506: 201} 210. Fister JC, Jacobson C dan Ramsey M (1999) sangat sensitif korelasi silang elektroforesis pada microdevices. Ana Kimia litis 71: 4460} 4464. Kaljurand M dan KuKllik E (1989) Terkomputerisasi Banyak Masukan Kromatografi . Chichester: Ellis Horwood. Laeven JM, Smit HC dan Kraak JC (1987) Diferensial korelasi silang kromatografi cair kinerja tinggi phy, metode membangun konsentrasi kecil berbeda ferences dalam sampel asal yang sama. Analytica Chimica Acta 194: 11} 24. Louwerse DJ, Boelens HFM dan Smit HC (1992) Singlekromatografi korelasi sekuens. Sebuah teknologi baru nique untuk mengurangi batas deteksi. Analytica Chimica Kisah 156: 349} 359. Louwerse DJ, Smit HC dan Kaljurand M (1997) Monitorkonsentrasi waktu yang bervariasi dalam sampel aliran oleh kromatografi masukan ganda. Analytica Chimica Acta 346: 285} 297. Mars C dan Smit HC (1990) Pengantar sampel dalam kromatografi hubungan. Aplikasi, properti dan kondisi kerja untuk sistem injeksi baru. Ana lytica Chimica Acta 220: 193} 208. Smit HC, Mars C dan Kraak JC (1986) secara bersamaan kromatografi hubungan, teknik baru diterapkan kalibrasi dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Analytica Chimica Acta 181: 37} 49. van der Moolen JN, Louwerse DJ, Poppe H dan Smit HC (1995). Korelasi elektroforesis zona kapiler, teknik baru untuk mengurangi batas deteksi. Kromatografi , 40: 368. van der Moolen JN, Poppe H dan Smit HC (1997) Perangkat injeksi mikro mesin untuk CZE, Application ke Correlation CZE. Kimia Analitik 69:

4220} 4225. Kromatografi Melawan Waktu dan Kecepatan Tinggi Kromatografi Melawan Waktu: Instrumentasi WD Conway , Sekolah Farmasi, Negara Bagian Universitas New York di Buffalo, Buffalo, NY, USA Hak Cipta ^ 2000 Academic Press pengantar Artikel ini menyajikan gambaran singkat yang paling banyak aspek penting dari sejarah, aparat, teori dan praktek kromatografi arus balik (CCC). CCC terutama merupakan teknik persiapan untuk isolasi dan pemurnian bahan kimia pada satu mili gram ke skala multigram. Ini telah diterapkan secara luas ke produk alami, farmasi dan lainnya bahan kimia organik dan anorganik organik. Apa itu Arus Balik Kromatografi? Kromatografi arus balik dapat secara luas dicirikan sebagai bentuk cair} kromatografi cairphy (LLC) di mana dua imis- yang saling jenuh cairan cawan digunakan. Satu fase dipertahankan dalam kromatografi sebagai kontinyu panjang atau tersegmentasi tempat tidur stasioner tanpa menggunakan matriks absorpsi; fase kedua melewati tempat tidur stasioner dan secara efisien diseimbangkan dengan itu baik dengan hidrodinamik atau turbulen percampuran. Dalam bentuk awal dari cairan} partisi cair kromatografi diperkenalkan oleh Martin dan Synge, di mana satu fase dipertahankan dalam matriks berpori seperti itu sebagai tanah diatom atau selulosa, puncak yang signifikan tailing sering terlihat dan beberapa analit hilang adsorpsi ireversibel pada matriks pendukung. Di CCC, fase diam dipertahankan oleh gravigaya tational, inersia atau kapiler dan adsorpsi dihalangi oleh pembangunan peralatan dari polytetrafluoroethylene (PTFE) atau lembam lainnya, biasanya polimer, material. Jadi analit migrasi di CCC hanya ditentukan oleh koefisien partisi dalam sistem dua fase dan puncak biasanya cukup simetris. CCC berbeda dari distribusi arus balik (CCD) dari jenis yang diperkenalkan oleh Craig pada tahun 1940-an di CCD yang merupakan proses terputus berdasarkan pencapaian-

posisi partisi equilibrium sebelum transfer fase, sedangkan CCC adalah dinamika berkelanjutan atau kondisi mapan proses yang mencirikan semua bentuk chromatography. Baik CCC dan CCD dapat menggunakan yang sama sistem pelarut dan keduanya mencapai pemisahan berdasarkan pada koefisien partisi, tetapi aparaturnya II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu 365 Halaman 2

Gambar 1 Migrasi arus balik cairan tak beragi dalam tabung heliks berputar dengan ujung tertutup. digunakan dan perawatan matematika masing-masing prosesnya sangat berbeda. Istilah CCC diciptakan oleh analogi dengan yang sebelumnya Proses CCD dan dianggap keliru oleh beberapa orang karena, seperti yang biasanya dilakukan, satu fase bersifat stasioner dalam aparatus. Namun, ketentuan tersebut dibenarkan oleh pertimbangan bahwa jika pengamat tinggal di keduanya salah satu fase, tanpa referensi ke stasioner aparat, akan terlihat bahwa fase bergerak masuk mode arus balik. Memang mungkin untuk bisa tually memindahkan kedua fase dalam arah yang berlawanan tetapi itu kemudian perlu untuk merujuk pada proses oleh redundant istilah seperti CCC 'sejati' atau CCC 'ganda'. Aparat Perangkat yang hari ini mungkin disebut berlawanan kromatografi dideskripsikan sedini tahun 1930-an dan digunakan untuk memisahkan zat lipofilik seperti itu sebagai vitamin yang larut dalam minyak. Namun, era modern CCC dimulai pada pertengahan 1960-an ketika Yoichiro Ito obdisajikan jika dua cairan tak bercampur ditempatkan bagian berlawanan dari koil heliks tertutup dan kumparan diputar pada sumbunya, cairan mengalir menjadi satu lain dalam mode berlawanan ( Gambar 1 ). Kapan ditempatkan pada antarmuka awal, komponen individu contoh dari sampel yang dapat larut bermigrasi pada tingkat yang berbeda ditentukan oleh koefisien partisi relatif mereka, K , dalam sistem dua fase. Jika K , misalnya, didefinisikan sebagai konsentrasi dalam fase yang diarsir dibagi dengan centrasi dalam fase tak teduh ditunjukkan pada Gambar 1 maka komponen dengan K lebih tinggi dari kesatuan akan miparut ke kanan, sementara mereka dengan K kurang dari satu akan bermigrasi ke kiri, dan mereka dengan K sama dengan satu

akan berkonsentrasi dalam sebuah band di antarmuka awal. Ito’s aparatus CCC pertama menghasilkan arus balik yang nyata mengalir dan ditunjukkan untuk memisahkan campuran yang larut tures of dyes and proteins in organic} aqueous sistem, dan juga eritrosit sebagai contoh partikulat yang partisi dalam dua fase berair sistem polimer. Ketika ujung kumparan dibuka, sistem menyerupai pompa sekrup Archimedes dan keduanya fase bermigrasi ke arah yang sama menuju apa disebut ujung kepala helix. Arah yang sebenarnya aliran tergantung pada wenangan, kiri atau kanan, dari koil dan arah putarannya, dan akan menjadi menuju sisi kanan dari contoh yang ditunjukkan di Gambar 1. Sekarang, jika salah satu dari fase dipompa ke ujung kanan kumparan berputar pada Gambar 1, menciptakan aliran head-to-tail dari fase gerak, yang fase lain, mencoba mengalir ke arah kepala, akan terhambat oleh kekuatan kental dan sangat stabil ekuilibrium akan terbentuk di mana 40 hingga 60% dari fase yang tidak digantikan akan tetap berada di kolom sebagai fase diam. Komponen intro- sampel dikurangkan sebagai bolus dalam fase gerak akan dipartisi antara fase gerak dan fase diam dan dielusi dari kumparan pada ujung ekor agar koefisien partisi mereka. Proses ini persis analog dengan kromatografi partisi kolom konvensionalgraphy. Seperti dalam bentuk kromatografi lainnya diinginkan untuk menentukan koefisien partisi sebagai K"Cs/Cm dimana C mewakili konsentrasi dalam stasioner (C s) dan mobile (C m) tahap, masing-masing. Kemudian subkuda-kuda dengan koefisien partisi yang lebih tinggi akan kembali lebih lama berada di kolom. Instrumen geometri Ito dan rekan telah menemukan banyak cara kumparan heliks heliks atau heliks dari tabung dapat diputar sehubungan dengan bidang gravitasi dan inersia untuk mencapai retensi yang baik dari fase diam sementara meminimalkan band menyebar dan mempromosikan efisien transfer massa zat terlarut. Beberapa akan dijelaskan di sini berdasarkan signifikansi historis atau praktisnya. Horizontal W ow-melalui koil planet centrifuge The perilaku yang baru saja dijelaskan di 'Aparatur' di atas adalah itu

diproduksi oleh aliran horizontal melalui planet kumparan centrifuge (HFTCPC), pertama kali dijelaskan pada akhir 1970-an. Gerakan khasnya ditampilkan dalam Gambar 2B . Perangkat biasanya terdiri dari beberapa heliks single-layer yang dibentuk oleh berliku PTFE tubing, mengukur diameter internal beberapa milimeter, pada batang sekitar 12 mm diameter dan panjang sekitar 40 cm, dan memasang beberapa di antaranya, terhubung secara seri, di pemegang kolom silinder. Pemegang itu diarahkan untuk putar pada sumbunya sendiri, dua kali di setiap orbit, seperti itu berputar di sekitar poros pusat atau matahari. Pemisahan 366 II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu Halaman 3

Gambar 2 Ilustrasi skematik dari (A) tetesan kromatografi berlawanan arah, (B) horizontal flow-through coil planet centrifuge, (C) multilayer coil planet centrifuge, (D) sentrifugal droplet kromatografi berlawanan atau kromatografi partisi sentrifugal grafik, (E) CCC lintas-sumbu dan (F) kopral lintas-sumbat lateral CCC. biasanya membutuhkan 10 jam atau lebih. HFTCPC tidak sukses komersial pada saat itu, tetapi konfigurasi telah muncul kembali sebagai kolom opsional konfigurasi dalam beberapa kecepatan tinggi yang baru-baru ini dijelaskan Aparat CCC. Kromatografi putaran droplet sebelumnya tahun 1970-an, Ito dan rekannya menggambarkan teknik CCC sentrifugal yang disebut droplet countercursewa kromatografi (DCCC). Seperti yang diilustrasikan Gambar 2A dengan fase berat bergerak, itu terdiri dari sekitar 300 tabung gelas, 1,8 mm, terhubung secara seri dengan tabung PTFE sempit-bore. Entah fase bisa seluler. Tekniknya, bagaimanapun, terbatas pada solsistem ventilasi yang membentuk tetesan. Itu mengandalkan gravitasi untuk pemisahan fase dan sangat lambat, membutuhkan 60 atau lebih banyak jam untuk pemisahan yang khas. Meskipun keterbatasan ini, itu berhasil dipasarkan dan secara luas dipekerjakan oleh ahli kimia produk alami; tekniknya masih tersedia hari ini. Multilayer coil planet centrifuge Kumparan multilayer planet centrifuge (MLCPC) dijelaskan oleh Ito dan colliga pada awal 1980-an adalah salah satu yang paling serbaguna dan instrumen yang banyak digunakan. Versi itu tersedia dapat mendunia dari beberapa perusahaan. Itu ditunjukkan

secara skematik pada Gambar 2C, di mana koil heliks berada terlihat terdiri dari beberapa lapisan luka tubing konsentris pada pemegang kolom, yang lagi berputar dua kali pada porosnya di setiap orbit. The forcefield bertindak pada kumparan sangat berbeda di sini dari itu diperoleh dalam konfigurasi eksentrik (Gambar 2B) baru saja dijelaskan. Jari-jari orbital, R , biasanya sekitar 10 cm dan frekuensi orbital biasanya sekitar 800 rpm. Koil ini terdiri dari sekitar 10 hingga 16 lapisan tubing PTFE, 2} 3mm id, luka di spool 5 cm atau lebih lebar, dimulai dari radius r dari sekitar 5 cm (setengah dari R ) hingga maksimal 8 atau 9 cm. Berliku sebenarnya bukan spiral seperti yang ditunjukkan Gambar 2C, tetapi terdiri dari beberapa back-danlapisan heliks sebagainya biasanya diperoleh dengan cara berliku pipa fleksibel pada spul. Spool selebar 5 cm dan Diameter 17cm mungkin mengandung sekitar 130m dari tubing 1,68 cm dengan id, dengan total volume sekitar 300 mL. The forcefield yang diperoleh dalam MLCPC menghasilkan pola pencampuran unik di mana fase dalam bagian luar kumparan dipisahkan sebagai lapisan tric dari fase bergerak dan fase diam, lapisan yang lebih berat diarahkan ke luar. Di sisi lain tangan, di segmen bagian dalam kumparan, terdiri sekitar sepertiga dari volume kumparan, yang fase cukup kuat dicampur. Campuran dinamis inipola ing tidak bergantung pada aliran fase bergerak tingkat dan karena seluruh gulungan berputar melalui mencampur zona sekitar 13 kali setiap detik, sangat bagus transfer massa terlarut diperoleh. Perpisahan khas diperoleh dari 2 hingga 6 jam dalam gulungan 300 mL dan II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu 367 Halaman 4

pemisahan lebih cepat diperoleh, dengan beberapa kerugian resolusi, dalam gulungan yang lebih kecil. Resolusi digulirkan di MLCPC dengan retensi stasionernya yang sangat tinggi fase, sering 80% dari volume kumparan. Sebuah fea- unik mendatang semua peralatan CCC bergaya Ito dikembangkan sejak itu sekitar tahun 1980 adalah kurangnya segel yang berputar. Karena sistem roda gigi yang digunakan untuk memutar kolom, aliran influen dan efluen membawa cairan dari

instrumen eksterior ke kumparan berputar menggunakan disebut skema antitwisting, yang tidak melibatkan segel berputar, dengan demikian menghindari kebocoran, panas lokaling dan kontaminasi yang terkait dengan segel tersebut. Aparatur tersedia berisi satu, dua atau tiga kelos pada rotor tunggal dan beberapa instrumen beberapa gulungan tersedia dalam satu kumparan tunggal. Ini dapat dioperasikan secara mandiri atau dalam pembuatan seri MLCPC salah satu dari jenis CCC yang paling serbaguna aparat. Kromatografi partisi Certrifugal Salah satunya beberapa jenis instrumentasi CCC modern dikembangkan di luar laboratorium Ito dirancang oleh Murayama dan rekan kerja di Sanki Engineering (Jepang) dan diperkenalkan pada awal 1980-an. Itu ditunjuk simlapis sebagai kromatografi tandingan sentrifugal dan hari ini biasanya disebut sebagai sentrifugal tion chromatograph (CPC). Beberapa hasil kebingungan dari penggunaan akronim BPK karena digunakan secara luas untuk mewakili centrifuge planet koil dalam gaya Ito kromatografi. Secara konseptual tekniknya telah dideskripsikan sebagai tetesan droplet sentrifugal kromatografi (CDCCC, lihat Gambar 2D). Ini dekitab suci didasarkan pada model awal atus, yang terdiri dari serangkaian kartrid fluoroplastic di mana serangkaian silinder dibor bilik dihubungkan oleh alur kecil, supersecara resmi menyerupai DCCC gravitasi yang lebih besar paratus. Kartrid dihubungkan secara seri dan berputar dengan kecepatan tinggi di rotor, yang masuk dan keluar jalur terhubung melalui segel berputar. Aparatus dapat diisi dengan satu fase dan, ketika diputar, fase lain bisa dipompa. Entah itu berat (mode menurun) atau lebih terang (mode naik) fase bisa dipompa melalui. Di versi selanjutnya dari aparatus, bilik dan lorong adalah dibentuk dengan mengetsa mereka di permukaan pasirrerata tumpukan pelat rotor. Meskipun digambarkan sebagai bentuk kromatografi tetesan, droplet yang sebenarnya formasi mungkin tidak memainkan peran utama dalam transfer massa karena banyak sistem pelarut berfungsi dengan baik di BPK yang tidak membentuk tetesan di aplikasi gravitasi ratus. Peralatan kadang-kadang dicirikan sebagai sistem statis, yang bertentangan dengan sistem dinamis, sejak

pencampuran dan transfer massa tergantung pada chamdesain ber dan pada laju aliran fase bergerak; percampuran efisiensi meningkat dengan meningkatnya laju aliran. IklanKeuntungan CPC adalah unit dengan volume sangat besar dapat dibangun karena tidak tunduk pada masalah getaran yang terkait dengan planet koil sentrifugal. Sumbu silang dan kopral CS lateral yang terlantar Sejak sekitar tahun 1989, Ito dan rekannya telah menerbitkan banyak makalah tentang kromatografi digambarkan sebagai sumbu silang, sumbu X atau sumbu silang yang digantikan lateral kromatografi (XL). Sulit untuk mengilustrasikan ini tanpa model tiga dimensi, tetapi sebuah upaya telah dibuat untuk menunjukkan kepada mereka secara skematis Gambar 2E dan F. Pada unit X-axis, sumbu kumparan adalah cukup dimiringkan 903, atau dilintasi terhadap matahari sumbu. Di unit CCC sebelumnya (Gambar 2B dan C), sumbu ini paralel. Di unit XL, kumparan adalah semakin mengasingkan jarak L di sepanjang planet ini sumbu dari posisi X pusat , di mana surya Sumbu terletak pada bidang rotasi kumparan. Efek memiringkan kumparan adalah untuk memperkenalkan ketiga komponen dimensi ke medan perang. Dalam paralunit lel shaft (Gambar 2B dan C), vektor forcefield semua terletak pada bidang rotasi dua dimensi gulungan. Tapi perpindahan X dan XL diperkenalkan vektor gaya dalam bidang sumbu vertikal atau matahari. Ini perubahan memiliki efek yang signifikan dalam meningkatkan fase mencampur fenomena dan efisiensi kolom. Ini adalah sangat penting untuk sistem pelarut kental seperti sistem polimer dua fase berair dari polietilena glikol-garam dan polietilen glikoltipe dekstran. Sistem ini berfungsi buruk di HFTCPC dan bahkan kurang baik dalam sistem MLCPC. Sistem polimer dua fase berair adalah pentingtant untuk pemisahan protein, enzim dan bio partikulat logis. Sayangnya, X dan XL kromatografi secara mekanik lebih kompleks dari instrumen sebelumnya dan belum komertersedia secara cial. Pengawas Banyak teknisi CCC hanya mengumpulkan pecahan dan pantau komposisi mereka dengan kromatografi lapis tipisgraphy (TLC). Limbah kolom sering bisa

terus dipantau oleh spektra absorpsi UV fotometri. Interferensi utama dengan pemantauan adalah kecenderungan tetesan mobil fase diammasuk ke dalam sel aliran untuk menyebabkan lonjakan atau suara mematuhi jendela sel. Masalahnya adalah minidikawinkan dengan menggunakan sel aliran dengan jalur aliran vertikal dan dengan mengalirkan fase gerak yang lebih ringan di bawah arah lingkungan, dan fase gerak yang lebih berat di arah ke atas. Ini cenderung menyiram tetesan fase diam melalui sel dengan cepat. Lain metode yang digunakan termasuk pemanasan limbah kolom 368 II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu Halaman 5

Gambar 3 Sebuah kromatogram berlawanan arah umum untuk zat terlarut dengan koefisien partisi, K, dari 0, 1, 2 dan 3. tepat sebelum memasuki sel monitor, atau berdarah aliran pelarut yang dapat dicampur, seperti metanol, ke dalam efluen kolom. Pendekatan lain menggunakan dioda detektor array untuk memonitor kebisingan droplet di suatu area spektrum di mana analit tidak menyerap, seperti wilayah terlihat, dan mengurangi kebisingan, on line, dari absorbansi pada panjang gelombang yang digunakan untuk pemantauan. Fluoresensi dapat digunakan untuk monitoring dan menyajikan masalah serupa untuk absorptiometry. Detektor hamburan cahaya evaporatif sangat baik untuk memantau senyawa yang tidak memiliki kromofor dan bekerja dengan senyawa lain juga. Bergejolak pelarut yang digunakan di CCC cukup kompatibel dengan hamburan cahaya evaporatif selama tidak ada yang tidak mudah menguap konstituen seperti garam atau buffer dimasukkan ke dalam sistem pelarut. Beberapa publikasi memiliki peared menghubungkan CCC dengan spektrometri massa dan dengan resonansi magnetik nuklir (NMR). Teori Kromatografi lawan arus (CCC) biasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisi kolom saat istirahat dengan stasioner fase, kemudian mulai rotasi dan memompa di fase gerak pada laju alir konstan. Sampel mungkin diperkenalkan di kepala aliran fase seluler atau nanti. Saat ia membuat umpan pertamanya melalui kumparan, aliran fase gerak akan menggantikan volume, V CO, fase diam, yang akan dibawa ke dalam

kapal pengumpul. Selanjutnya, volume-fase rasio dalam kolom biasanya stabil. Carryover ini volume kemudian merupakan ukuran volume fase gerak V m dan volume fase diam, V s, dapat estidikawinkan dengan mengurangkan V CO dari kolom dikenal volume V C : V s " V C ! V m " V C ! V CO Mengukur waktu retensi dari zat terlarut yang tidak terkandung menyediakan sarana alternatif untuk memperkirakan V m. Karena V s dikenal di CCC, kromatogram dapat dijelaskan secara menguntungkan dalam kaitannya dengan koefisien partisi centration K (didefinisikan sebelumnya sebagai K " C s / C m" dari analit, daripada kuantitas koefisien distribusi atau faktor retensi, k , digunakan dalam bentuk kromatografi lainnya. Kromatogram lawan arus dapat berhasil. serasa dirasakan secara visual dalam hal K dan fakta bahwa analit dengan K "1 akan selalu terelusi dengan volume retensi sama dengan volume kolom, V C. Volume kolom, atau waktu yang sesuai dengannya, adalah titik fokus dari chromato countercurrent gram dan munculnya K "1 pada titik ini independen dari rasio volume fase. Tentu saja, analit dengan K "0 tidak akan dipertahankan dan akan muncul dengan fase gerak depan. Analit lainnya dengan nilai integral K akan mengelusi beberapa kali volume fase stasioner, atau waktu, di luar K "1 dan posisi nilai antara dapat ditentukan dengan interpolasi linier. Oleh karena itu, Gambar 3 disajikan gambaran umum tentang arus balik kromatogram analit dengan K "0, 1, 2, 3 dan itu jelas bahwa pola elusi digambarkan oleh persamaan: V R " V m # KV s dimana V R adalah volume retensi analit. Karena laju aliran biasanya konstan, skala waktu bisa ditambahkan atau dibayangkan. Misalnya jika Gambar 3 adalah diperoleh dengan kolom 300 mL pada laju alir 3 mL per menit, K "1 akan muncul pada 100 menit dan K "0 pada sekitar 30 menit. V s kemudian sesuai dengan 70 menit dan K "3 muncul sekitar 240 menit. An analit dengan K "1.5 bisa diharapkan muncul sekitar 135 menit. Contoh yang menunjukkan pemisahan dari serangkaian fenilalkanol ditunjukkan pada Gambar 4 .

Pemisahan senyawa terkait eratlitaxel dan cephalomanine dengan bentuk daur ulang CCC ditunjukkan pada Gambar 5 . Dalam pendekatan ini, puncaknya mengandung campuran dipisahkan dari mantan materi yang semula di siklus pertama melalui CCC dengan mengocok limbah yang terkandung dalam sebuah palka tabung tubing diameter yang sama yang digunakan dalam CCC kolom. The shunt kemudian dihubungkan kembali ke CCC inlet dan bahan dikromatografi sedetik waktu, dan proses shunting kembali diulang dapatkan pemisahan yang ditunjukkan pada Gambar 5. II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu 369 Halaman 6

Gambar 4 pemisahan CCC dari campuran 10 L masing-masing benzil alkohol, 2feniletanol dan 3-fenilpropanol pada kumparan 24-m dari 1.68-mm PTFE, volume 56 ml menggunakan heptana sebagai fase diam dan fase gerak 25% 2-propanol dalam air yang mengalir pada 4 mL min \ . Direproduksi dari Conway WD, Buchert EL, Sarlo AM dan Chan CW (1998) dengan izin dari Marcel Dekker. Gambar 5 Pemisahan paclitaxel (1) dan cephalomanine (2) dengan mendaur ulang CCC menggunakan sistem pelarut heksana / etil acetate / metanol / air} 6: 4: 5: 5 (v / v / v / v) dan kolom 230 mL dari PTFE 1,6 mm dengan fase air bergerak mengalir pada 1,7 mL min \ . Direproduksi dari Du QZ, Ke CQ dan Ito Y (1998) dengan izin dari Marcel Dekker. Resolusi Pengaruh V s resolusi analit juga jelas dari Gambar 3. parameter Eksperimental yang mengubah V s, seperti laju aliran atau kecepatan rotasi, tidak akan mempengaruhi K "1 poin. Tapi seperti laju aliran meningkat, lebih fase diam akan dibawa dan V m disdikan akan meningkatkan ke arah kanan, penurunan V s. Jarak V s melampaui K "1 akan bergerak ke kiri, sehingga mengurangi resolusi antara puncak. Di kasus ekstrim laju aliran tinggi, semua stasioner fase akan dipaksa dari kolom dan semua puncak akan berkumpul dan dielusi di kolom volume, atau K "1 poin, yang menekankan pentingnya kolom volume atau K "1 poin dalam arus berlawanan kromatogram. Pengukuran langsung dari resolusi, R s, dua puncak pada kromatogram didasarkan pada definisi: 1

1

Rs" V2!V1 0,5 ( W 2 # W 1 ) 370 II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu Halaman 7

di mana V 2 dan V 1 adalah volume retensi Puncak kedua dan pertama muncul dan W 2 dan W 1 adalah lebar basis 4-sigma mereka diukur dalam satuan yang sama sebagai V 2 dan V 1 . Dengan definisi ini, nilai R adalah 1,5 merupakan resolusi dasar. Kontribusi faktor-faktor lain untuk resolusi dalam CCC dirangkum dalam umum berikut persamaan resolusi: R s "0,25 (! 1) N 0,5 K1 0,5 K 1 (# 1) # (1! S F ) / S F dimana K 1 adalah koefisien partisi dari yang pertama sepasang puncak kromatografi muncul dan, N dan S F adalah faktor pemisahan, kolom atau kumparan efisiensi, dan fraksi volume kolom ditempati oleh fase stasioner, masing-masing. Faktor pemisahan didefinisikan sebagai: "K2/K1 dimana K 2 adalah koefisien partisi yang kedua puncak pasangan muncul dan selalu dihitung lebih besar dari 1. Efisiensi dalam lempeng teoritis didefinisikan dalam istilah lebar dasar puncak sebagai: N "16 VR W1 2 dimana W 1 adalah lebar dasar 4-sigma dari puncak dan diukur dalam satuan yang sama dengan V R. S F , fraksi fase stasioner adalah: SF"Vs/VC dan ekspresinya dalam denominator dari resolupersamaan tion dilihat untuk mewakili volume-fase perbandingan: (1! S F ) / S F " V m / V s Persamaan resolusi menegaskan visual observation dari Gambar 3 bahwa peningkatan V s akan meningkat

resolusi. Tiga istilah dalam persamaan resolusi adalah sekutu disebut istilah faktor pemisahan, efisiensi istilah dan istilah besar dalam tanda kurung adalah partisi istilah koefisien. Masing-masing dapat dievaluasi secara independen dari kromatogram arus balik. Istilah Istilah faktor pemisahan bergantung pada selektivitas sistem pelarut untuk satu analit dibandingkan yang lain. Seringkali istilah dominan memimpin untuk pemisahan tetapi tidak dapat diprediksi dan harus ditentukan oleh pemeriksaan empiris berbagai sistem pelarut. Pencarian paling baik dilakukan oleh alat non-CCC untuk mengukur koefisien partisi, seperti kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) atau TLC atau dengan menggunakan CCC-volume kecil umns. Keuntungan dari CCC adalah yang sangat besar jumlah sistem pelarut tersedia. The ef V siensi Istilah akar kuadrat ketergantungan N menunjukkan bahwa diperlukan resolusi dua kali lipat peningkatan empat kali lipat dalam panjang kolom, yang sering tidak praktis karena peningkatan yang dihasilkan backpressure dan waktu pemisahan. CCC menyediakan hanya sejumlah kecil pelat teoritis, biasanya dalam kisaran 300 hingga 1000, kecuali colour-bore col umns digunakan pada laju alir rendah. Itu sebanding untuk kromatografi flash-kolom dalam hal N. Bagaimanapernah, resolusi dalam CCC sering jauh lebih baik dari karena itu mungkin diharapkan karena adanya kontribusi yang lebih besar dan karena sangat tinggi S F , biasanya 0,7 atau lebih, diperoleh dengan beberapa pelarut sistem. Partisi coef Vientity istilah Mengubah polarsistem pelarut untuk meningkatkan K 1 akan meningkat resolusi, tetapi manfaat cepat berkurang sebagai K 1 meningkat. Besarnya efek tergantung pada S F , tetapi ketika S F adalah 0,4, 80% dari efek peningkatan K 1 akan diperoleh ketika K 1 mencapai sekitar 4, pada waktu retensi yang akan cukup panjang, khususnya untuk K 2 . Jika S F adalah 0,8, 80% dari efek peningkatan K akan diperoleh ketika K 1 kira-kira 1, jadi lebih praktis untuk atur kondisi sehingga S F setinggi mungkin dan kemudian sesuaikan K dari komponen yang diinginkan ke kisaran sekitar 1 hingga 2.

Sistem Solvent Sistem pelarut dua fase yang sangat luas bisa digunakan di CCC. Ini termasuk fase berair dengan pelarut berkisar dalam polaritas dari heksana melalui kloroform, etil asetat dan n-butanol. Partisi Koefisien dapat dimodifikasi dengan mencampur organik pelarut dengan satu sama lain atau dengan menambahkan suatu yang dapat dicampur pelarut seperti metanol, 2-propanol atau asetonitril ke sistem. Sementara ini larut terutama di fase berair, mereka sebagian larut dalam fase organik, membuat sistem lebih beragam dan menggeser koefisien partisi analit ke arah 1. Ketika sistem menjadi terlalu campur, stasioner fase kurang dipertahankan. Contohnya adalah 2-butanol, yang ketika jenuh mengandung sekitar 40% air berat. Beberapa sistem pelarut yang telah diperluas Sively bekerja di CCC diberikan pada Tabel 1 . II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu 371 Halaman 8

Tabel 1 Sistem pelarut perwakilan untuk CCC 1. Hexane / ethyl acetate / methanol / water} 3: 7: 5: 5 (v / v / v / v) 2. Chloroform / methanol / water} 7: 13: 8 (v / v / v) 3. Chloroform / methanol / water} 4: 4: 3 (v / v / v) 4. Chloroform / methanol / water} 5: 5: 3 (v / v / v) 5. Hexane / methanol} rasio apa pun 6. Hexane / asetonitril} rasio apa pun 7. n-Butanol / air} rasio apa pun Sistem pertama yang diberikan pada Tabel 1 berguna untuk bahan lipofilik; sistem kloroform luas ly digunakan untuk zat terlarut dari polaritas menengah dan n-butanol / air adalah salah satu sistem yang paling polar tersedia. Sistem 5 dan 6 (Tabel 1) tidak berair sistem dan sangat berguna untuk sangat lipofilik bahan tanpa kelarutan dalam air. Sebelum digunakan di CCC, sistem pelarut selalu terguncang corong pisah dan dibiarkan terpisah untuk memastikan saturasi timbal balik dari dua fase. Sistem pelarut dicakup secara luas di semua karya referensi terdaftar di Bacaan Lebih Lanjut dan hanya dibahas di sini sangat singkat. Sistem pelarut skrining

Untuk menggunakan CCC dengan sukses perlu untuk secara empiris mencari sistem pelarut yang sesuai menggunakan non-CCC metode awalnya. Tujuan pertama adalah menemukan sistem itu menyediakan K 1 hingga 2 dan yang menyediakan sampel yang baik kelarutan dalam kedua fase . Poin terakhir ini pentingkarena kapasitas sampel akan dibatasi oleh fase di mana sampel paling tidak larut. Dua ap proksi untuk menyaring nilai K akan dijelaskan di sini secara singkat. Menggunakan TLC Persiapkan sejumlah kecil usulan sistem pelarut bi-phasic dan partisi beberapa sampel antara sekitar 200 L setiap fase. Spot 20 L dari masing-masing fase berdampingan di atas pelat TLC dan kembangkan dengan sistem TLC yang sesuai. Visual pemeriksaan, atau lebih baik, pemindaian dengan TLC densitometer, dari tempat terpisah untuk keduanya fase akan memungkinkan penilaian dibuat komponen mana yang memiliki nilai K di negara tetangga bourhood dari 1. Menggunakan HPLC Melarutkan sejumlah kecil sampel dalam sekitar 500 L fase berair. Kromatografi 20 L dalam sistem HPLC yang sesuai. Kemudian setimbang larutan berair dengan volume non- yang sama fase berair, buang ekstrak yang tidak berair dan lagi kromatografi 20 L dari fase berair. Dari ketinggian puncak masing-masing, partisi coeffiKlien dalam sistem pelarut CCC dapat dihitung. Karena retensi CCC hanya bergantung pada K , menggunakan persamaan untuk V 0 , atau hanya mengacu pada Gambar 3, yang waktu retensi yang diharapkan dari komponen sampel dapat dihitung. Pendekatan Kromatografi Lainnya Zat dengan nilai K tinggi yang tidak terelusi, akan sampai batas tertentu dipisahkan sepanjang kolom dan dapat dipulihkan dengan menghentikan aparatus dan memompa keluar isi kolom. Pendekatan alternatif adalah untuk beralih fase tanpa menghentikan chromatography. Di MLCPC, arah yang tepat untuk memompa fase adalah kepala ke ekor untuk fase berat dan ekor untuk menuju fase lebih ringan, jadi pendekatan ini melibatkan berpindah saluran kolom juga. Untuk CDCCC, arah yang terkait menurun

untuk fase berat dan ke atas untuk fase yang lebih ringan. Namun pendekatan lain untuk memanipulasi CCC adalah untuk mengisi kolom awalnya dengan rasio non-ekuilibrium volume fase dengan secara bersamaan mengisi keduanya fase sekaligus. Retensi dari nilai K tertentu bisa ditingkatkan atau dikurangi dengan memilih yang sesuai makan rasio fase-volume. Gradien juga bisa digunakan untuk sejumlah sistem, terutama jika posisi fase diam berubah sangat sedikit polaritas fase gerak diubah. Untuk zat asam dan basa, pengaturan pH atau penggunaan gradien pH dapat bermanfaat. Kisaran dari pH tidak terbatas sejauh aparatusnya prihatin. Formasi pasangan ion dan penggunaan ion cair penukar juga dapat dieksploitasi, dan berbagai chelating agen telah digunakan untuk pemisahan logam, khususnya tanah jarang. Resolusi optik telah dicapai dengan penambahan pemilih kiral sebagian besar larut dalam salah satu fase ke sistem pelarut. Contoh di atas menunjukkan beberapa dari banyak cara-cara di mana aparat CCC dapat dimanipulasi mencapai perpisahan dengan cara selain langsung-kromatografi lingkungan. pH-Zone Re fi ning Teknik CCC pengumpul zona-pH utamanya dikembangkan oleh Weisz dan Scher bekerjasama dengan Ito, pantas mendapat perhatian khusus karena unik CCC. Ini berlaku untuk asam dan basa organik dan jelas teknik pilihan untuk mendapatkan yang sangat tinggi pewarna murni dan sampel dari kotoran yang terkandung di dalamnya. Untuk penjelasan yang sangat singkat itu mudah untuk dilihat teknik sebagai semacam asam dua fase} titra- basis dasar tion dilakukan di kolom CCC. Untuk mengilustrasikan ini, bayangkan serangkaian asam karboksilat aromatik itu 372 II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu Halaman 9

Gambar 6 Pemisahan asam 2- dan 6-nitro-4-kloro-3-metoksibenzoat oleh CCC pengikatan zona pH. Fase diam awal adalah 0,3% (12 mM) asam trifluoroasetat dalam fase organik atas campuran metil t-butil eter / asetonitril / air} 4: 1: 5 (v / v / v). Itu

fase gerak adalah 0,8% (100 mM) amonia dalam fase berair rendah dipompa pada 3 mL menit \ . Volume kolom adalah 310 mL. Direproduksi dari Dudding T, Mekonnen B, Ito Y dan Ziffer H (1998) dengan izin dari Marcel Dekker. sedikit berbeda dalam p K a serta lipofilisitas. Khas sistem pelarut sederhana seperti metil t-butil eter (MTBE) dan air saling jenuh dan fase dimasukkan ke dalam wadah terpisah. Fase organik diasamkan dengan asam trifluoroasetat (TFA) dan kolom diisi dengan itu sebagai fase diam. Di latihan, baik fase dapat berfungsi sebagai stasioner fase tetapi fase organik dipilih dalam contoh ini. Sampel asam campuran dilarutkan, atau ditunda jika tidak larut sepenuhnya, dalam bagian yang diasamkan fase diam dan diperkenalkan pada inlet kolom. Fase berair dibuat dasar dengan amonia dan dipompa ke kolom berputar. Yang diasamkan sampel akan larut dalam zona yang relatif kecil diasamkan MTBE pada inlet kolom dan sebagai dasar fase air aktif diperkenalkan akan menetralkan bagian dari sampel, yang kemudian akan diekstraksi ke dalam fase berair. Namun, saat bergerak turun kolom, zona akan menghadapi lebih banyak TFA, menjalani re-asidifikasi dan kembali ditransfer ke fase organik stasioner. Netralisasi ini dan Transfer akan dilanjutkan, seperti pada titrasi, pertama dengan asam termurah p K a , dimodifikasi juga dengan lipophilicity yang asam tertentu, mereka yang termurah p K a dan lipofilisitas terendah bermigrasi tercepat. Memantau eluen dengan penyerapan UV biasanya tidak informatif, tetapi memantau pertunjukan pH serangkaian langkah luas untuk meningkatkan pH sampel yang sangat murni dari asam individu dengan kotoran terkonsentrasi pada antarmuka antara zona. Basis dapat dipisahkan dengan cara yang sama. Teknik ini menyediakan beberapa kapasitas sampel gram. Contoh yang menunjukkan pemisahan dua asam nitrochloromethoxybenzoic isomer oleh pHpemurnian zona disajikan pada Gambar 6 . Memantau Absorbsi UV dari efluen hanya menghasilkan jejak yang datar, yang tidak menunjukkan pemisahan. Namun, itu pH efluen menunjukkan langkah-langkah yang tajam pada awal dan akhir zona komponen. Menggunakan 310 mL-kolom dan 1

ukuran sampel 20 g, pemisahan menghasilkan 9 g senyawa 2-nitro murni, 5,3 g isomer 6-nitro dan 2 g campuran dari keduanya. Kesimpulan CCC modern adalah bentuk baru dari persiapan LLC itu menawarkan lebih banyak keserbagunaan dalam pemilihan pelarut, mulai dari sangat lipofilik hingga sedang polar atau sistem ganic atau berair. Ini memberikan hasil yang dapat diprediksi perilaku tention dan pemulihan sampel lengkap karena retensi hanya bergantung pada partisi zat terlarut Koefisien dan adsorpsi dihalangi oleh inert sifat dari aparat. Kemampuan pemisahannya adalah lebih ditingkatkan dengan berbagai manipulasi teknis komposisi pelarut dan mengalir selama kromatografiphy, yang tidak dapat direproduksi dalam jenis lain kromatografi. CCC telah banyak digunakan oleh II / CHROMATOGRAPHY / Kromatografi Melawan Waktu 373 Halaman 10

kimiawan produk alami untuk isolasi dan pemurnian kation bahan bioaktif yang tidak stabil dari kompleks Matriks. Teknik ini layak mendapat perhatian lebih dari kimia analitik dihadapkan dengan pemisahan campuran kompleks, kimiawan sintetis yang menghadap purifikation produk non-kristal, diastereomer atau opResolusi tical rasemat, dan kimia fisik mencari pendekatan baru untuk mempelajari interaksi pelarut tindakan atau pengukuran sifat kimia seperti koefisien partisi atau konfigurasi disosiasi stants. Melanjutkan studi tentang aplikasi baru CCC di beberapa laboratorium, serta komersial pengembangan aplikasi yang lebih dapat diandalkan dan mudah digunakan paratus, berjanji untuk memperpanjang penggunaan CCC di masa depan yang bisa diduga. Sastra CCC Referensi untuk aplikasi CCC ditemukan melaluikeluar literatur produk analitis dan alami dan dalam monograf yang dikutip di bawah ini. Sejumlah besar referensi ditemukan dalam Journal of Chromatography dan dalam Jurnal Kromatografi Cair dan Teknik Terkait , banyak yang dikumpulkan di edisi khusus berkala jurnal-jurnal ini, yang terakhir dari yang berisi lebih dari 20 artikel. Daftar sebelumnya

masalah khusus dapat ditemukan di Conway (1995). Lihat juga: III / Alkaloid: Kecepatan Arus Tinggi Kromatografi. Antibiotik: Pengendali kecepatan tinggi sewa Kromatografi. Pemisahan kiral: Countercursewa Kromatografi. Pewarna: Kecepatan arus tinggi Kromatografi. Analisis Ion: Pengendali Kecepatan Tinggisewa Kromatografi. Produk Alami: Kecepatan tinggi Kromatografi arus balik. Protein: Kecepatan tinggi Kromatografi arus balik. Bacaan lebih lanjut Conway WD (1990) Kromatografi Melawan Waktu , Teori dan Aplikasi Aparatur . New York: VCH Conway WD dan Petroski RJ (eds) (1995) Modern Kromatografi arus balik . ACS Simposium Seri 593. Washington, DC: American Chemical Masyarakat. Conway WD, Bachert EL, Sarlo AM dan Chan CW (1998) Perbandingan kromatografi arus balik dengan kromatografi flash. Jurnal Kromatografi Cair phy dan Teknologi Terkait 21: 53} 63. Du QZ, Ke CQ dan Ito Y (1998) Daur ulang berkecepatan tinggi kromatografi berlawanan arah untuk pemisahan taksol dan cephalomanine. Jurnal Kromatografi Cair dan Teknologi Terkait 21: 157} 162. Dudding T, Mekonnen B, Ito Y dan Ziffer H (1998) Penggunaan kromatografi kromatografi arus balik pH-zona untuk memisahkan 2- dan 6-nitro-4-chloro-3-methoxybenzoic AC id. Jurnal Kromatografi Cair dan Terkait Teknologi 21: 195} 201. Foucault AP (ed) (1995) Centrifugal Partition Chromatography . New York: Marcel Dekker. Ito Y dan Conway WD (eds) (1996) Penghitung Kecepatan TinggiKromatografi saat ini . New York: John Wiley. Mandava NB (ed) (1998) Kromatografi arus balik. Jurnal Kromatografi Cair dan Teknologi Terkait nologies 21 (Edisi Khusus No 1 & 2): 1} 261. Mandava NB dan Ito Y (eds) (1988) Melawan arus Kromatografi , Teori , dan Praktik . New York: Marcel Dekker. Menet JM dan ThieHbaut D (eds) (1999) Melawan arus Kromatografi , Chromatographic Science Series Vol 82. New York: Marcel Dekker. Detektor: Laser Light Hamburan RPW Scott , Avon, CT, USA

Hak Cipta ^ 2000 Academic Press pengantar Ada dua jenis detektor hamburan cahaya yang digunakan dalam kromatografi cair, penghamburan cahaya menguap tering detektor dan detektor hamburan cahaya cair. Yang pertama menguap pelarut dari kolom eluen dalam aliran gas dan mengukur cahaya yang tersebar oleh partikel zat terlarut sisa; jenis detektor ini dijelaskan di tempat lain dalam ensiklopedia ini. Kedua, detektor hamburan cahaya cair, merasakan yang sebenarnya molekul terlarut sendiri dengan penghamburan cahaya pengukuran. Cairan mengandung molekul besar seperti polimer sintetik, biopolimer, misalnya poli peptida, protein dan polisakarida, menyebarkan cahaya dan, menyediakan cahaya insiden yang cukup kuat, cahaya yang tersebar dapat dirasakan dan digunakan untuk mendeteksi kehadiran zat terlarut. Dalam prakteknya eluen kolom adalah dibiarkan mengalir melalui sel yang dilewatinya sinar cahaya intensitas tinggi. Sumber cahayanya biasanya sinar laser paralel (amplifikasi cahaya oleh 374 II / CHROMATOGRAPHY / Detectors: Laser Light Hamburan