Guio Informatica V0 4 1 (2008) Alumne

GUIÓ DE PRÀCTIQUES D'INFORMÀTICA DE MICROBIOLOGIA SANITÀRIA

2006 - 2008

Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29

Aquesta obra està sota una llicència Reconeixement-CompartirIgual de Creative Commons. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/es/deed.ca

- Coordinador de Teoria: Joan Tomàs - Coordinador de Pràctiques: Óscar Gallardo - Disseny del guió: Óscar Gallardo Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29

Índex de continguts BLOC 1: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES NUMÈRICS:...........4 PART I: IDENTIFICACIÓ DELS MICROORGANISMES DE LES GALERIES DE PROBES BIOQUÍMIQUES ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep...........4 Introducció a la pràctica:..................................................................................4 Protocol de la pràctica:.....................................................................................4 A. API 20 Strep (Mètode tradicional amb llibre)..................................4 B. ENTEROSYSTEM 18 R (Mètode informàtic)................................4 Resultats:..........................................................................................................5 PART II: FUNCIONAMENT DELS MÈTODES NUMÈRICS PER A LA IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES..............................................6 Introducció a la pràctica:..................................................................................6 Protocol de la pràctica:.....................................................................................6 A. Disseny d'un experiment d'identificació numèrica amb PIB:............6 B. Exemple d'identificació numèrica amb PIB:...................................10 C. Creació i edició de matrius d'identificació amb IdBact:.................12 BLOC 2: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES MOLECULARS:...15 PART I: ANÀLISIS DE LES DADES D'UN EXPERIMENT D'E.L.I.S.A..............15 Introducció a la pràctica:................................................................................15 Protocol de la pràctica:...................................................................................15 A. Anàlisi de les dades de l'experiment pràctic d'E.L.I.S.A................15 B. Propostes opcionals........................................................................18 PART II: IDENTIFICACIÓ D'UN PATOGEN MITJANÇANT SEQUENCIACIÓ. ........................................................................................................................19 Introducció a la pràctica:................................................................................19 Protocol de la pràctica:...................................................................................19 ANNEX 1:..............................................................................................................................25 Programes utilitzats i on aconseguir-los:....................................................................25 ANNEX 2:..............................................................................................................................26 Laboratory Test Criteria for Diagnosis of Plague (from CDC):.................................26 ANNEX 3:..............................................................................................................................27 Llicència Creative Commons:.....................................................................................27

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

BLOC 1: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES NUMÈRICS: PART I: IDENTIFICACIÓ DELS MICROORGANISMES DE LES GALERIES DE PROBES BIOQUÍMIQUES ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep. Introducció a la pràctica: En aquest apartat, continuant amb la pràctica de l'anàlisi microbiològica de mostres d'orina, finalitzarem la identificació d'un bacteri pertanyent a la Família de les Enterobacteriàcies i d'un pertanyent al grup dels estreptococs, a partir dels resultats obtinguts de la inoculació i la lectura de les galeries miniaturitzades de probes bioquímiques ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep, respectivament. La metodologia que farem servir en tots 2 casos serà diferent ja que es tracta de galeries miniaturitzades de cases comercials diferents. Protocol de la pràctica: A. API 20 Strep (Mètode tradicional amb llibre). –

–

–

Agafarem el número de 6 xifres obtingut en llegir els resultats de l'API 20 Strep. Cada xifra d'aquest número es genera agafant un grup de 3 probes, i sumant els números que hi ha sota d'aquelles probes que hagin donat positiu (només de les que hagin donat positiu). Agafem el llibre subministrat per la casa comercial per aquesta galeria de probes, i comencem a cercar el número com si estiguéssim cercant una paraula en un diccionari: primer cerquem la secció corresponent a la primera xifra; després, dintre d'aquesta secció, cerquem per la segona xifra, i així fins que trobem el nostre número sencer. Anotarem el microorganisme que s'indiqui per aquest número, i la seva probabilitat.

B. ENTEROSYSTEM 18 R (Mètode informàtic). En aquest cas, disposem d'un programa informàtic per a una identificació ràpida. –

Obrir el programa Liofilchem Identification Code Disk (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → liofilc → liofilc)

. Hem de veure la següent pantalla:

4

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – –

Assegurar-se que està seleccionada la galeria de probes ENTEROSYSTEM 18 R. Fer clic sobre el cercle corresponent a cada proba bioquímica fins que aparegui un + si la proba va donar positiva o un – si la proba va donar negativa; en cas de que la proba fos negativa també podem deixar el cercle de la proba en blanc: Negativa

Positiva –

Negativa

Un cop tinguem totes les probes positives marcades amb +, veurem que s'ha generat un número a la part de baix, on posa NUMERICAL CODE:

–

–

Aquest número es genera de manera semblant al que varem obtenir en el cas de l'API 20 Strep. Fer clic sobre el botó de cerca que hi ha al costat del codi numèric per tal que el programa cerqui aquest número a la seva base de dades i ens proporcioni una identificació del microorganisme, tal com es mostra en el següent exemple:

Els números que s'observen a la dreta son els percentatges de probabilitat de que es tracti del microorganisme indicat. Si volem veure tota la llista de codis numèrics que fa servir el programa, podem fer clic al botó de visualització de codis: .

Resultats: API 20 Strep:

ENTEROSISTEM 18 R:

5

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

PART II: FUNCIONAMENT DELS MÈTODES NUMÈRICS PER A LA IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. Introducció a la pràctica: Les galeries miniaturitzades de probes bioquímiques es basen en mètodes numèrics per tal diferenciar el microorganisme problema, de la resta de microorganismes del grup al que creiem que pot pertànyer el nostre microorganisme, i així poder identificar-lo amb un determinat valor de probabilitat. En aquest mètodes numèrics, es fan servir matrius d'identificació on estan representats tots els microorganismes d'un grup (per exemple tots els bacteris entèrics, tots el cocs mesòfils Gram +, ...) i totes les proves bioquímiques o altres característiques que ens permetran diferenciar uns microbis d'uns altres del mateix grup. A més, en aquestes matrius està indicada, per a cada microorganisme i cada proba o característica, la probabilitat de que la prova/característica sigui positiva pel microorganisme. Així, en realitzar algunes d'aquestes proves amb el nostre microorganisme problema i comparar els resultats obtinguts amb la matriu d'identificació podem arribar a calcular la probabilitat de que el nostre microorganisme sigui un dels representats a la matriu. En aquest apartat farem servir 2 programes que ens permeten treballar amb matrius d'identificació: Probabilistic Identification of Bacteria v. 1.9.2, de Trevor Bryant (University of Southampton). http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska Institutet). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htm Protocol de la pràctica: A. Disseny d'un experiment d'identificació numèrica amb PIB: Farem servir el programa “Probabilistic Identification of Bacteria” per dissenyar el nostre propi sistema de galeries miniaturitzades per tal d'identificar Yersinia pestis. Yersinia pestis es un bacil Gram negatiu, aerobi, pertanyent a la família de les enterobacteriàcies, que pot infectar els éssers humans causant la malaltia anomenada pesta. Es transmet inicialment des de rosegadors infectats a través de les puces, encara que també es pot transmetre de persona a persona a través de les partícules que una persona amb infecció pulmonar (pesta pneumònica) expulsa en tossir. Actualment es una malaltia poc freqüent als paisos desenvolupats, Tinció inmunofluorescent de Yersinia pestis, 2000x. però es encara freqüent en paisos com la Índia (on va haver-hi una Origen: CDC epidèmia al 1994) i altres paisos africans. A pràctiques, realitzarem les primeres etapes del disseny d'una galeria de proves bioquímiques miniaturitzades, com les que hem fet servir però orientada específicament a la identificació de Yersinia pestis. –

Obrir el navegador Web Mozilla Firefox

(a l'escriptori), anar a la pàgina web

http://microsanitaria.googlepages.com i descarregar la “ Matriu entèrics” (entdatv2.csv) i la “ Matriu per Yersinia pestis” (ypestis.csv).

per

bacteris

6

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària –

Un cop descarregades les matrius que utilitzarem, obrir el programa Probabilistic Identification of Bacteria (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → PIBWin)

–

– –

–

. Apareix un

quadre de diàleg per triar la matriu d'identitat que volem fer servir. On posa “Tipo de archivos” triar la opció “CSV files [*.csv]” i seleccionar la matriu d'identificació d'enterobacteriàcies anomenada “entdatv2.csv”, tal com es mostra a la següent imatge:

Fer clic sobre la pestanya “Matrix” que hi sota la barra de menús, per veure la matriu d'identificació que acabem de carregar. Localitzar Yersinia pestis en la columna de l'esquerra de la matriu, i observar les proves per les que aquest microbi es positiu (+), variable (V) o negatiu (-):

Fer clic al menú “Options” i entre les opcions generals desmarcar la casella “Display matrix as +/v/-” per tal de veure el percentatge de positius per a cadascuna de les proves de la matriu:

Ara, haurem de triar aquelles proves que ens permetrien diferenciar Yersinia pestis de tota la resta d'enterobacteriàcies. Això ho podríem fer a ma, anant fent càlculs amb tots els valors numèrics de tots els microbis de la matriu per totes les proves de la matriu en comparar-los amb els valors de Yersinia pestis. Però aquest programa te unes eines que ens ho faran molt més fàcil. –

Fer clic al menú “Tools”, i després al submenú “Select Best Tests”. Apareixerà una nova pestanya, a part de les ja existents, anomenada “Best Tests for Matrix”, on podrem triar entre trobar aquelles proves que millor diferencien una soca de la resta, o les que permeten diferenciar totes les soques entre elles:

7

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

– – –

Seleccionar la primera opció, si no està marcada per defecte, i tria a la llista desplegable la soca Yersinia pestis. Fer clic al botó “Select Tests” i el programa calcularà per nosaltres quines son les proves òptimes per identificar el nostre microorganisme problema, diferenciant-lo de la resta. Observar i anotar les proves i, tot comparant amb la matriu d'identificació, indiqueu els resultats que donaria Yersinia pestis per a cadascuna d'elles: Prova

–

Yersinia pestis

Quines d'aquestes proves no son totalment compatibles amb el format de galeries de proves bioquímiques miniaturitzades? Justifica-ho:

8

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Cal doncs eliminar aquelles proves que no ens interessen per la galeria, i tornar a calcular les proves indispensables per identificar i diferenciar el nostre microorganisme problema. –

Fer clic al botó “Exclude Tests”. Apareixerà la següent pantalla, on per defecte estan marcades per la seva exclusió les proves que ja tenim seleccionades:

–

Per desmarcar totes les proves fer clic al botó “Include All Tests”. A continuació marcar només aquelles proves que hem seleccionat com no interessants per a la nostra galeria de proves bioquímiques miniaturitzades. I acceptar la selecció fent clic al botó “Ok”. Fer clic al botó “Select Tests” per tornar a calcular quines són ara les proves òptimes per identificar i diferenciar el nostre microorganisme problema. Observar i anotar les proves. Indicar al costat els resultats que hauria de donar Yersinia pestis:

– –

Prova

Yersinia pestis

9

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Prova

Yersinia pestis

B. Exemple d'identificació numèrica amb PIB: Farem servir el disseny experimental de l'apartat anterior per identificar Yersinia pestis en tres hipotètiques mostres d'esputs de pacients d'un hospital. Les dades, que s'han obtingut fent servir la galeria de proves bioquímiques miniaturitzades que hem dissenyat, són les següents: Pacient A Pacient B Pacient C MacConkey + Lysine decarboxylase Simmons citrate ONPG + + + Indole Cellobiose PWS Rhamnose PWS + Salicin PWS + + Sucrose PWS ? Xylose PWS + + ? –

– –

–

–

Si no està ja obert, obrir el programa Probabilistic Identification of Bacteria (PIBWin)

.

Fer clic al menú “File” i després al submenú “Open Identification Matrix”. On posa “Tipo de archivos” triar la opció “CSV files [*.csv]” i seleccionar la matriu d'identificació de Yersinia pestis anomenada “ypestis.csv” Fer clic sobre la pestanya “Results” que hi ha sota la barra de menús, per veure la graella de proves bioquímiques i poder introduir les dades:

Omplir les caselles de les proves bioquímiques fent clic amb el botó esquerre del ratolí per posar un i amb el botó dret per posar un . En cas de proves dubtoses o no realitzades deixar en blanc. Un cop emplenades les caselles per als resultat d'una de les mostres, apareixerà la pestanya “Identification” . Fent clic a sobre d'ella veurem els microorganismes resultat de la identificació i la probabilitat que té cada microorganisme de ser el correcte (“ID Modal Score”): 10

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

– –

Per inserir nous resultats, tornar a la pestanya “Results” Omplir la taula següent: Microorganismes

i fer clic al botó “New”.

Probabilitat

Pacient A Pacient B Pacient C –

Hi han hagut errors en fer les proves o la identificació? Cal fer més proves per algun pacient? Justifica la resposta.

–

En cas de que calguin fer més proves, es poden triar les més adients a la pestanya “Additional Tests” .

11

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

C. Creació i edició de matrius d'identificació amb IdBact: El programa IdBact és molt semblant al PIBWin, però, a diferència d'aquest permet crear i editar matrius d'identificació. De manera que farem servir aquest programa per crear una matriu d'identificació a partir de dades experimentals obtingudes amb assajos repetitius amb 4 especies del gènere Pseudomonas. –

Obrir el programa IdBact (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → Microbiology → IdBact)

– –

.

Fer clic al botó per crear una nova matriu d'identitat (també al menú: “File → New Matrix”). Apareix el quadre de diàleg “Design a New Matrix”. Indicar que farem 9 proves (“Number of Tests”) i que el número de bacteris (“Number of Bacterias”) serà 4:

–

Es generarà un graella que haurem d'emplenar tot afegint les espècies a la primera columna, i les proves a realitzar a la primera fila, tal com es veu en aquest exemple:

–

Les dades per emplenar aquesta matriu d'identificació s'han obtingut com a resultat de realitzar les diferents proves amb els diferents bacteris un número determinat de vegades, tot apuntant en cada cas si la prova donava positiu o negatiu. Fent servir les dades de la taula següent, calcula el percentatge de positius per a cada prova i cada bacteri, i introdueix la part entera del valor que obtinguis a la graella del programa IdBact.: Especies bacterianes

Assajos

Nº assajos Pseudomona Positius s aeruginosa Negatius % Positius Nº assajos Pseudomona Positius s fluorescens Negatius % Positius Nº assajos Pseudomona Positius s putida Negatius % Positius Nº assajos Pseudomona Positius s alcaligenes Negatius % Positius

MacConkey

Reducció 0.4% Hidròlisis 10% 10% DNasa Fluorescència Lecitinasa de Nitrats Selenit de Caseina Glucosa Lactosa

17 16 1

29 28 1

18 12 6

17 14 3

12 2 10

10 6 4

13 12 1

17 14 3

16 5 11

23 22 1

23 5 18

14 0 14

28 18 10

13 0 13

25 18 7

12 9 3

11 9 2

18 9 9

18 17 1

29 3 26

11 0 11

23 0 23

12 0 12

21 6 15

24 0 24

20 17 3

24 14 10

21 20 1

24 23 1

15 0 15

21 0 21

26 0 26

11 0 11

13 6 7

26 0 26

16 0 16

12

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària –

–

Un cop creada la matriu d'identificació passarem a provar-la. Per això, primer hem de passar al mode d'identificació numèrica del programa fent clic al botó mode de càlcul (també al menú: “Numerical identification”). Apareixerà una graella per entrar les dades del nostre experiment, molt semblant a la graella del programa PIBWin de l'apartat anterior:

Omplir les caselles teclejant + ó – (1 ó 0) segons la prova sigui positiva o negativa, tot atenent a la següent taula, on hi han els resultats de les anàlisis clíniques fetes amb frotis dèrmics de dos hipotètics pacients d'un hospital: MacConkey Reducció de Nitrats Creisement amb 0.4% Selenit Hidròlisis de Caseina DNasa Fluorescència Lecitinasa Creixement amb 10% Glucosa Creixement amb 10% Lactosa

–

Pacient 1 Pacient 2 + + +

+

+

Picar “Intro” o “Return” al teclat un cop omplertes les caselles per obtenir els resultats:

13

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària –

Fer clic al botó “Ok Next”

per realitza una nova identificació.

–

Omplir la següent taula amb els resultats obtinguts: Microorganismes

Probabilitat

Pacient 1 Pacient 2 –

Es pot dir amb aquest resultats que s'ha arribat a la identificació del microorganisme causant?

–

En cas de requerir-se més proves, per trobar quines són les que s'haurien de fer a continuació per tal d'afinar la identificació, es poden fer servir els següents botons a la pantalla de resultats: Suggereix una proba per diferenciar entre els 2 bacteris amb major probabilitat de ser el microorganisme problema. Suggereix una proba per diferenciar millor entre tots els microorganisme de la matriu. És útil quan la diferencia probabilística entre els diferents microorganismes proposats en la identificació és bastant semblant.

–

Quines probes caldria fer per identificar Pseudomones aeruginosa en el cas del pacient 1? I per identificar Pseudomones fluorescens en el cas del pacient 2? Fer servir el botó “Matrix” per veure quin resultat es l'adient per les proves suggerides pel programa per tal d'arribar a les identificacions que volem (Pseudomones aeruginosa pel pacient 1 i Pseudomones fluorescens pel 2).

14

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

BLOC 2: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES MOLECULARS: PART I: ANÀLISIS DE LES DADES D'UN EXPERIMENT D'E.L.I.S.A. Introducció a la pràctica: En aquest apartat farem servir un full de càlcul predissenyat per treballar amb les dades d'absorbància obtingudes al laboratori en l'experiment d'E.L.I.S.A fent servir el lector espectrofotomètric de plaques (lectura a 405 nm). Un full de càlcul predissenyat és una manera ràpida, senzilla i econòmica per treballar de manera puntual amb dades provinents d'un lector de plaques no connectat directament a un ordinador. Però si haguéssim de fer moltes lectures i el nostre lector de plaques estigues connectat a un ordinador, llavors faríem servir programes per l'adquisició i el tractament de dades com per exemple el programa anomenat Titri (disponible als ordinadors per si es vol provar): Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University Hospital Utrecht). http://www.tripod.com/members/~gestur/ Protocol de la pràctica: A. Anàlisi de les dades de l'experiment pràctic d'E.L.I.S.A. –

Obrir

el

navegador

Web

Mozilla

Firefox

,

anar

a

la

pàgina

web

http://microsanitaria.googlepages.com i descarregar el “ Full de càlcul per l'anàlisi de dades de l'E.L.I.S.A.” (ELISA.odt). En cas de no tenir disponible cap programa de full de càlcul a l'ordinador, es por fer servir un full de càlcul on-line. Tens l'enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com. –

El primer que s'ha de fer és introduir els estàndards, amb els que s'elaborarà la recta patró Concentració (D.O.600nm) – Absorbància 405nm. Recordar que, per fer els estàndards en el nostre E.L.I.S.A., varem fer 5 dilucions d'un cultiu de Salmonella tiphymurium A del qual coneixíem la D.O.600nm: Estàndards de Salmonella typhimurium A Blanc

1

2

3

4

5

6

7

8

F

-1

G H

A

1/2

1/5 1/10 1/30 1/50 B

B

1/2

1/5 1/10 1/30 1/50 B

C

1/2

1/5 1/10 1/30 1/50 B

9

10 11

12

-2

-1

-2

-1

-2

-1

-2

-1

-2

-1

-2

D E

Mostra 1

–

Mostra 2

Així, introduirem al formulari “Estàndards” la D.O.600nm mesurada del cultiu de Salmonella tiphymurium A, i també les dilucions que es van fer al laboratori. Les dilucions s'han d'introduir en forma de fraccions, tal com es mostra a la imatge:

15

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Observar que també s'inclou el blanc (valor 0, amb fons blau, a la filera de dilucions). –

A continuació ficarem els valors d'absorbància a 405nm que varem obtenir al laboratori pels estàndards i els blancs:

–

Baixar cap a baix per veure el resultat dels càlculs i les representacions gràfiques de la recta patró:

Pots observar tant la recta patró obtinguda a partir dels valors mitjans d'absorbància a 405nm per a cada concentració assajada (gràfica de l'esquerra, en lila), com la recta patró obtinguda per regressió lineal (gràfica de la dreta, en verd), la qual ens permetrà trobar la concentració de les nostres mostres a partir de la seva absorbància a 405nm. –

Dibuixa a la següent graella quadriculada la teva recta patró Concentració (D.O.600nm) – Absorbància 405nm que has obtingut, i compara-la amb la recta patró que ja vas fer:

16

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Recta patró Concentració (D.O.600nm) – Absorbància 405nm –

Creus que és una bona recta patró?

17

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – –

–

Canviar al formulari “Mostres” per poder introduir els resultats d'absorbància de les nostres mostres. Abans d'introduir les dades d'absorbància cal introduir la dilució que es va carregar de cada mostra a cada pouet. Recordar introduir les dilucions en forma de fraccions, tal com es mostra a la imatge:

A continuació introduir les dades d'absorbància a 405nm obtingudes al laboratori per les mostres. El full de càlcul farà els càlculs de concentració a partir de la recta patró obtinguda per regressió lineal, tot tenint en compte la dilució de la mostra aplicada a cada pouet: Absorbància405nm − terme independent b 1 Concentració= ⋅ pendent recta patró a dilució

Adicionalment, obtindrem el càlcul de la mitjana de concentració (D.O.600nm) i la desviació estàndard (S) per a cada mostra. Anota els resultats obtinguts: D.O.600nm Mitja

Desviació estàndard

Mostra 1: Mostra 2: B. Propostes opcionals. –

–

Ara pots obrir el programa Titri (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → Titri) per veure com és i com funciona aquest tipus de programes per l'adquisició i el tractament de dades d'E.L.I.S.A. A http://microsanitaria.googlepages.com trobaràs un enllaç a un mini-tutorial per l'anàlisi de les dades de pràctiques amb aquest programa. Per aprofundir més en la tècnica de l'E.L.I.S.A. pots fer un E.L.I.S.A. indirecte mitjançant un laboratori virtual “on-line” desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute: http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/immunology (trobaràs un enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com).

18

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

PART II: IDENTIFICACIÓ D'UN PATOGEN MITJANÇANT SEQUENCIACIÓ. Introducció a la pràctica: Mitjançant un laboratori virtual “on-line”, veurem com funciona la identificació de microorganismes basada en seqüències de DNA 16S. El laboratori virtual ha sigut desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute:

Al laboratori virtual, bàsicament el que veurem és: • Obtenció del ADN bacterià a partir d'una mostra d'un pacient. • Amplificació de ADN ribosòmic 16S per PCR, i purificació del producte de PCR. • Seqüenciació del ADN ribosòmic 16S amplificat. • Anàlisis de la seqüència obtinguda i identificació del microorganisme mitjançant bancs de dades. Protocol de la pràctica: –

Obrir el navegador Web Mozilla Firefox

.

–

Anar a la següent URL: http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/bacterial_id/ (trobaràs un enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com ).

–

Fer clic sobre la imatge del laboratori virtual i seguir les instruccions que apareixen tant a la part del laboratori virtual, com en el marc explicatiu de la dreta. Apunta una explicació breu del que es fa a cada fase, al costat de les següents imatges: A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

19

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

B. Amplificació de DNA ribosòmic 16S per PCR (“PCR Amplification”)

20

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”)

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

21

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

D. Seqüenciació automàtica (“DNA Sequencing”)

F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence Analysis”)

–

Un cop obtinguda la seqüència del ADN ribosòmic 16S, per fer l'anàlisi i la identificació del microorganisme present a la mostra, tal com se'ns indica, el primer que hem de fer a continuació es copiar la seqüència obtinguda:

22

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

–

–

–

Un cop tenim la seqüència copiada, ja podem anar a la plana web de cerca de la base de dades que vulguem. En el nostre cas farem servir la base de dades pública GenBank, accessible des de la web del NCBI (“National Center for Biotechnology Information”). El programa de cerca que farem servir a través d'aquesta web s'anomena BLAST. Per anar directament a la web del BLAST al NCBI fer servir l'enllaç que se'ns proporciona, o be introduir la següent URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ I triar la opció “nucleotide blast” dintre de l'apartat “Basic BLAST”. Enganxar la seqüència prèviament copiada al quadre de text on posa “Enter accession number, gi, or FASTA sequence”, dintre de l'apartat “Enter Querry Sequence”:

A continuació baixar cap a l'apartat “Choose Search Set” i seleccionar la base de dades (“Database”) “Nucleotide collection (nr/nt)”:

23

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

–

Baixar fins al final de la pàgina i fer clic al botó “BLAST” . Esperar a que apareguin els resultats. Apunta el microorganisme amb més probabilitat de ser el que estem intentant identificar, i torna a la finestra o pestanya del laboratori virtual per indicar quin és el microorganisme que has identificat:

–

Si vols repetir l'última part d'anàlisis de la seqüència i identificació del microorganisme aïllat a

–

partir d'una mostra clínica, a la web del laboratori virtual fes clic a “Samples” altra mostra (per exemple la mostra C, que és una mostra d'orina).

i tria una

24

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

ANNEX 1: Programes utilitzats i on aconseguir-los: Probabilistic Identification of Bacteria v. 1.9.2, de Trevor Bryant (University of Southampton). http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska Institutet). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htm Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University Hospital Utrecht). http://www.tripod.com/members/~gestur/ Howard Hughes Medical Institute. http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/immunology Howard Hughes Medical Institute. http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/bacterial_id/ Tots aquest programes i alguns dels fitxers utilitzats durant la pràctica es poden obtenir també de: http://microsanitaria.googlepages.com/

25

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

ANNEX 2: Laboratory Test Criteria for Diagnosis of Plague (from CDC): http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/plague/lab-test-criteria.htm SUSPECTED PLAGUE SHOULD BE CONSIDERED IF THE FOLLOWING CONDITIONS ARE MET:

1. Clinical symptoms that are compatible with plague, i. e., fever and lymphadenopathy in a person 2.

who resides in or recently traveled to a plague-endemic area. If small gram-negative and/or bipolar-staining coccobacilli are seen on a smear taken from affected tissues, e.g.:

• • •

Bubo (bubonic plague) Blood (septicemic plague) Tracheal/lung aspirate (pneumonic plague)

PRESUMPTIVE PLAGUE SHOULD BE CONSIDERED WHEN ONE OR BOTH OF THE FOLLOWING CONDITIONS ARE MET:

1. If immunofluorescence stain of smear or material is positive for the presence of Yersinia pestis F1 antigen.

2. If only a single serum specimen is tested and the anti-F1 antigen titer by agglutination is >1:10.* CONFIRMED PLAGUE IS DIAGNOSED IF ONE OF THE FOLLOWING CONDITIONS IS MET:

1. If a culture isolated is lysed by specific bacteriophage. 2. If two serum specimens demonstrate a four fold anti-F1 antigen titer difference by agglutination 3.

testing.* If a single serum specimen tested by agglutination has a titer of >1:128 and the patient has no known previous plague exposure or vaccination history.*

*Agglutination testing must be shown to be specific to Y. pestis F1 antigen by hemagglutination inhibition. References: Bibel DJ, Chen TH. Diagnosis of plague: an analysis of the Yersin-Kitasato controversy. Bacteriol Rev 1976;40:633-51. Campbell GL, Dennis DT. Plague and other Yersinia infections. In: Kasper DL, et al; eds. Harrison’s principles of internal medicine. 14th ed. New York: McGraw Hill, 1998:975-83. Chu MC. Laboratory Manual of Diagnostic Test. Geneva: World Health Organization, 2000. Gage KL. Plague. In: Colliers L, Balows A, Sussman M, Hausles WJ, eds. Topley and Wilson’s microbiology and microbiological infections, vol 3. London: Edward Arnold Press, 1998:885-903. Gross L. How the plague bacillus and its transmission through fleas were discovered: reminiscences from my years at the Pasteur Institute in Paris. Proc Natl Acad Sci, USA, 1995;92:7609-11. Kitasato S. The bacillus of bubonic plague. Lancet 1894; 2:428-30. Pollitzer, R. Plague. WHO Monograph Serigraph 1954; 22:1-698. Yersin A. La peste bubonique à Hong Kong. Ann Inst Pasteur Paris 1894; 8:662-7.

26

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

ANNEX 3: Llicència Creative Commons:

Reconeixement-No comercial-Compartir mateixa llicència 2.5 Espanya

amb

la

Sou lliure de: •

Copiar, distribuir i comunicar públicament l'obra

•

Fer-ne obres derivades

Amb les condicions següents:

• • •

•

Reconeixement. Heu de reconèixer els crèdits de l'obra de la manera especificada per l'autor o el llicenciador (però no d'una manera que suggereixi que us donen suport o rebeu suport per l'ús que feu l'obra).

•

No comercial. No podeu utilitzar aquesta obra per a finalitats comercials.

•

Compartir amb la mateixa llicència. Si altereu o transformeu aquesta obra, o en genereu obres derivades, només podeu distribuir l'obra generada amb una llicència idèntica a aquesta.

Quan reutilitzeu o distribuïu l'obra, heu de deixar ben clar els termes de la llicència de l'obra. Alguna d'aquestes condicions pot no aplicar-se si obteniu el permís del titular dels drets d'autor. No hi ha res en aquesta llicència que menyscabi o restringeixi els drets morals de l'autor.

Els drets derivats d'usos legítims o altres limitacions reconegudes per llei no queden afectats per l'anterior Aquesta obra està sota una llicencia Reconeixement-No comercial-Compartir amb la mateixa llicència 2.5 Espanya de Creative Commons. Per veure una copia d'aquesta llicencia, visiti http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/es/legalcode.ca o enviï una carta a Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California 94105, USA.

Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29

27