Genetika

Висока пољопривредно-прехрамбена школа струковних студија у Прокупљу

Семинарски рад из генетике са оплемењивањем биља

Ментор:

Студент:

Проф. др Владан Пешић

Душан Тошић ЗБ 26/07

Прокупље, септембар 2009.

1

Висока пољопривредно-прехрамбена школа струковних студија у Прокупљу

Семинарски рад: ТЕХНИКА РЕКОМБИНАНТНЕ DNK

Ментор:

Студент:

Проф. др Владан Пешић

Душан Тошић ЗБ 26/07

Прокупље, септембар 2009.

2

САДРЖАЈ:

Увод--------------------------------------------------------------------------------------4 Техника рекомбинантне DNK------------------------------------------------------5 Клонирање и амплификација--------------------------------------------------7 Закључак----------------------------------------------------------------------------9 Литература-------------------------------------------------------------------------10

УВОД 3

Средином осамдесетих година ХХ века дошло је до знатних промена у области фундаменталних биолошких истраживања. Ове промене биле су условљене тзв. рекомбинантном DNK технологијом. Мада је, у прво време, рекомбинантна DNK технологија искључиво примењивана у области молекуларне генетике, њена примена се проширила на сва подручја биолошких наука. Ова технологија нашла је подједнако добру примену у фундаменталним и примењеним истраживањима. Једна од области у којој се открића, до којих је дошло применом рекомбинантне DNK технологије, успешно примењују јесте и пољопривреда. Методе рекомбинантне DNK су, у прво време развоја, омогућавале истраживачима да из генома којег проучавају изолују велики број копија одређених DNK сегмената. Тако изоловани сегменти генома далје су испитивани биохемијским методама. Међутим, данас се за испитивање генома прокариота и еукариота користе различити поступци. То су поступци мапирања и секвенционирања генома, чији је крајњи циљ дешифровање свих нуклеотидних секвенци које поседују, како кодирајући, тако и некодирајући карактер. Тако упознате секвенце, у геному било које врсте, могуће је одређеним поступцима изоловати и умножити у неограничени број копија и , потом, њима манипулисати. један од начина примене метода молекуларне биологије у пољопривреди је и генетички инжењеринг, који има подједнако велики значај како за сточарску, тако и за биљну производњу. Основни циљ генетичког инжењерства је модификовање генома одређеног организма ради стварања нових гена који контролишу нове особине. Генетички инжењеринг данас има различите облике примене, почев од стварања сојева бактерија, које у фабричким количинама производе полипептиде и протеине за превентивне или терапеутске сврхе у хуманој и ветеринарској медицини, па све до стварања биљака и животиња у чији су геном интродуковани нови гени који контролишу нове особине. Поред тога у пољопривреди, поступцима генетичког инжењеринга производе се и сојеви азотобактерија, које имају способност да атмосферски ваздух претварају у доступни облик за легуминозне биљке и тако смање потребу биљака за потрошњом великих количина азотних ђубрива. У већини случајева ради се о генима за производне и репродуктивне особине, екстеријерне, тј. Морфолошке особине, или генима који имају учешће у отпорности биљака и животиња према различитим болестима.

ТЕХНИКА РЕКОМБИНАНТНЕ DNK

4

Крајем седамдесетих и почетком осамдесетих година прошлог века у молекуларној биологији развијене су технике које користе ензиме са циљем да се разбије DNK молекул и изолују његове специфичне генетске компоненте. Рекомбинантна DNK технологија створена је када су се ове технике даље усавршиле омогућивши да се изоловани гени убаце у бактеријске ћелије и да се синтетизују биолошки молекули са специфичним одликама. Појам рекомбинантне DNK означава молекул који је настао комбиновањем два различита молекула DNK. У технологији рекомбинантне DNK постоји пет битних фаза рада: 1) Стварање фрагмената DNK са циљем да се у неком од њих нађе одређени ген или део молекула DNK; 2) Уграђивање фрагмената DNK у погодан вектор, што је у ствари рекомбинантни део процеса; 3) Увођење вектора у погодног домаћина; 4) Култивисање комплекса домаћин-вектор на хранљивим подлогама ради добијања клонова домаћина, тј. добијања бројних копија фрагмената DNK уграђеног у вектор; 5) Убирање клонова који садрже одређени фрагмент DNK. До фрагмента DNK се може доћи и механичким сецкањем, али је ово насумично, па су добијени фрагменти увек недефинисани. Раних седамдесетих година је постигнут огроман напредак открићем да извесни ензими, пореклом од одређених бактеријских сојева, пресецају DNK на специфичним местима нуклеотидних низова. Ови ензими су названи рестрикциони ензими, а њихова улога у бактеријској ћелији је да исецају страну DNK из генома бактерије, док је бактеријска DNK заштићена од рестрикције метилацијом. Рестрикционе ендонуклеазе препознају специфичне, најчешће палидромске секвенце од 4 до 8 нуклеотида и секу DNK на тачно одређеном месту у оквиру тих низова. Места пресека се зову рестрикциона места. Захваљујући комплементарном карактеру базног спаривања у молекулу DNK рестрикционе ендонуклеазе доводе увек до прекида оба ланца DNK. Када се молекул DNK исече помоћу одређене рестрикционе ендонуклеазе добијени фрагменти имају једноланчане крајеве, који су „лепљиви“. На DNK вектор се текође делује истим рестрикционим ензимом, а затим се помоћу ензима лигазе спајају комплементарни крајеви фрагмента и DNK вектора. Тако добијени молекул DNK се назива рекомбиновани или хибридни молекул. У поменуте сврхе користе се различити типови вектора, који имају способност репликације у бактеријској ћелији. Класични вектори су плазмиди (кружни, дволанчани молекули дезоксирибонуклеинске киселине који се налазе ван главног хромозома бактерије и стабилно се наслеђују), бактериофаги (вируси који обављају животни циклус у бактерији) и козмиди (плазмидна дезоксирибонуклеинска смештена у омотач фага). Избор вектора зависи од врсте употребљеног рестрикционог ензима, величине фрагмента, и сл. Од наведених вектора највећи фрагмент може да се клонира у козмиду (величине до 50 kb-кило база, односно хиљада базних парова). У новије време постоје вектори који омогућавају уградњу и клонирање знатно већих фрагмената DNK, од неколико стотина kb, и који стога имају 5

значајну улогу у пројекту секвенционирања генома човека. То су нпр. YAC (yest arteficial chromosomes) или BAC (bacterial artifical chromosomes). Вектори се уносе у ћелију домаћина на више начина: трансформацијом, трансфекцијом, микроиницирањем. Комплекс домаћин-вектор се умножава култивацијом in vitro, у циљу добијања клонова који садрже одређене фрагменте испитиване DNK. За одабирање клонова са рекомбинованим фрагментом DNK се користи читав низ поступака. То може да буде селекција на основу променљивих својстава рекомбиноване бактерије, или хибридизације отисака бактеријских колонија са обележеним DNK пробама.

КЛОНИРАЊЕ И АМПЛИФИКАЦИЈА

6

Једна од основних могућности у производним процесима молекуларне биологије је могућност стварања неограниченог броја истоветних копија одређених сегмената молекула DNK. Ово је потребно ради утврђивања нуклеотидних секвенци у оквиру одређених изолованих сегмената, што је услов за упознавање њихове функције. Први начин производње великог броја копија одређених сегмената DNK назива се клонирање DNK, а други начин је тзв. амплификација односно умножавање сегмената DNK, посредством PCR (polymerase chain reaction) методе, тј. ланчане реакције полимеразе. Клонирање DNK постиже се уметањем DNK молекула, који треба да буде клониран (страни или инсертни молекул DNK), у ћелију вектора, која поседује способност репликације свог наследног материјала и у случају присуства страног молекула DNK. Основни услов за спровођење овог поступка је компатибилност крајева инсертованог и векторског молекула DNK. Да би се ово постигло, примењују се рестрикциони ензими. Потом се крајеви инсертоване и векторске DNK повезују посредством ензима, који се назива DNK лигаза. На тај начин настаје комбиновани, односно рекомбинантни молекул дезоксирибонуклеинске киселине.

Шема 1. Рекомбинантна DNK технологија и клонирање страног фрагмента DNK посредством плазмида

Као вектори, најчешће се примењују плазмиди, који представљају циркуларни дволанчани молекул DNK. Просечна дужина плазмида износи од 1 до 3 kb, а присутни су у појединим бактеријским ћелијама, независно од главног бактеријског хромозома. Плазмиди се веома успешно користе за клонирање релативно кратких фрагмената DNK молекула, чија дужина не прелази 10 kb. 7

Други вектор, који се веома често примењује за клонирање DNK молекула, јесте фаг ламбда (λ). Овај фаг поседује DNK молекул од 49 kb са централним регионом од око 20 kb. Тај централни регион може да се уклони и да се, уместо њега убаци инсертни молекул DNK друге врсте, али исте дужине, а да при том фаг λ не изгуби способност инфицирања бактеријске ћелије. Фаг λ не продире у бактеријску ћелију, већ се прихвата за њен зид и у њу ињектује свој DNK молекул, односно рекомбинантни молекул DNK. Потом у бактеријској ћелији оформљује се циркуларни молекул рекомбинантне DNK, а затим долази до његове репликације. Већи фрагменти молекула DNK могу да се клонирају, уколико се два краја молекула DNK фага λ уметну у плазмид. Крајеви DNK молекула фага су кохезивни и зато се називају кос-крајеви (cos-ends). Рекомбинантна DNK, која се добија уметањем фага у плазмид, назива се космидна DNK или космид, а вектор се назива космидни вектор. Пошто величина DNK молекула обично износи 49 kb, а како је величина плазмида мала, космиди се могу користити за клонирање фрагмената DNK молекула (инсертна DNK) дужине од 40 до 50 kb. Дужи фрагменти инсертне DNK (од неколико стотина kb do 1Mb) могу бити клонирани помоћу квасаца, тј. посредством вештачких хтомозома квасаца (YAC=yeast artificial chromosomes).YAC хромозом је је грађен од инсертованог фрагмента страног DNK молекула, који је бочно прихваћен за један од крајева хромозома квасца. Уколико се сви молекули дезоксирибонуклеинске киселине, из леукоцита одређене животињске врсте, дигестују посредством једног или више рестрикционих ензима , тада могу да се клонирају сви добијени фрагменти и да се конструише тзв. геномска библиотека. Таква библиотека садржи све кодирајуће и некодирајуће секвенце свих молекула DNK те врсте.

ЗАКЉУЧАК

8

Генетички инжењеринг изазвао је револуцију у биолошким наукама. Нови продори учињени су на готово свим подручјима биолошких истраживања. Примена технологије рекомбинантне DNK и генетичког инжењеринга могућа је у сфери како фундаменталних, тако и примењених истраживања. Значај технике рекомбинантне DNK у фундаменталним истраживањима огледа се у бољем сагледавању структуре и функционисања прокариотских и еукариотских генома, као и генома вируса. При томе се испитује регулација активности гена, одређује се примарна структура кодирајућих и регулаторних секвенци, механизми интеракције генома вируса и ћелије домаћина, улога мобилних генетичких елемената, поређења примарне структуре гена из различитих врста, итд. Поступци рекомбинантне DNK се успешно примењују и у пољопривреди.

ЛИТЕРАТУРА

9

Вучинић M.,Пешић В.,1997. Манипулације анималним и биљним геномима и генима у пољопривреди, Универзитет у Београду,Београд 45, 62-64. www.selcom.hr www.novibeograd.info sr.wikipedia.org www.vet.bg.ac.yu www.dgsgenetika.org.yu www.farmaceuti.com www.danas.co.yu www.poljoinfo.com

10