Genetika Mikroorganisme_g70117004_kelompok 1_kelasd.docx

MAKALAH MIKROBIOLOGI

GENETIKA MIKROORGANISME

DISUSUN OLEH : FARMASI D KELOMPOK I

SHERINA VANESHA SOPUTRI ( G 701 17 004)

JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS TADULAKO PALU 2019

i

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kita ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat-Nya yang memberi kesempatan kepada penyusun makalah ini sehingga dapat tersusun dengan baik sesuai yang harapkan nantinya. Makalah ini disusun agar pembaca dapat mengetahui tentang mikroskop dan metode mikrobiologi. Malah ini tersusun masih banyak kekurangan, oleh sebab itu penyusun mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya atas bantuan teman-teman yang telah memberi sumber materi dan dosen-dosen pengajar yang telah memberi kesempatan dalam penyelesaian makalah ini. Demikianlah penyusun mengucapkan terima kasih kepada semua yang telah berpartisipasi dalam penyusunan makalah ini. Semoga makalah ini dapat bermanfaat untuk kita semua.

Penyusun

SHERINA VANESHA SOPUTRI

i

3

DAFTAR ISI BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang............................................................................................................. I.2 Rumusan Masalah....................................................................................................... I.3 Tujuan.........................................................................................................................

BAB II ISI II.1 Pengertian Gen dan Prinsip Dogma Sentral................................................................... II.2 Replikasi, Transkripsi, dan Translasi.............................................................................. II.3 Transformasi Genetik Mikroorganisme dan Rekombinan.............................................

BAB III PENUTUP III.1 Kesimpulan..................................................................................................................

i

4

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Genetika merupakan suatu cabang ilmu yang dinamis dan berkembang dengan cepat. Penelaahnya dilakukan oleh beribu-ribu ilmuwan diseluruh dunia. Rekayasa genetika adalah suatu segi baru studi genetika yang menjanjikan pada masyarakat baik perkembangan yang menguntungkan maupun kemungkinan timbulnya akibat-akibat yang membawa bencana. Penelaahan tentang genetika pertama kali dilakukan oleh seorang ahli botani bangsa Austria, Gregor Mendel pada tanaman kacang polongnya. Pada tahun 1860-an ia menyilangkan galur-galur kacang polong dan mempelajari akibatakibatnya. Hasilnya antara lain terjadi perubahan-perubahan pada warna, bentuk, ukuran, dan siat-sifat lain dari kacang polong tersebut (Pelczar, 2009). Ilmu yang mempelajari cara pengekspresian informasi genetis yang terkandung dalam molekul DNA serta mekanisme pengendalian hereditas pada organisme oleh DNA adalah genetika . Molekul DNA yang ditemukan dalam sel terdiri dari dua rantai komplementer yang berbentuk heliks dan saling membelitsehingga disebut heliks ganda atau double heliks.Masingmasing rantai DNAterdiri dari empat jenis nukleotida, yang dapat dibedakan menurut jenis basanitrogennya yaitu adenin (A), timin (T), sitosin (C), dan guanin (G) (Jawetz, 2001). Pada masa kini genetika telah mampu menjelaskan cara DNA mengendalikan sifat dan mempertahankan proses yang penting di dalam sel hidup. Langkah pertama dalam pengekspresian sifat yang dikandung DNA ialah dengan mencetak molekul RNA berdasarkan urutan nukleotida pada DNA. Molekul RNAmerupakan polimer rantai tunggal yang terdiri dari empat macam nukleotida yaitu adenin (A), urasil (U), sitosin (C) dan guanin (G). (Ristiati, 2000). Genetika mikrobia telah mengungkapkan bahwa gen terdiri dari DNA, suatu pengamatan yang melekat dasar bagi biologi molekuler. Genetika bakteri mendasari perkembangan rekayasa genetika, suatu teknologi yang bertanggung jawab terhadap perkembangan di bidang kedokteran. Berdasarkan urian diatas, untuk mengetahui lebih lanjut pengemasan bahan genetik bakteri, penyusun mengangkat judul “Genetika Mikroba”.

i

5

B. Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dalam penulisan makalah ini yaitu sebagai berikut: 1. Apa itu gen? 2. Bagaimana prinsip dogma sentral? 3. Jelaskan proses replikasi, transkripsi, dan translasi! 4. Jelaskan transformasi genetik mikroorganisme dan rekombinan!

C. Tujuan 1. Mengetahui definisi gen. 2. Mengetahui prinsip dogma sentral. 3. Mengetahui proses replikasi, transkripsi, dan translasi. 4. Mengetahui transformasi genetik mikroorganisme dan rekombinan.

i

6

BAB II DASAR TEORI II.1 Gen II.1.1 Definisi Gen Genetika merupakan ilmu tentang hereditas dan variasi yang terkait dengannya. Dalam uraian berikut kita akan mempelajari beberapa hal penting yang berkaitan dengan genetika seperti pengertian tentang konsep gen, DNA, dan kromosom; hubungan antara gen (DNA)-RNA-polipeptida dan proses sintesis protein; keterkaitan antara proses pembelahan mitosis dan meiosis dengan pewarisan sifat; prinsipprinsip hereditas dalam mekanisme pewarisan sifat; dan peristiwa mutasi dan implikasinya dalam salingtemas (Saefudin, 2007). Definisi gen telah berevolusi sejalan dengan sejarah genetika. Pada konsep Mendelian, suatu gen digambarkan sebagai unit penurunan sifat yang mempunyai ciri-ciri tersendiri yang mempengaruhi karakter fenotipik. Morgan dan koleganya menempatkan gen-gen seperti itu pada lokus-lokus tertentu di dalam kromosom dan bahwa ahli-ahli genetik menggunakan lokus sebagai nama lain untuk gen. Kemudian para ahli lainnya melihat suatu gen sebagai daerah urutan nukleotida spesifik di sepanjang molekul DNA. Akhirnya para ahli menggunakan defenisi fungsional dari gen sebagai urutan DNA yang mengkode rantai polipeptida tertentu. Walaupun demikian defenisi satu gen–satu polipeptida harus diperbaharui dan diterapkan secara selektif. Sebagian besar gen-gen eukariotik terdiri dari segmen bukan pengkode (intron), jadi sebagian besar gen-gen ini tidak memiliki segmen-segmen pasangannya di dalam polipetida. Ahli biologi molekuler juga sering memasukan promoter dan daerah regulator DNA lain di dalam ruang lingkup suatu gen. Urutan DNA tersebut tidak ditranskripsi tetapi dianggap sebagai bagian dari gen fungsional sebab urutan tersebut

i

7

harus ada agar proses transkripsi dapat berlangsung. Defenisi molekuler sebuah gen juga harus cukup luas agar mencakup DNA yang ditranskripsi menjadi rRNA, tRNA, dan RNA-lainnya yang tidak ditranslasi (Gambar 1). Gen-gen tersebut tidak mempunyai produk polipeptida. Jadi dari penjelasan ini ada definisi lain tentang gen, sebuah gen adalah suatu daerah DNA yang produk akhirnya bisa suatu polipeptida atau bisa juga suatu molekul RNA (Saefudin, 2007). Dogma sentral biologi menjelaskan mengenai proses perubahan gen dari DNA menjadi RNA, dan RNA menjadi protein. Dogma ini menjelaskan bagaimana proses pembacaan materi genetik menjadi protein yang berperan di setiap tahap metabolisme di dalam tubuh suatu organisme (Bettelheim et al, 1984) Sebagai pernbawa informasi genetika, DNA rnempunyai dua fungsi utama: 1) rnembuat kopi yang tepat dari pada dirinya sendiri pada waktu proses repllkasi atau duplikasi dan 2) rneneruskan koda-koda informasi yang dimiliki ke.nRNA (tnessenger RNA) pada waktu proses transkripsi. Dengan demikian mRNA kelaknya dapat menterjemahkan (mengtranslasikan) informasi-informasi "bahasa dalam 4 huruf" dari pada asam nukleat ke dalam "bahasa dalam 24 huruf" darl pada protein. Konsep ini (gambar 1) merupakan dasar yang terkenal sebagai Dogma Sentral yang dlkemukakan oleh Crick (2) pada tahun 1958 (Soedigdo, 1973). Dogma yang berlaku universal ini menyatakan bahwa sekali informasi telah diteruskan menjadi protein, maka tidak dapat dikembalikan menjadi bentuk asalnya (DNA). Aliran informasi dari asam nukleat ke asam nukleat memang memungkinkan, tetapi aliran informasi dari protein ke asam nukleat atau dari protein ke protein tidak memungkinkan. Dogma sentral terdiri dari tiga tahap yaitu replikasi, transkripsi dan translasi. Tahap replikasi dilakukan untuk memasok DNA pada setiap organisme, sedangkan tahap transkripsi bertujuan untuk menulis ulang DNA dalam bentuk mRNA (messenger RNA).

i

8

Tahap translasi untuk menterjemahkan mRNA tersebut menjadi suatu protein (Yuwono, 2013).

II.2 Replikasi, Trankripsi, dan Translasi A. Replikasi Secara umum, replikasi bahan genetik merupakan proses pengkopian rangkaian molekul bahan genetik (DNA atau RNA) sehingga dihasilkan molekul anakan yang sangat identik. Meskipun konsep dasar replikasi antara struktur bahan genetik yang satu dengan yang lainnya adalah serupa, namun diketahui ada banyak perbedaan dalam hal mekanisme rincinya. Sebagai contoh, bahan genetik yang berupa molekul RNA mempunyai mekanisme replikasi rinci yang berbeda dengan replikasi molekul DNA. Pada kelompok virus, misalnya , replikasi bahan genetiknya terjadi di dalam sel inang yang sebenarnya merupakan jasad hidup yang lain dari jasad virus itu sendiri. Hal ini dapat terjadi karena virus merupakan jasad parasit obligat. Di lain pihak, replikasi DNA pada prokaryot dan eukaryot terjadi di dalam sel jasad hidup yang bersangkutan. Selain itu perbedaan struktural molekul bahan genetik, misalnya antara DNA lingkar (Circular DNA) dengan DNA linear juga berimplikasi pada perbedaan mekanisme replikasi (Yuwono, 2005). Beberapa

hipotesa

diajukan

untuk

menjelaskan

proses

sintesa/replikasi DNA ini yaitu model konservatif, semikonservatif dan dispersif. Pada model konservatif disintesa masing-masing satu untai lama dan satu untai baru, kemudian kedua untai tersebut mensintesa komplemennya. Model ini tidak sesuai dengan struktur DNA yang ada. Demikian pula model dispersif, tidak mungkin terjadi sintesa secara

i

9

berselang-seling antar yang lama dan yang baru semacam suatu hybrid. Sifat komplementer pada model DNA untai ganda (double helix) dari Watson dan Crick memberi kesan bahwa replikasi DNA terjadi secara semikonsevatif. Dengan demikian, jika masing-masing untai pada molekul induk DNA untai ganda terpisah dari komplemennya saat replikasi, setiap bagian tersebut akan berfungsi sebagai cetakan (template), yang dengan cetakan ini disintesis sebuah untai komplementer yang baru (Yuwono, 2013)

Replikasi DNA dimulai pada tempat-tempat khusus yang disebut pangkal replikasi (origin of replication). Pangkal replikasi yaitu satu bagian DNA yang mempunyai urutan nukleotida yang spesifik . Protein yang memulai replikasi DNA mengenali urutan ini dan menempel pada DNA, memisahkan kedua untaian dan membuka sebuah „gelembung‟ replikasi. Tahap pembukaan DNA untai ganda dikatalis oleh 3 macam enzim yaitu : 1. Helikase adalah sejenis enzim yang berfungsi membuka untai ganda di cabang replikasi, dan memisahkan kedua untai lama. 2. Enzim untai destabilizing protein , atau single stranded DNA binding protein (SSB), molekul dari protein pengikat untai tunggal kemudian berjajar disepanjang untai-untai lama yang tidak berpasangan menjaga agar untai-untai ini tetap terpisah selama mereka bertindak sebagai cetakan untuk sintesis untai-untai komplementer yang baru

i

10

3. DNA girase, enzim ini mengkatalis pembukaan untai ganda sebelum proses replikasi dimulai.

Replikasi DNA kemudian berjalan dalam dua arah sampai seluruh molekul tersebut disalin. Setiap kromosom eukariot mempunyai ratusan atau ribuan pangkal replikasi. Gelembung replikasi terbentuk dan akhirnya menyatu, sehingga mempercepat penyalinan molekul DNA yang sangat panjang ini. Di setiap ujung gelembung replikasi terdapat cabang replikasi (replication fork), suatu daerah berbentuk huruf Y dimana untai DNA baru mulai memanjang (Yuwono, 2013). Terdapat beberapa komponen-komponen penting dalam replikasi DNA. Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa komponen utama, yaitu: 1) DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang akan direplikasi. 2) molekul deoksi ribonukleotida yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP. Deoksi ribonukleotida terdiri atas tiga omponen yaitu basa purin atau pirimidin, gula 5-karbon (deoksiribosa) dan gugus fosfat. 3) enzim polimerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisis proses polimerasi nukelotida menjadi untaian DNA. Pada bakteri Escherichia coli terdapat tiga macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase I, DNA polimerase II dan DNA polimerase III. Pada jasad eukaryot terdapat lima macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase α, DNA polimerase δ, DNA polimerase ε, DNA polimerase β dan DNA polimerase γ. 4) Enzim primase yaitu enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA. Pada bakteri E. Coli kompleks enzim ini disebut primosom yang terdiri atas beberapa macam protein. 5) enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, yaitu helikase dan enzim lain yang membantu proses tersebut yaitu enzim girase. 6) molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka yaitu protein SSB (single strand bonding protein). 7) enzim DNA ligase yaitu suatu enzim yang berdungsi untuk menyambung fragmen-fragmen DNA (Yuwono, 2005).

i

11

Enzim utama yang berpe-ran dalam replikasi adalah DNA polymerase. DNA polymerase mensintesa DNA baru dengan arah 5‟→3‟. DNA polymerase tidak dapat memulai pembuatan untaian DNA baru, enzim ini hanya dapat menambahkan nu-kleotida pada 3‟-OH yang sudah ada. Oleh karena itu, untuk memulai untai yang baru harus ada primer (biasanya berupa RNA) di mana DNA polymerase dapat menempelkan nukleotida yang pertama. Karena untaian DNA berpasangan secara antiparalel, maka pada untai di-mana pembentukan untai DNA barunya itu dari 5‟ ke 3‟ akan terjadi sintesa DNA secara ber-sinambungan dan disebut lead-ing strand, sedangkan pada untai yang lainnya akan terjadi sintesa DNA dengan terputus-putus dan disebut lagging strand. Re-plikasi dimulai pada tempat yang disebut ori (origin of repli-cation) dan berakhir pada termi-nator (Lucianus, 2003).

Replikasi DNA berlangsung dalam beberapa tahap yaitu: (1) denaturasi (pemisahan) untaian DNA induk, (2) peng-”awal”-an (initiation, inisiasi) sintesis DNA, (3) pemanjangan untaian DNA, (4) ligasi fragmen fragmen DNA, dan (5) peng-“akhir”-an (termination, terminasi) sintesis DNA. Sintesis untaian DNA baru akan dimulai setelah kedua DNA induk terpisah membentuk garpu replikasi, pemisahan dilakukan oleh enzim DNA helikase. Sintesis DNA berlangsung dengan orientasi 5‟-P→3‟-OH. Oleh karena ada dua untaian DNA cetakan yang orientasinya berlawanan, maka sintesis kedua untaian DNA baru juga

i

12

berlangsung dengan arah geometris yang berlawanan namun semuanya teteap dengan orientasi5‟→3‟. Keadaan semacam ini menimbulkan perbedaan dalam hal meanisme sintesis antara keua untaian DNA yang baru (Yuwono, 2005). Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA. Proses pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh beberapa jenis protein yang dapat mengenali titiktitik tersebut, dan juga protein yang mampu membuka pilinan rantai DNA. Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh rantai telah benar-benar terpisah Pada model replikasi biasa umumnya replikasi berlangsung ke satu arah sehingga hanya ada satu untaian DNA awal dan satu untaian DNA lambat. Pada kenyataannya telah diketahui bahwa replikasi juga dapat berlangsung ke dua arah yang berlawanan, yiatu dikenal sebagai replikasi dua arah (bidirectional replication). Dalam replikasi dua arah akan terbentuk dua garpu replikasi yang bergerak ke arah yang berlawanan. Pada kedua garpu replikasi tersebut juga terjadi sintesis DNA baru secara kontinu dan diskontinu sehingga ada dua untaian DNA awal dan dua untaian DNA lambat (Yuwono, 2005). Inisiasi (peng-„awal‟-an) replikasi DNA adalah proses permulaan sintesis untaian DNA yang sebelumnya didahului oleh sintesis molekul primer. Proses inisiasi berlangsung dengan mekanisme yang berbeda antara suatu jasad dengan jasad yang lain. Pada bakteri E. coli sintesis primer dikatalisis oleh kompleks protein yang disebut primosom.

i

13

Primosom terdiri atas enzim primase/DnaG (berperan dalam sintesis molekul primer). Protein PriA, PriB, PriC, DnaTm, DnaB dan DnaC. Pada E. coli diketahui ada dua tipe atau sistem reaksi inisiasi, yaitu (1) sistem фX dan (2) sistem oriC. Sistem фX adalah sistem inisiasi replikasi DNA virus фX174, sedangkan sistem oriC aladah sistem inisiasi yang melibatkan ori pada E. coli (Yuwono, 2005). Struktur untai ganda ini akan mempengaruhi replikasi DNA. DNA polimerase menambahkan nukleotida hanya pada ujung 3' yang bebas dari untai DNA yang sedang terbentuk, tidak pernah pada ujung 5'. Jadi untai DNA baru dapat memanjang hanya pada arah 5'→ 3'. Di sepanjang salah satu untai cetakan, DNA polimerase dapat mensintesa untai komplementer yang kontinu memanjangkan DNA yang baru dengan arah 5'→3'. Untai DNA yang dibuat dengan metode ini disebut leading strand. Untuk memanjangkan untai baru DNA yang lain, polimerase harus bekerja disepanjang cetakan jauh dari cabang replikasi. Untai DNA yang disintesis dalam arah ini disebut lagging strand. Berbeda dengan leading strand, yang memanjang terus menerus, lagging strand pertama kali disintesis sebagai serangkaian segmen. Potongan ini disebut fragmen Okazaki, sesuai dengan nama ilmuwan Jepang yang menemukannya. Panjang fragmen-fragmen ini sekitar 100 sampai 200 nukleotida pada eukariot. Proses ini mengandung satu untai utuh DNA anak mengikuti DNA induk dan satu untai lagi fragmen berupa DNA anak. Fragmen anak ini kemudian dirangkaikan menjadi satu untai utuh oleh enzim DNA ligase sehingga akhirnya satu DNA untai ganda menghasilkan 2 DNA anak untai ganda dan seterusnya (Yuwono, 2013). Setelah dilakukan inisiasi dan polimerasi akhirnya proses replikasi DNA akan diakhiri dengan proses terminasi atau pengakhiran replikasi. Pada prokaryot replikasi genom berbentuk lingkar akan berakhir pada waktu kedua garpu replikasi bertemu pada suatu titik namun pada eukaryot keadaannya menjad lain karena struktur genomnya linear sehingga ada

i

14

komplikasi terminasi replikasi pada ujung-ujung kromosom. Titik tempat pengakhiran replikasi disebut sisi terminasi. Pada E. coli ada enam sisi terminasi yaitu TerA, TerB, TerC, TerD, TerE, dan TerF. Urutan konsensus

sisi

terminasi

AATTAGTATGTTGTAACTAAANT.

adalah Urutan

sebagai basa

DNA

berikut tersebut

diperlukan untuk menghentikan garpu replikasi yang mendekati daerah tersebut dari ujung 5‟ (Yuwono, 2005). Kesalahan proses replikasi molekul DNA hanya terjadi satu dalam 1 miliar nukleotida, tetapi kesalahan pemasangan awal antara nukleotida yang sudah ada pada untai cetakan dapat mencapai 100.000 kalinya atau sebesar 10.000 pasang basa. Sel memiliki mekanisme reparasi yaitu perbaikan salah pasang (mismatch repair ) yang akan memperbaiki kesalahan-kesalahan yang terjadi ketika DNA disalin. Selama replikasi DNA, DNA polimerase sendirilah yang melakukan perbaikan salahpasang. Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap cetakannya begitu nukleotida ditambah pada untaian. Dalam rangka mencari nukleotida yang pasangannya tidak benar, polimerase memindahkan nukleotida tersebut kemudian melanjutkan kembali sintesis. Protein lain selain DNA polimerase juga melakukan perbaikan salah-pasang (Yuwono, 2013). B. TRANSKRIPSI Transkripsi merupakan tahapan penting dalam sintesis protein atau ekspresi gen. Proses transkripsi terjadi pada nukleus (prokaryotik: nukleoid) di mana DNA diterjemahkan menjadi kode-kode dalam bentuk basa nitrogen membentuk rantai RNA yang bersifat single strain. Namun, pada rantai RNA yang terbentuk basa Timin digantikan dengan basa Urasil. Pada prokaryotik, rantai RNA langsung ditranslasikan sebelum transkripsi selesai. Sedangkan pada eukaryotik, rantai di bawa menuju sitoplasma (ribosom) untuk ditranslasi menjadi produk gen. Pembentukan

i

15

RNA pada proses transkripsi melibatkan enzim RNA polymerase. Fungsi dasar kedua yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat) nya (Warianto, 2011). Transkripsi terdiri dari tiga tahap, yaitu: (a) Inisiasi (permulaan). Transkripsi diawali oleh promoter, yaitu daerah DNA tempat RNA polimerase melekat. Promoter mencakup titik awal transkripsi dan biasanya membentang beberapa pasang nukleotida di depan titik awal tersebut. Fungsi promoter selain menentukan di mana transkripsi dimulai, juga menentukan yang mana dari kedua rantai ganda DNA yang digunakan sebagai cetakan. (b) Elongasi (pemanjangan). Ketika RNA bergerak di sepanjang DNA, pilinan rantai ganda DNA tersebut terbuka secara berurutan

kira-kira

10-20

basa

DNA.

Enzim

RNA

polimerase

menambahkan nukleotida ke ujung 3‟ dari molekul RNA yang dibentuk di sepanjang rantai ganda DNA. Setelah sintesis RNA berlangsung, rantai ganda DNA akan terbetuk kembali dan RNA baru akan terlepas dari cetakannya. (c) Terminasi (pengakhiran). Transkripsi berlangsung hingga RNA polimerase mentranskripsi urutan DNA yang dinamakan terminator. Terminator merupakan urutan DNA yang berfungsi untuk mengakhiri proses transkripsi. Pada prokariotik, transkripsi berhenti pada saat RNA polimerase mencapai titik terminasi. Pada eukariotik, RNA p olimerase terus melewati titik terminasi, 10-35 nukleotida, RNA yang telah terbentuk terlepas dari enzim tersebut (Kusnadi, 2010).

i

16

Interaksi antara RNA polimerase eukariot dan faktor transkripsi merupakan suatu contoh betapa pentingnya interaksi protein-protein dalam mengontrol transkripsi. Salah satu faktor transkripsi adalah TATA box. Pada sel eukariot enzim yang mentranskripsi gen pengkode-protein menjadi pra mRNA ialah RNA polimerase II. Enzim ini memulai sintesis RNA pada promoter yang biasanya berupa TATA box yaitu suatu urutan nukleotida TATAAAA. TATA ini terletak kira-kira 25 nukleotida upstream jauhnya dari titik awal transkripsi. RNA polimerase II tidak dapat mengenali TATA dan tanda-tanda khusus lain pada promoter. Protein lain dari faktor transkripsi yang membantu mengenali TATA ini, mengikatkan diri pada DNA sebelum RNA polimerase memulai transkripsi (Yuwono, 2013). Jika inisiasi berhasil, RNA polimerase melepaskan faktor s, dan bersama-sama dengan DNA dan RNA nasen (RNA yang baru disintesis), akan membentuk kompleks terner atau kompleks yang terdiri atas tiga komponen. Dengan adanya kompleks terner ini RNA polimerase dapat berjalan

di

sepanjang

molekul

DNA.

Artinya,

promoter

akan

ditinggalkannya untuk kemudian ditempati oleh holoenzim RNA polimerase berikutnya sehingga terjadi reinisiasi transkripsi. Bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks, atau disebut dengan gelembung transkripsi (transcription bubble), akan terlihat bergeser di sepanjang molekul DNA sejalan dengan gerakan RNA polimerase. Panjang bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks tersebut relatif konstan, yakni sekitar 17 pb sedangkan ujung 5’ molekul RNA yang disintesis akan membentuk heliks hibrid dengan pita antisens DNA sepanjang lebih kurang 12 pb. Ukuran ini ternyata tidak mencapai satu putaran heliks. RNA polimerase E. coli bergerak dengan kecepatan rata-rata 40 nukleotida per detik. Akan tetapi, angka ini dapat bervariasi sesuai dengan urutan lokal DNA (urutan DNA yang telah dicapai oleh RNA polimerase). Tetap dipertahankannya bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks

i

17

menunjukkan bahwa RNA polimerase membuka heliks DNA di depan gelembung transkripsi dan menutup heliks DNA di belakangnya. Dengan demikian, heliks hibrid RNA-DNA harus berputar setiap kali terjadi penambahan nukleotida pada penyalinan molekul DNA yang sangat panjang ini. Di setiap ujung gelembung replikasi terdapat cabang replikasi (replication fork), suatu daerah berbentuk huruf Y dimana untai DNA baru mulai memanjang (Yuwono, 2013). Terdapat beberapa komponen-komponen penting dalam replikasi DNA. Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa komponen utama, yaitu: 1) DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang akan direplikasi. 2) molekul deoksi ribonukleotida yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP. Deoksi ribonukleotida terdiri atas tiga omponen yaitu basa purin atau pirimidin, gula 5-karbon (deoksiribosa) dan gugus fosfat. 3) enzim polimerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisis proses polimerasi nukelotida menjadi untaian DNA. Pada bakteri Escherichia coli terdapat tiga macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase I, DNA polimerase II dan DNA polimerase III. Pada jasad eukaryot terdapat lima macam DNA polimerase yaitu DNA polimerase α, DNA polimerase δ, DNA polimerase ε, DNA polimerase β dan DNA polimerase γ. 4) Enzim primase yaitu enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA. Pada bakteri E. Coli kompleks enzim ini disebut primosom yang terdiri atas beberapa macam protein. 5) enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, yaitu helikase dan enzim lain yang membantu proses tersebut yaitu enzim girase. 6) molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka yaitu protein SSB (single strand bonding protein). 7) enzim DNA ligase yaitu suatu enzim yang berdungsi untuk menyambung fragmen-fragmen DNA (Yuwono, 2005). Enzim utama yang berpe-ran dalam replikasi adalah DNA polymerase. DNA polymerase mensintesa DNA baru dengan arah 5‟→3‟. DNA polymerase tidak dapat memulai pembuatan untaian DNA baru,

i

18

enzim ini hanya dapat menambahkan nu-kleotida pada 3‟-OH yang sudah ada. Oleh karena itu, untuk memulai untai yang baru harus ada primer (biasanya berupa RNA) di mana DNA polymerase dapat menempelkan nukleotida yang pertama. Karena untaian DNA berpasangan secara antiparalel, maka pada untai di-mana pembentukan untai DNA barunya itu dari 5‟ ke 3‟ akan terjadi sintesa DNA secara ber-sinambungan dan disebut lead-ing strand, sedangkan pada untai yang lainnya akan terjadi sintesa DNA dengan terputus-putus dan disebut lagging strand. Re-plikasi dimulai pada tempat yang disebut ori (origin of replication) dan berakhir pada termi-nator (Lucianus, 2003). C. TRANSLASI Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Perlu dipahami bahwa hanya molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Molekul mRNA merupakan transkrip (salinan) urutan DNA yang menyusun suatu gen dalam bentuk ORF (open reading frame), kerangka baca terbuka). Molekul rRNA adalah salah satu molekul penyusun ribosom, yakni organel tempat berlangsungnya sintesis protein, sedangkan tRNA adalah pembawa asam-asam amino yang akan disambungkan menjadi rantai polipeptida. Suatu ORF dicirikan oleh: (1) kodon inisiasi translasi yaitu urutan ATG (pada DNA) atau AUG (pada mRNA) (2) serangkaian urutan nukleotida yang menyusun banyak kodon dan (3) kodon terminasi translasi yaitu RAA (UAA pada mRNA), TAG (UAG pada mRNA) atau TGA (UGA pada mRNA) perlu diingat bahwa pada RNA tidak ada basa thymine (T) melainkan dalam bentuk uracil (U) (Yuwono, 2013). Translasi berlangsung di dalam sitoplasma dan ribosom. Translasi merupakan proses penterjemaahan sutu kode genetik menjadi protein yang

i

19

sesuai. Kode genetik tersebut berupa kodon di sepanjang molekul RNAd, sebagai penterjemaahnya RNAt. RNAt membawa asam amino dari stoplasma ke ribosom. Molekul RNAt membawa asam amino spesifik pada salah satu ujungnya yang sesuai dengan triplet nukleotida pada ujung RNAt lainnya yang disebut antikodon. Misalnya, perhatikan kodon RNAd UUU yang ditranslasi sebagai asam amino fenilalanin. RNAt pembawa fenilalanin mempunyai antikodon AAA yang komplemen dengan UUU agar terjadi reaksi penambahan fenilalanin pada rantai polipeptida sebelumnya. RNAt yang mengikat diri pada kodon RNAd harus membawa asam amino yang sesuai ke dalam ribosom. Melekatnya asam amino pada RNAt dibantu oleh enzim aminoasil-RNAt sintetase (aminoacyl-tRNA synthetase). Ribosom memudahkan pelekatan antara antikodon RNAt dengan kodon RNAd selama sintesis protein. Ribososm tersususn atas subunit besar dan subunit kecil yang dibangun oleh protein-protein dan molekul-molekul RNAt (Kusnadi, 2010). Kita dapat membagi translasi menjadi 3 tahap yaitu insiasi, elongasi dan terminasi. Semua tahapan ini memerlukan faktor-faktor protein yang membantu mRNA, tRNA dan ribosom selama proses translasi. Untuk inisiasi dan elongasi rantai dibutuhkan sejumlah energi yang disediakan oleh GTP (guanin triphospat) yaitu suatu molekul yang mirip ATP. Tahap inisiasi dari translasi membawa bersama-sama mRNA, sebuah tRNA yang memuat asam amino pertama dari polipeptida, dan dua subunit ribosom. Pertama subunit ribosom kecil mengikatkan diri pada mRNA dan tRNA inisiator khusus. Pada tahap elongasi, asam-asam amino ditambahkan satu persatu pada asam amino pertama. Tiap penambahan melibatkan partisipasi beberapa protein yang disebut faktor elongasi dan terjadi dalam siklus tiga tahap yaitu: 1. Pengenalan kodon. Kodon mRNA pada tempat A dari ribosom membentuk ikatan hidrogen dengan antikodon molekul tRNA yang baru masuk yang membawa asam amino yang tepat. Faktor elongasi

i

20

membawa tRNA ke tempat A. Langkah ini juga membutuhkan hidrolisis GTP. 2. Pembentukan ikatan peptida. Molekul rRNA dari subunit ribosom besar, berfungsi sebagai ribozim, mengkatalis pembentukan ikatan peptida yang menggabungkan polipeptida yang memanjang dari tempat P ke asam amino yang baru tiba di tempat A. Pada tahap ini, polipeptida memisahkan diri dari tRNA tempat pelekatannya semula, dan asam amino pada ujung karboksilnya berikatan dengan asam amino yang dibawa oleh tRNA di tempat A. 3. Translokasi. Molekul tRNA di tempat A, sekarang terikat pada polipeptida yang sedang tumbuh, ditranslokasikan ke tempat P. Saat RNA berpindah tempat, antikodonnya tetap berikatan dengan hidrogen pada kodon mRNA; mRNA bergerak bersama -sama dengan antikodon ini dan membawa kodon berikutnya untuk ditranslasi pada tempat A. Sementara t RNA yang tadinya berada pada tempat P bergerak ketempat E dan dari tempat ini keluar dari ribosom. Langkah translokasi membutuhkan energi yang disediakan oleh hidrolisis GTP. mRNA bergerak melalui ribosom ke satu arah saja, mulai dari ujung 5' hal ini sama dengan ribosom yang bergerak 5'→3' pada mRNA. Hal yang penting disini adalah ribosom dan mRNA bergerak relatif satu sama lain, dengan arah yang sama, kodon demi kodon. Siklus Elongasi menghabiskan waktu kurang dari 1/10 detik dan terus diulang saat tiap asam amino ditambahkan pada rantai hingga polipeptidanya lengkap.

i

21

Tabel. Kodon asam amino, kodon tanda mulai translasi dan kodon stop

Translasi akan berakhir pada waktu salah satu dari ketiga kodon terminasi (UAA, UGA, UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom. Dalam keadaan normal tidak ada aminoasil-tRNA yang membawa asam amino sesuai dengan ketiga kodon tersebut. oleh karena itu, jika ribosom mencapai salah satu dari ketiga kodon terminasi tersebut, maka proses translasi berakhir. Pada E. coli ketiga sinyal penghentian proses translasi tersebut dikenali oleh suatu protein yang disebut release factors (RF) misalnya RF1 yang mengenali kodon UAA atau UAG atau RF2 yang mengenali kodon UAA atau UGA. Sebaliknya pada eukaryot hanya ada satu release factor yaitu eRF yang mengenali ketiga kodon terminasi tersebut (Yuwono, 2005).

II.3 Transformasi Genetik Mikroorganisme dan Rekombinan (Tjahjoleksono, 2012) Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang

i

22

berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat). Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resipien (sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindah ke dalamsel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan jumlah sel tidak bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel). Oleh karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan sifat ini disebabkan karena strain yang tidak virulen (strain kasar) dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan. Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri kasar menjadi menjadi bakteri halus atau perubahan dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar. Berdasarkan

i

23

pada mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan transformasi bakteri secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana yaitu mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi sel-sel bakteri yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut. Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri seringkali disebut bakteriofage atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri (ingat siklus hidup fage: siklus litik dan siklus lisogenik). Pada waktu DNA fage dikemas di dalam pembungkusnya untuk membentuk partikel fage-fage baru, DNA fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA bakteri yang telah menjadi inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri lainnya, maka fage akan memasukkan DNA-nya yang mengandung sebagian dari DNA bakteri inangnya yang sebelumnya. Dengan demikian, fage tidak hanya memasukkan DNA-nya sendiri kedalam sel bakteri yang diserangnya tetapi juga memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya. Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA. Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi

i

24

untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri). Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperi ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends. Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa mereka berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil menggabungkan fragmenfragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya, kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara kovalen dengan menggunakan enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat DNA rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi ditemukan dan diisolasi pertama kali dari E.coli oleh Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969 .

i

25

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular atau DNA yang berbentuk lingkaran. Disamping memiliki satu kromosom, berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari pada DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen). Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar disamping ditujukkan adanya berbagai situs yang dapat dipotong oleh enzim restriksi. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung situs enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plamid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya, enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin (gen ApR). Dari beberapa perangkat diatas (enzim restriksi, enzim DNA ligase, dan plasmid), telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan

i

26

dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA, yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri. Tahapan dalam mengklonkan gen meliputi: pemotongan plasmid, menyisipkan gen atau fragmen DNA, memasukkan DNA kedalam sel bakteri (trasformasi), seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Pemotongan plasmid. Plasmid pBR322 dipotong di dalam tabung reaksi menggunakan enzim restriksi PstI maka pBR322 akan terpotong atau terbuka pada bagian gen ApR. Menyisipkan gen atau fragmen DNA. Bila pBR322 yang sudah terbuka lingkarannya dicampur dengan potongan DNA asing dan kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah berupa campuran yang berisi: 1) plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran lagi seperti semula, 2) plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh DNA asing. Memasukkan DNA kedalam sel bakteri (trasformasi). Campuran kedua bentuk plasmid ini kemudian dicampurkan dengan kumpulan sel-sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid. Kemungkinan hasilnya berupa campuran yang berisi: 1) sel bakteri yang mendapatkan plasmid pBR322 tanpa sisipan, 2) sel yang mendapatkan plasmid rekombinan (pBR322 yang telah disisipi DNA asing), 3) sel bakteri yang tidak mengandung (tidak dimasuki) plasmid. Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Dalam contoh ini, seleksi dilakukan dengan menggunakan media tumbuh bakteri yang mengandung antibiotik. Sel yang yang tidak mengandung pasmid tidak akan tumbuh pada media yang mengandung ampisilin maupun tetrasiklin. Sel bakteri yang mengandung plasmid tanpa sisipan (pBR322 semula) tumbuh pada media yang mengandung tetrasiklin maupun ampisilin. Sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan tumbuh pada media yang mengandung tetrasiklin tetapi tidak tumbuh pada

i

27

media yang mengandung ampisilin karena gen ApR disisipi DNA asing sehingga sehingga tidak berfungsi. Dalam teknis pelaksanaannya, cairan suspensi dalam pekerjaan transformasi (campuran antara bakteri, plasmid, dan DNA asing yang telah diperlakukan dalam rangka transformasi) disebarkan pada media yang mengandung tetasiklin. Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni Sel 1 dan koloni Sel 2 (koloni adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-masing koloni yang tumbuh

pada

media+tetrasiklin

kemudian

dipindahkan

pada

media+ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada media+ampisilin adalah koloni yang diinginkan (sel-sel bakterinya mengandung plasmid rekombinan). Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim b-galactosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ. Dengan demikian kita dapat menyisipkan DNA asing pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan β-galactosidase). Bila kita menggunakan pUC188 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactosida). Enzim β-galactosidase akan memecah Xgal menjadi galatosa dan 5-bromo-4-chloroindigo berwarna biru. Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung Xgal. Hal ini karena l bakteri menghasilkan enzim β-galactosidase. Oleh karena medianya mengandung Xgal maka enzim β-galactosidase memecahkan

i

28

Xgal sehingga dihasilkan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galactosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.

Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan rekayasa genetika terhadap berbagai organisme tidak lepas dari peranan transposon. Transposon atau elemen loncat mula-mula ditemukan oleh Barbara McClintock. Untuk sampai pada penemuan tentang adanya transposon, Barbara McClintock mempelajari penyebab terjadinya variasi warna biji jagung. Seperti yang pernah anda pelajari sebelumnya bahwa biji jagung terbentuk sebagai hasil dari pembuahan ganda (dua pembuahan). Satu pembuahan menghasilkan zigot yang kemudian berkembang menjadi embrio yang tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainnya menghasilkan endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya (yang nampak sebagai biji jagung). Endosperma ini merupakan bagian terbesar dari biji dan merupakan bagian penyimpan makanan. Endosperma inilah yang kita gunakan kandungan karbohidratnya untuk makanan kita maupun makanan ternak. Bagian dari kromosom tersebut pindah dari satu tempat ke tempat lain pada kromosom yang sama atau pindah dari satu kromosom ke kromosomlainnya. Bagian dari kromosom yang dapat berpindah tempat tersebut dinamakan transposon. Jadi, transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat berpindah-pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat berpindah-pindah tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu krosom. Transposon juga dapat pindah dari satu molekul DNA ke molekul DNA lainnya atau pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya. Karena memiliki kemampuan untuk berpindah tempat dengan sendirinya maka sering kali transposon disebut juga dengan nama elemen loncat. Transposon dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman,

i

29

cendawan, dan bakteri. Jenis transposon bermacam-macam berdasarkan ukuran atau panjangnya, gen-gen yang dikandungnya, dan cara berpindahnya. Transposon yang paling sederhana hanya mengandung gen penyandi enzimtranposom (transposase). Enzim transposon ini dibutuhkan untuk melepaskan diri dari tempat semula dan menyisip ke tempat lain. Transposon yang lebih kompleks dapat mengandung satu atau beberapa gen tertentu misalnya gen-gen penyandi resistensi terhadap antibiotik. Bila transposon menyisip pada suatu gen tertentu maka gen tertentu tersebut akan terganggu fungsinya. Oleh karena itu, transposon sering digunakan oleh para peneliti untuk melakukan mutagenesis (melakukan proses mutasi) sehingga dihasilkan mutan. Misalnya, untuk mempelajari gen yang menyebabkan warna hijau, seorang peneliti dapat menggunakan transposon untuk mendapatkan mutan yang tidak berwarna hijau. Mutan menjadi tidak hijau karena gen penentu warna hijau disisipi oleh transposon. Dengan melacak posisi dimana transposon berada maka peneliti tersebut dapat mempelajari gen yang menentukan warna hijau karena gen tersebut telah disisipi transposon (gen warna hijau bersatu bersama transposon). Transposon juga dapat digunakan untuk menandai suatu sel. Transposon yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik sering digunakan oleh para peneliti sebagai penanda. Kita dapat menandai suatu strain bakteri dengan menyisipkan gen resistensi terhadap suatu antibiotik. Untuk menyisipkan gen resistensi terhadap antibiotik, kita dapat menggunakan transposon. Misalnya, kita dapat menandai strain bakteri-B dengan menggunakan transposon Tn5-kanR (transposon Tn5 yang mengandung gen kanR. Gen kanR menyandikan resistensi terhadap antibiotik kanamisin). Kita dapat menggunakan Tn5-kanR untuk menandai agar bakteri-B menjadi resisten terhadap kanamisin. Bila Tn5 masuk ke dalam sel bakteri-B maka Tn5 beserta gen kanR yang dikandungnya akan menyisip ke dalam DNA (kromosom) bakteri-B. Dengan demikian bakteriB yang semula tidak tahan terhadap kanamisin, setelah disisipi Tn5 menjadi tahan terhadap kanamisin. Selanjutnya bila sel bakteri-B yang sudah ditandai tersebut tercampur dengan sel bakteri lainnya, maka kita

i

30

masih dapat memilihnya atau menyeleksinya yaitu menggunakan media yang mengandung kanamisin. Dalam hal ini, bakteri lain tidak tumbuh, sedangkan bakteri-B (yang sudah ditandai) dapat tumbuh pada media dengan antibiotik kanamisin tersebut. Transposon dapat digunakan untuk menandai sel, menandai suatu gen, melacak keberadaan suatu gen, menemukan letak suatu gen di dalam kromosom. Jadi, transposon merupakan salah satu perangkat penting di dalam teknologi DNA rekombinan. Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari genom suatu organisme adalah dengan menggunakan pendekatan Shot-Gun. Dengan pendekatan ini, DNA total dipotong menggunakan enzim restriksi. Oleh karena jumlah potongannya sangat banyak maka sangatlah sulit untuk mempelajari setiap potongan tersebut dalam waktu yang bersamaan. Oleh karena itu, potongan-potongan tersebut perlu untuk disimpan lebih dulu sebelum mendapatkan gilirannya untuk dipelajari. Untuk menyimpan potongan atau fragmen DNA genom digunakan Pustaka Genom. Pustaka genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA genom yang dipelajari. Setiap klon bakteri membawa satu plasmid rekombinan sedangkan setiap klon fage membawa satu DNA fage rekombinan. Kumpulan klon-klon bakteri yang membawa plasmid rekombinan ini dinamakan Pustaka Plasmid, sedangkan kumpulan fage rekombinan dinamakan Pustaka Fage. Jadi Pustaka Genom dapat berupa Pustaka Plasmid dan/atau Pustaka Fage. Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA. Tidak lama setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan David

Baltimore

secara

enzimtranskripsi-balik

terpisah

pada

tahun

(reverse-transcriptase)

yang

1970

menemukan

digunakan

oleh

retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim

i

31

transkripsi-balik ini kemudian digunakan untuk mengkonstruksi copy DNA yang disebut cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan RNA sebagai cetakannya. Dengan demikian gen atau bagian dari gen dapat disintesis berdasarkan mRNA. Proses sintesis DNA dengan cara ini merupakan kebalikan dari pada proses transkripsi. Oleh karena itu dinamakan transkripsi balik. Saat ini, enzim transkriptase-balik sudah diproduksi secara komersial. Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan bagi para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggungjawab terhadap sifat-sifat tertentu. Tanpa enzim transkriptase-balik, pekerjaan mencari gen umumnya dimulai dari mengisolasi DNA total genom, kemudian memotong-motongnya menjadi ratusan ribu potongan yang kemudian diteruskan dengan mempelajari setiap potongan. Cara ini tentu saja membutuhkan lebih banyak tenaga dan memakan waktu yang lebih lama. Dengan ketersediaan enzim transkritase-balik, pekerjaan mencari gen tidak lagi harus dimulai dengan mengisolasi DNA genom total tetapi dimulai dengan mengisolasi mRNA. Tahapan utama dalam pembuatan DNA menggunakan transkriptase balik ini adalah sebagai berikut: 1) DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada wakttu transkripsi semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzimtranskriptase menjadi RNA. 2) Dalam proses pasca-transkripsi, intron dibuang sehingga mRNA tidak lagi mengandung intron. 3) Bila kita berhasil mengisolasi mRNA dari sel, maka kita dapat membuat DNA gen yaitu dengan menambahkan enzim transkriptase-balik. 4) Enzim transkriptase-balik mensisntesis DNA dengan menggunakan mRNA tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya berupa DNA utas tunggal. 5) Setelah dihasilkan DNA utas tunggal, DNA polimerase akan mensintesis utas DNA pasangannya sehingga dihasilkan gen yang

i

32

berupa DNA utas ganda. DNA gen hasil dari transkripsi balik ini tidak mengandung intron. Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Edwin M Southern, pada tahun 1975, telah mempublikasikan prosedur untuk mendeteksi fragmen DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama teknik Southern Blotting. Pelacak atau probe yang digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam nukleat pendek, berutas tunggal (RNA atau DNA berutas tunggal) dan diberi label radioaktif atau non radioaktif. Bila dicampurkan dengan fragmen-fragmen DNA, rangkaian basa yang ada pada probe tersebut akan berpasangan dengan rangkaian basa komplementer yang ada pada fragmen DNA. Dengan kata lain bahwa fragmen DNA yang akan tertempeli probe adalah fragmen DNA yang mengandung urutan basa yang komplementer dengan urutan basa pada probe. Dengan teknik ini, gen tertentu dapat diisolasi dari campuran fragmen DNA yang kompleks. Langkah awalnya adalah memisahkan fragmen-fragmen DNA dengan cara elektroforesis pada gel agarosa. Fragmen DNA yang telah terpisah di dalam gel agarose, selanjutnya didenaturasi (dibuat menjadi utas tunggal). Fragmen-fragmen DNA tersebut kemudian ditransfer pada filter nitroselulosa atau membran nilon sehingga setiap fragmen DNA menempel kuat pada membran dan posisinya yang sama dengan posisi pada gel agarosa. Kemudian membran atau filter direndam dalam cairan yang mengandung probe. Bila probe-nya adalah probe radioaktif, filter selanjutnya ditempelkan atau diekspose pada lembaran film X-ray untuk mengetahui posisi fragmen yang tertempeli probe pada filter atau membran. Probe non-radioaktif juga telah cukup lama dikembangkan. Probe dapat dikaitkan dengan enzim, misalnya peroksidase sehingga menjadi probe-enzim. Deteksinya dapat dilakukan dengan menggunakan substrat chemiluminescent yang signalnya ditangkap oleh lembaran film x-ray. Probe juga dapat dikaitkan dengan vitamin misalnya biotin, sedangkan deteksinya menggunakan enzim misalnya

i

33

alkalin phosphatase. Signalnya akan nampak langsung pada filter atau membran berupa pita-pita yang berwarna biru/ungu bila pita-pita tersebut merupakan fragmen DNA yang berikatan dengan probe. Dengan prinsip yang sama yaitu perpasangan basa-basa probe dengan basa-basa DNA target yang komplementer, probe asam nukleat ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi klon yang benar. Klon DNA (gen atau fragmen DNA) dapat dibuat melalui pembuatan plasmid rekombinan di dalam tabung reaksi (mencampurkan plasmid asal dan fragmen DNA). Kemungkinan yang dapat ditemui di dalam tabung reaksi tersebut adalah plasmid tanpa mengandung fragmen DNA (plasmid asal) dan plasmid rekombinan (plasmid yang mengandung fragmen DNA). Tahap berikutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri dengan cara mencampurkan campuran plasmid tersebut dengan bakteri inangnya. Kemungkinan yang dapat terjadi dalam hal ini adalah: ada sel bakteri yang tidak berisi plasmid, ada sel yang berisi plasmid asal, dan ada sel yang berisi plasmid rekombinan. Teknik Southern Blotting tersebut di atas dapat digunakan untuk mendeteksi klon yang benar (klon bakteri yang mengandung plasmid rekombinan), yaitu dengan menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen DNA yang diklonkan (urutan basanya komplemen dengan urutan basa pada fragmen yang diklonkan). Berdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga pendekatan, yaitu: 1) Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, memilih fragmen yang dikehendaki, mengklonkan fragmen yang telah terpilih. 2) Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA pada vektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan gen yang diinginkan. 3) Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis.

i

34

BAB III PENUTUP III.1 Kesimpulan 1. Gen digambarkan sebagai unit penurunan sifat yang mempunyai ciri-ciri

tersendiri yang mempengaruhi karakter fenotipik Sentral Dogma adalah proses penyimpanan dan pemindahan informasi genetik melalui 3 tahap yaitu replikasi, transkripsi dan translasi. 2. Replikasi adalah proses pengkopian rangkaian molekul bahan genetik (DNA atau RNA) sehingga dihasilkan molekul anakan yang sangat identik. Tahapan proses replikasi diantaranya adalah denaturasi (pemisahan) untaian DNA induk, inisiasi (sintesis DNA), pemanjangan untaian DNA, ligasi fragmenfragmen DNA dan terminasi (sintesis DNA) Transkripsi adalah proses sintesis protein dimana DNA diterjemahkan menjadi kode-kode dalam bentuk basa nitrogen membentuk rantai RNA yang bersifat single strain.Tahapan dalam proses transkripsi diantaranya adalah inisiasi, elongasi dan terminasi. Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Tahapan dalam proses translasi diantaranya adalah inisiasi, elongasi dan terminasi. 3. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan sifat ini disebabkan karena strain yang tidak virulen (strain kasar) dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan.

i

35

DAFTAR PUSTAKA

Gardner, dkk. 2000. Principle of Genetic. New York: John Wiley & Sons Inc. Jawetz, dkk. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika. Pelczar, Michael. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. Ristiati, Ni Putu. 2000. Pengantar Mikrobiologi Umum. Jakarta: Departemen Pendidikan Nasional. Snustad, P.D. and Simmons, M. J. 2012. Principles of Genetics. 6th ed. Unites States of America: John Willey & Sons Inc.

Soedigdo, P. 1973. Tinjauan Ulang Mengenai Biokimia DNA Dan RNA Serta Biosintesa Protein. Proceedings ITB Vol. 7, No. 2. ITB. Bandung.

Tjahjoleksono, Aris. 2012. Teknologi DNA Rekombinan. Institut Pertanian Bogor. Bogor

Yuwono. 2013. Bioinformatika: Sebuah Pengantar. Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya. Palembang.

Yuwono, Tribowo. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta.

i