Genetika I

GENETIKA I

[ARAC- STO[I] JANA’ 87.

(za III razred Biolo{ke gimnazije)

2004. 1

GENETIKA I Predgovor GENETIKA I je prvenstveno namenjena u~enicima srednjih {kola koji se interesuju za genetiku, ali je mogu koristiti i osnovci. Knjiga je napisana u formi ud`ebika, a radi lak{eg i boljeg razumevanja gradiva ud`benik je dopunjen zadacima. Zadaci su obele`eni po te`ini. Najlak{i nisu obele`eni, ne{to te`i su obele`eni ° , a najte`i *. @elim vam sre}u prilikom savla|ivanja gradiva! P.S. Ako imate neke predloge i ispravke, javite mi!

]ao!!!!!

Jana [arac- ZAMI’87.

2

GENETIKA I

Sadr`aj: Predgovor.....................................................................................................................................2 Sadr`aj.........................................................................................................................................3 Uvod............................................................................................................................................5 ]elija...........................................................................................................................................8 ]elijska membrana.....................................................................................................................10 Citoplazma.................................................................................................................................10 ]elijske organele........................................................................................................................10 Hromozomi................................................................................................................................14 Oblici hromozoma......................................................................................................................15 Broj hromozoma.........................................................................................................................16 Gra|a hromozoma.......................................................................................................................16 Bojenje hromozoma....................................................................................................................16 DNK...........................................................................................................................................18 Zadaci.........................................................................................................................................21 Nivoi organizacije hromatina......................................................................................................22 Replikacija DNK.........................................................................................................................24 Mezelson- Stalov eksperiment.....................................................................................................24 Op{ti pregled replikacije DNK....................................................................................................25 Genetski kod i sinteza proteina....................................................................................................28 RNK............................................................................................................................................28 Gen..............................................................................................................................................28 Transkripcija................................................................................................................................30 Geneti~ki kod..............................................................................................................................32 Translacija...................................................................................................................................33 Zadaci.........................................................................................................................................35 Mendelovi zakoni nasle|ivanja...................................................................................................37 Pravila nasle|ivanja....................................................................................................................39 Mendelovi eksperimenti..............................................................................................................39 Dominantno-recesivno nasle|ivanje............................................................................................41 Intermedijarno nasle|ivanje........................................................................................................42 Korelativno nasle|ivanje............................................................................................................43 Kodominantno nasle|ivanje.......................................................................................................43 Povratno ukr{tanje.....................................................................................................................44 Dihibridno ukr{tanje..................................................................................................................44 Polni hromozomi i nasle|ivanje polno vezanih osobina.............................................................46 Zadaci.......................................................................................................................................49 Mutacije....................................................................................................................................51 Somati~ne mutacije...................................................................................................................51 Germinalne mutacije.................................................................................................................52 Genske mutacije........................................................................................................................52

3

GENETIKA I Hromozomske mutacije............................................................................................................53 Strukturne hromozomske mutacije...........................................................................................53 Mehanizmi promena................................................................................................................54 Numeri~ke hromozomske mutacije..........................................................................................54 Karpechenkov eksperiment......................................................................................................55 Medicinska genetika................................................................................................................56 Autozomno dominantno i autozomno recesivno nasle|e..........................................................57 Polno vezane bolesti................................................................................................................57 Neke uro|ene anomalije izazvane autozomno dominantnim genima.......................................57 Neke uro|ene anomalije izazvane autozomno recesivnim genima...........................................58 Uro|ene anomalije izazvane genima na X hromozomu...........................................................58 Neke bolesti izazvane strukturnim aberacijama hromozoma...................................................59 Neke bolesti izazvane numeri~kim aberacijama hromozoma ..................................................60 Zadaci.....................................................................................................................................63 Geneti~ke rekombinacije.........................................................................................................66 Homologna rekombinacija.......................................................................................................66 Crossing over...........................................................................................................................66 Holidejev model.......................................................................................................................66 Molekularno kloniranje.............................................................................................................68 Izolovanje DNK........................................................................................................................69 Isecanje i spajanje DNK............................................................................................................71 Transformacija ili uno{enje rekombinovane DNK u bakteriju...................................................73 Identifikacija }elija doma}ina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK...............................73 DNK biblioteka.........................................................................................................................74 Zna~aj geneti~kog in`enjerstva..................................................................................................74 Umno`avaje fragmenata DNK pomo}u PCR -a ........................................................................76 Denaturacija dvolan~ane DNK..................................................................................................76 Hibridizacija prajmera sa matricom..........................................................................................77 Elongacija prajmera..................................................................................................................77 Taq polimeraza.........................................................................................................................77 Mogu}nost primene PCR metode.............................................................................................77 Lokacija gena ...........................................................................................................................79 Populaciona genetika ...............................................................................................................80 Geni i u~estalost genotipova ...................................................................................................80 Kodominantni aleli...................................................................................................................80 Hardy-Weinberg-ova ravnote`a................................................................................................81 Zadaci.......................................................................................................................................83 Stopa mutacije.........................................................................................................................85 Geneti~ki drift.........................................................................................................................85 Re{enja zadataka.....................................................................................................................86 Dodatak 1 - Geneti~ki kod.......................................................................................................94 Dodatak 2 - Strukturne formule dvadeset aminokiselina u proteinima .....................................95 Dodatak 3 - ]elijski ciklus .....................................................................................................96 Dodatak 4 - Mejoza.................................................................................................................98 Literatura...............................................................................................................................100 .

4

GENETIKA I Uvod Genetika je nauka koja prou~ava nasle|e u organskom svetu. Biolo{ko nasle|e omogu}ava pojavu sli~nosti i razlika izme|u predaka i potomaka. Sama re~ genetika vodi poreklo od ) - poreklo;ro|enje. gr~ke re~i “genesis”( Osniva~em genetike se smatra ~e{ki kalu|er Gregor Mendel (1822-1884).

Gregor Mendel Geneti~ka istra`ivanja, koja su otvarala put razvitka genetike, Mendel je izvodio na ba{tenskim biljkama- pasulju i gra{ku. Ukr{taju}i razli~ite oblike gra{ka i pasulja, on je nastojao da uo~i kako }e se nasle|ivati izvesne roditeljske osobine, koje lako mo`emo zapaziti, pa ih je zato lako i pratiti u nizu generacija. Takve osobine su, npr., boja, oblik i veli~ina ploda, boja i gra|a cveta itd. Izvod iz istorije genetike: 1865. Geni su partikularni ~inioci 1903. Hromozomi su nasledne jedinice 1910. Geni se nalaze na hromozomima 1913. Hromozomi sadr`e linearne nizove gena 1927. Mutacije su fizi~ke promene u genima

1931. Rekombinacija je izazvana crossing over-om 1944. DNK je geneti~ki materijal 1945. Gen kodira sintezu proteina 1953. DNK je dvostruki heliks 1958. DNK se replicira semikonzervativno 1961. Geneti~ki kod je triplet 5

GENETIKA I 1977. DNK mo`e biti sekvencirano 1997. Genomi mogu biti sekvencirani Nau~ne discipline genetike: 1. Prema nivou organizacije `ive materije: Molekularna genetika Citogenetika Genetika razvi}a Populaciona genetika 2. Prema objektu istra`ivanja: Genetika mikroorganizama Genetika biljaka Genetika `ivotinja Humana genetika 3. Prema kori{}enoj metodologiji: Genetika zra~enja Matemati~ka genetika Biohemijska genetika... 4. Prema na~inu primene: Kosmi~ka genetika Veterinarska genetika Poljoprivredna genetika Farmakogenetika Klini~ka(medicinska) genetika Demografska genetika Eugenika...

6

GENETIKA I

GREGOR MENDEL (1822(1822-1884)

Za one koji zele vise da znaju

♦ Johan Mendel je ro|en 1822. u selu Hajnzendorf (sada Hinois) u Severnoj Moraviji ♦ Otac mu je bio sitnosopstvenik koji je gospodaru pla}ao rentu obra|uju}i zemlju. ♦ Johan upisuje gimnaziju u Tropau pa univerzitet u Olmicu. ♦ Zbog finansijskih problema, Johan postaje fratar, uzev{i ime brat Gregor. ♦ Zavr{ava teolo{ku {kolu u Brinu (Brno) i postaje sve{tenik. ♦ Studirao je na Be~kom univerzitetu i poku{ao da postane u~itelj prirodnih nauka, ali bezuspe{no. ♦ Bio je dobar u matematici i {ahu. Pod o~evim uticajem, Gregor je postao pasionirani ba{tovan. ♦ U 34. godini zapo~inje seriju eksperimenata na gra{ku, u manastirskoj ba{ti. Ukr{ta razli~ite varijetete biljke gra{ka. Mendel odabira 7 parova varijeteta gra{ka za ukr{tanje. Ukr{ta gra{ak okruglog zrna sa sme`uranim; `utih kotiledona sa zelenim; sve`ih mahuna sa sme`uranim mahunama; sivih semenja~a sa belim semenja~ama, zelenih nezrelih mahuna sa `utim nezrelim mahunama; aksijalnih cvetova sa terminalnim cvetovima; visokih stabljika sa niskim stabljikama. On uspeva, na osnovu ranijeg rada, da predvidi rezultate. Dobijeni hibridi su bili kao jedan od roditelja, a posle samooplodnje hibrida u slede}oj generaciji se javila recesivna roditeljska karakteristika (koje nije bilo u prvoj generaciji hibrida-F1) u oko 1/4 slu~ajeva. ♦ Zatim Mendel eksperimenti{e na kukuruzu, fuksiji, i drugim biljkama. ♦ Negirao je mi{ljenje koje je vladalo tokom pro{log veka da stapanjem (prostim me{anjem) telesnih te~nosti roditelja nastaju potomci ~iji izgled nije mogu}e predvideti. Do{ao je do slede}eg zaklju~ka: Postoji ne{to stabilno, nedeljivo, kvantitativno i partikularno u srcu nasle|ivanja. Nema me{anja te~nosti, spajanja krvi, ve} samo privremenog spajanja mno{tva “kliker~i}a”.Ina~e kako bi se moglo objasniti da u jednoj familiji jedno dete mo`e da ima plave, a drugo sme|e o~i ♦ Mo`emo slobodno re}i da je Mendel dokazao “atomsku teoriju” biologije. ♦ Mendelov rad je {tampan 1866. godine, ali je ostao nepriznat do 1900. godine. ♦ Mendelovi zakoni nasle|ivanja su: I zakon- zakon razdvajanja (segragacije) osobina i naslednih ~inilaca i II zakon-Zakon slobodnog kombinovanja osobina i naslednih ~inilaca, usled slobodnog kombinovanja hromozoma pri }elijskoj deobi i pri oplo|enju gametima. 7

GENETIKA I ]elija Poznato je da je R. Hooke (1665) posmatrao mrtve }elije plute, pa ih je i opisao kao prazne prostore. Takva predstava o }eliji je kasnije odba~ena, jer je ve} bilo dokazano da je sadr`ina }elije vrlo bogata. 1831.godine R. Brown otkriva jedro. Tek otkri}em elektronskog mikroskopa, otkrivene su i ostale }elijske organele: ribozomi, endoplazmati~ni retikulum, Gold`ijev aparat, lizozomi, plastidi, mitohondrije, centrozom i citoskelet. Dugo su se nau~nici sporili oko definicije }elije. Danas }eliju naj~e{}e defini{emo kao osnovnu jedinicu gra|e i funkcije svakog `ivog organizma. ]elija je osnovna gradivna i funkcionalna jedinica svakog `ivog bi}a.

Gra|a }elije

`ivotinjska }elija

Pre upotrebe elektronskog mikroskopa pretpostavljalo se da sve }elije imaju iste osnovne principe organizacije. Naime bojenjem bakterijskih }elija Feulgenom(boja za DNK) uo~avala se centralna masa, pa se verovalo da sve }elije(biljne, `ivotinjske, pa i bakterijske) imaju jedro i unutra{nje odeljke. Tako|e sve }elije su pokazivale klju~ne metaboli~ke sposobnosti. Tek 8

GENETIKA I otkri}em elektronskog mikroskopa omogu}eno je detaljno prou~avanje unutra{nje strukture bakterijske }elije. ]elije danas po slo`enosti gra|e delimo na prokariotske i eukariotske. Prokariotske }elije su jednostavnije gra|e i od njih su izgra|ene bakterije i modrozelene alge (fotosinteti~ke bakterije). Ostali organizmi su eukarioti.

Osnovna razlika izme|u prokariotske i eukariotske }elije je u tome {to nasledni materijal prokariota nije izolovan od ostalog dela citoplazme posebnom membranom i {to nije organizovan u kompleksne hromozome. Kod eukariota materijal jedra je odvojen membranom od citoplazme. Tako|e kod eukariota je razvijen sistem membrana koje obrazuju brojne }elijske organele. Kod prokariota se javljaju samo tri }elijske diferencijacije: nukleoid(neorganizovano jedro), ribozomi i plazma-membrana(}elijska membrana). Palzmamembrana je sli~na plazma- membrani eukariota, ali je naj~e{}e obuhva}ena }elijskim zidom specifi~nog sastava. Plazma membrana je kod mnogih prokariota na raznim ta~kama uvijena ka unutra{njosti i kod fotosinteti~kih bakterija ovi izuvijani delovi sadr`e fotosinteti~ke pigmente i enzime. Drugi izuvijani delovi izgleda imaju ulogu u raznim aktivnostima }elije kao {to su respiracija i }elijska deoba i tada se nazivaju mezosomi. Ostale strukture se retko sre}u.

9

GENETIKA I Pretpostavlja se da je eukariotska }elija nastala usavr{avanjem prokariotske }elije. Nasledni materijal eukariotske }elije je obavijen posebnom membranom. Pored spolja{nje lipoproteinske membrane, biljne }elije obrazuju i celulozni zid. U eukariotskoj }eliji su se razvile brojne }elijske organele kojih nema kod prokariota.To su na primer endoplazmati~ni retikulum, mitohondrije,Gold`ijev aparat, lizozomi, kod biljaka plastidi itd. Zna~i eukariotska }elija se sastoji iz membrane (koja se sastoji iz lipida i proteina), citoplazme sa organelama i jedra.

]elijska membrana

]elijska membrana se sastoji od duplog sloja lipidnih molekula u koje su uronjeni razli~iti proteini. Kod svih eukariota pojedini proteini imaju kovalentno vezane lance oligosaharida. Proteini imaju ulogu prenosilaca(prenose specifi~ne molekule u }eliju i iz nje), receptora(prihvataju i oda{ilju hemijske signale iz okoline), enzima(katalizatora reakcija vezanih za membranu), ... Veruje se da oligosaharidi imaju ulogu u procesu }elijskog prepoznavanja.

Citoplazma CitosolCitosol- Deo citoplazme van }elijskih organela. U njemu se odvija najve}i deo metabolizma tokom koga }elija razla`e jedne molekule a stvara druge molekule (aminokiseline, {e}eri...) kao prekursore za makromolekule neophodne za strukturu, funkciju i rast }elije. Citosol je ispunjen enzimima. Citosol sadr`i niz razli~itih proteinskih vlakana koja odr`avaju oblik }elije i omogu}avaju njene pokrete. Ova vlakna predstavljaju }elijski skelet- citoskelet. citoskelet Zbog prisustva proteinskog citoskeleta, citosol predstavlja `elatinoznu masu.

]elijske organele Endoplazmati~ni retikulum Organela u obliku mre`e. Postoje 2 oblika endoplazmati~nog retikuluma: 10

GENETIKA I 1) Granulirani ER-na povr{ini membrane se nalaze ribosomi. 2) Agranulirani (glatki) ER- nema ribosome na svojoj povr{ini. Uloga ER: U ER se sinteti{u proteini (na ribozomima granuliranog ER) i to najvi{e sekretorni i oni koji ulaze u sastav }elijske membrane, lipidi, slo`eni ugljeni hidrati,...koji se dalje transportuju u druge organele. Gold`ijev aparat

Gold`ijev aparat je organela koja se sastoji iz niza vezikula okru`enih membranama. Membrane Gold`ijevog aparata su privremeno vezane za endoplazmati~ni retikulum. Iz ER sintetisani molekuli prelaze u Gold`ijev aparat, gde se modifikuju i usmeravaju ka odre|enom odredi{tu (sekretorni proteini se izbacuju u me|u}elijski prostor kada je }elija stimulisana specifi~nim signalom). Lizozomi Lizozomi su membranozne kesice koje sadr`e enzime koji se koriste u kontrolisanom unutar}elijskom varenju makromolekula(npr. proteaze, nukleaze,lipaze, glikozidaze,...). U ~oveka postoje brojni nasledni poreme}aji lizosomskog metabolizma. Primer je TaySachsovo oboljenje. Kod normalnih ljudi se konstantno sinteti{e i degradira glikolipid, gangliozid GM2, koji se nalazi u sastavu plazma- membrane mnogih sisarskih }elija, posebno nervnih. Kod osoba sa Tay-Sachsovim oboljenjem, zbog odsustva specifi~ne lizozomske hidrolaze, ovaj gangliozid se akumulira u mo`danim}elijama, {to dovodi do postepene retardacije, poreme}aja centralnog nervnog sistema i smrti. Mitohondrije

Ve}ina eukariotskih }elija sadr`i veliki broj mitohondrija. Mitohondrija se sastoji iz dvoslojne membrane, membrane od kojih unutra{nja membrana stvara veliki broj invaginacija ili krista, koje ulaze u centralni prostor ili matriks matriks. iks Na kristama se nalaze ~vori}i koji predstavljaju enzimske sisteme koji sinteti{u ATP iz ADP-a i Pi. Reakcije Krebsovog ciklusa se odigravaju u matriksu. Mitohondrije su dakle energetske stanice: u njima se obavlja proces }elijskog disanja i one obezbe|uju }eliji energiju za sve va`ne aktivnosti. U matriksu mitohondrija nalazi se mitohondrijalna DNK koja je cirkularna(poput bakterijske DNK) i sadr`i informaciju za nekoliko klju~nih mitohondrijalnih proteina kao i mitohondrijalne ribozome- koji se razlikuju(manji su) od robozoma citosola). Me|utim za ve}inu mitohondrijalnih proteina geneti~ka informacija se nalazi u DNK jedra, a njihova 11

GENETIKA I sinteza se obavlja na ribozomima citosola, nakon ~ega se transportuju u mitohondriju. Mitohondrije se dele nezavisno od }elijske deobe, usled ~ega (kao i cirkularnog oblika DNK) se veruje da su mitohondrije potomci aerobnih bakterija koje su unesene endocitozom u primitivne anaerobne organizme sa kojima su stupili u simbiozu. Centrozom Centrozom je }elijska organela koja se obi~no nalazi neposredno uz jedro i ima zna~ajnu ulogu u formiranju deobnog vretena. Izgra|en je od nekoliko parova cev~ica- centriola.U toku deobe, centrozom se podeli na dva dela koji migriraju na polove i izme|u njih se stvara deobno vreteno. Cvetnice ih ne poseduju. Ribozomi ]elijske ~estice koje se nalaze u citoplazmi svih }elija. Sastoje se od proteina i ribozomalne RNK(rRNK). Svaki ribozom se sastoji iz 2 subjedinice razli~ite veli~ine, koje se mogu razdvojiti centrifugiranjem. Ribozomi prokariota su veli~ine 70S, a eukariota 80S (vidi tabelu). Pri translaciji (vidi sintezu proteina), ~esto je po nekoliko ribozoma vezano za iRNK i oni ~ine poliribozom. Zna~i ribozomi u~estvuju u sintezi proteina. Na njima se redosled nukleotida u iRNK(informaciona RNK koja prenosi {ifru sa DNK) prevodi u redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu proteina. Plastidi Plastidi su citoplazmati~ne organele biljnih }elija, sa dvostrukom membranom. Po morfolo{kom izgledu i funkciji dele se na hromoplaste i leukoplaste. Hromoplasti sadr`e pigmente. Zeleni hromoplasti koji sadr`e hlorofil i karotenoide i obavljaju proces fotosinteze nazivaju se hloroplasti. Leukoplasti su bezbojni plastidi i u njima su uskladi{tene razne rezervne materije. Na primer leukoplasti koji sadr`e skrob nazivaju se amiloplasti. Plastidi su sposobni za samoreprodukciju. Hloroplasti Hloroplasti su karakteristi~ne biljne organele koje sadr`e hlorofil. Hloroplast je obavijen dvema membranama. Spolja{nja je po povr{ini glatka, a unutra{nja gradi izra{taje-tilakoide. Kra}i tilakoidi se pakuju u gomile, i ove gomile se nazivaju grana (mno`ina od granum). Osim granalnih, postoje i du`i, pojedina~ni tilakoidi izme|u susednih grana koji se zovu tilakoidi strome. Hlorofil je sme{ten u tilakoidima. Unutra{njost hloroplasta se naziva stroma. Svetla faza fotosinteze se odvija u tilakoidima, a tamna u stromi. Hloroplasti imaju sopstvenu DNK i dele se nezavisno od deobe }elije.

12

GENETIKA I

Hloroplast

Jedro (latinski- nucleus; gr~ki- karyon) Jedro eukariotske }elije je najupadljivija,velika, ~esto okrugla organela. Sadr`aj jedranukleoplazma, odvojen je od citoplazme jedrovim omota~em. Jedrov omota~ se sastoji iz dve membrane(svaka sadr`i dva sloja lipida) odvojene perinuklearnim prostorom. Spolja{nja membrana je povezana sa membranom granuliranog ER, gde se vr{i sinteza proteina. Unutra{nja membrana je povezana sa spolja{njom jedrovim porama. Sve RNK i ribozomi sinteti{u se u jedru, pa se prebacuju u citosol, dok se proteini koji funkcioni{u u jedru sinteti{u u citosolu pa prebacuju u jedro.Ova razmena se obavlja preko jedrovih pora. Jedrov omota~ je tako|e selektivno propustljiv. Nukleoplazma je gu{}a od citoplazme. U nukleoplazmi se nalazi hromozomska DNK, koja je povezana sa histonskim proteinima u hromozome. Hromozomi imaju karakteristi~an oblik i broj, tipi~an za svaku vrstu. U nukleoplazmi se nalazi i jedarce (nukleolus).

13

GENETIKA I Hromozomi Gotovo sva koli~ina DNK koju sadr`i svaka }elija `ivog organizma nalazi se u hromozomima. To zna~i da je u hromozome svake }elije ugra|en gotovo sav geneti~ki materijal organizma. Hromozomi eukariota su slo`enije gra|e od cirkularnih hromozoma prokariota.

Kariogram ~oveka

Hromozome je prvi uo~io Hofmeister (1848), a kao kon~aste strukture ih je opisao Strasburger (1875). Baranetzky (1880) je zapazio da su ovi konci spiralni, ali ih je imenom “hromozomi” nazvao tek Waldeyer (1888), zbog njihovog afiniteta prema bazi~nim bojama. Dugo se jo{, posle ovoga, samo nazirala njihova funkcija i veliki biolo{ki zna~aj. Osnovna obele`ja hromozoma su: veli~ina i oblik, broj, du`ina krakova i njihov odnos itd. Broj hromozoma u }eliji jedinke je stalan i karakteristi~an za svaku vrstu i u telesnim }elijama iznosi 2n, a u gametima( polnim }elijama) n. Tako se u procesu polnog razmno`avanja, spajanjem `enske i mu{ke polne }elije (svaka sa haploidnom garniturom hromozoma- n), posti`e diploidan broj hromozoma (2n), prisutan u svakoj telesnoj }eliji organizma.

14

GENETIKA I Oblici hromozoma

Metacentri~an hromozom

Centromera(su`enje)

Submetacentri~an

Satelit

Akrocentri~an

Sat- hromozom Telocentri~an

Razli~iti oblici hromozoma

Ve}ina autora hromozome razvrstava u 4 osnovne morfolo{ke kategorije. Klasifikacija je izvr{ena prema polo`aju obaveznog su`enja, nazvanog centromera. Kategoriji akrocentri~nih hromozoma pripadaju hromozomi kod kojih je centromera znatno pomerena ka jednom kraju, pa se kraci znatno razlikuju po du`ini. Kod metacentri~nih hromozoma, kraci su jednake ili pribli`no iste du`ine, {to zna~i da im se centromera nalazi pribli`no na sredini. Kod submetacentri~nih hromozoma kraci nisu jednake du`ine, ali je njihova razlika u du`ini znatno manja nego kod akrocentri~nih hromozoma. Telocentri~ni hromozomi imaju {tapi}ast oblik. Centromera im je postavljena sasvim na vrhu, te su bez jednog kraka. Sat- hromozomi su hromozomi koji poseduju okruglo ili izdu`eno tela{ce koje je preko sekundarnog su`enja spojeno sa ostalim delom hromozoma.

15

GENETIKA I Broj hromozoma Razli~ite vrste imaju svoj karakteristi~an broj hromozoma, {to je prikazano u tabeli.

Narodno ime

Vrsta

Broj hromozomskih parova (n)

^ovek Pas Ma~ka P{enica Krompir Konj Ku}ni mi{

Homo sapiens Canis familiaris Felis domesticus Triticum aestivum Solanum tuberosum Equus caballus Mus musculus

23 39 19 21 24 32 20

U telesnim }elijama po dva hromozoma su me|usobno sli~na-homologi hromozomi(jedan poti~e od majke, a drugi od oca) i zato je ukupan broj hromozoma 2n, 2n tj. n parova hromozoma. U gametima broj hromozoma je redukovan na n, tj. hromozomi su bez svog para. Kod ~oveka broj hromozoma u gametima je n=23, od ~ega su 22 hromozoma autozomi (hromozomi koji nose glavninu geneti~kih informacija i ne zavise od pola jedinke) a jedan je polni hromozom X ili Y. U telesnim }elijama garnitura je 2n=44+XX ili 2n= 44+XY.

Gra|a hromozoma Hromozomi se sastoje iz DNK, RNK, histonskih i nehistonskih proteina. Osnovna jedinica organizacije hromozoma je dezoksiribonukleoproteinsko(DNP) vlakno. Njegovu strukturu ~ini lanac DNK povezan sa histonima (vidi nivoi organizacije hromatina). Spiralizacijom DNP-a nastaje hromatinsko vlakno, koje se veoma kondenzuje u procesu }elijske deobe i postaje vidljivo pod mikroskopom u vidu hromozoma.

Bojenje hromozoma

p-kra}i krak hromozoma q-du`i krak hromozoma organizator nukleolusa- ima specifi~an polo`aj u setu hromozoma. Predstavlja sekundarno su`enje i sadr`i gene za rRNK. Njegov polo`aj je od velikog zna~aja za citogenetske analize. Jedarce(nukleolus) je vezano za organizator nukleolusa.

Tretiranjem hromozoma hemikalijama koje reaguju sa DNK, kao npr. Feulgen bojom, uo~avaju se regioni sa razli~itom obojeno{}u. Vrlo obojeni regioni se nazivaju 16

GENETIKA I heterohromatin,a slabo obojeni regioni euhromatin. Razlika se dovodi u vezu sa stepenom kompaktnosti, ili uvijanja DNK u hromozomu. Heterohromatin mo`e biti konstitutivan ili fakultativan. Konstitutivan tip je stalna karakteristika specifi~nog hromozomskog lokusa, dok se fakultativan tip ponekad ali ne i uvek nalazi na odre|enom hromozomskom lokusu. [are na hromozomu su dobri citogenetski markeri. Jedan od osnovnih tipova bojenja hromozoma je po Giemsu. Bojenjem se dobijaju svetliji regioni i tamniji regioni. Verovalo se da je razlika izme|u svetlih i tamnih regiona uslovljena razlikom u procentu baza: G-svetle trake su bogate GC- parovima, a G-tamne trake su bogate AT- parovima. Me|utim, ove razlike su naj~e{}e male da bi odredile {aru. Danas se zna da je klju~ni faktor pakovanje hromatina: G- tamniji regioni se gu{}e pakuju, pa je gustina DNK ve}a a time i obojenost regiona. Tako|e je otkriveno da su G- svetliji regioni genetski aktivni (sadr`e ve}inu aktivnih gena). Bojenje je omogu}ilo geneti~arima razlikovanje hromozoma HeterohromatinHeterohromatin predstavlja dobro obojene (tamnije) regione hromozoma koji su genetski neaktivni. EuhromatinEuhromatin predstavlja slabo obojene (svetlije) regione hromozoma. U njemu se nalaze aktivni geni. geni

17

GENETIKA I DNK (dezoksiribonukleinska (dezoksiribonukleinska kiselina) Iako je DNK prvi put izolovana 1869. godine, njenu detaljnu strukturu konstruisali su tek Votson i Krik 1953. Godine. @ivi organizmi u svom geneti~kom materijalu ili genomu1(izgra|enom od jednog ili vi{e molekula DNK) sadr`e informacije koje odre|uju primarnu strukturu proteina. Ove informacije se nalaze u redosledu nukleotida DNK.

Struktura DNK DNK je makromolekul koji se sastoji iz 4 vrste jedinica- nukleotida. Svaki nukleotid se sastoji iz: 1) {e}era dezoksiriboze 2) fosfatne grupe i 3) jedne azotne baze Azotne baze se dele na purinske (adenin-A i guanin- G) i pirimidinske (citozin- C i timin- T). U molekulu DNK, nukleotidi obrazuju 2 polinukleotidna lanca ili Votson- Krikovu spiralu (dupli heliks). Primarna struktura DNK predstavlja redosled nukleotida u molekulu DNK. Sekundarna struktura DNK predstavlja geometrijski model molekula u prostoru. DNK razli~itih vrsta razlikuje se po redosledu nukleotida i po veli~ini molekula. Baze, spojene vodoni~nim vezama po principu komplementarnosti

[e}eri i fosfatne grupe(naizmeni~no povezani)

1

Skup gena koji se nalazi u jednoj haploidnoj hromozomskoj garnituri naziva se genom. genom

18

GENETIKA I

Struktura DNK

Maksimalna stabilnost DNK molekula je obezbe|ena time {to se naspram adenina (A) uvek nalazi timin (T) , a naspram guanina (G) citozin (C). A i T su me|usobno vezani sa 2, a G i C sa 3 vodoni~ne veze. Time je obja{njeno ^argafovo pravilo da u molekulima DNK razli~itih vrsta postoji jednak odnos A i T, G i C, kao i izme|u purinskih i pirimidinskih baza (A+G = T+C). Osnovni princip na kome se zasniva model sekundarne strukture DNK je princip komplementarnosti izme|u A i T, kao i izme|u G i C. Zbog toga redosled baza u jednom lancu automatski odre|uje redosled baza u drugom. Dva lanca me|u sobom nisu identi~na, ve} komplementarna i antiparalelna2.

2

To zna~i da se naspram 5’ kraja jednog lanca(kraj na kome se nalazi fosfatna grupa), nalazi 3’ kraj drugog( kraj na kome se nalazi OH grupa dezoksiriboze). 19

GENETIKA I

Baze

20

GENETIKA I Drosophila melanogaster

ZADACI: 1.Ako se u fragmentu jedne vrpce DNK nalazi slede}i poredak nukleotida: ATCCGTACAGAT, kakav }e poredak nukleotida biti u odgovaraju}em delu druge, komplementarne vrpce? 2. Ako je sadr`aj GC parova u specifi~nom DNK molekulu 56% , koja je procentualna zastupljenost za svaku od baza (A, T, G i C) u ovom molekulu? 3. Ako je sadr`aj AT parova u specifi~nom DNK molekulu 20%, kolika je procentualna zastupljenost citozina i adenina u istom molekulu? 4°. Ako timin ~ini 15% od ukupnog broja baza u specifi~nom molekulu DNK, koja je procentualna zastupljenost citozina? 5.Ako je procentualna zastupljenost T u jednom lancu DNK 32%, kolika je zastupljenost A u komplementarnom lancu? * 6 . Ako je procentualna zastupljenost citozina u jednom lancu DNK 24%, adenina 18%, a guanina 20 %, koja je zastupljenost za svaku od baza u komplementarnom lancu? 7. Procentualna zastupljenost timina u jednom lancu DNK 30%, citozina 40%, dok je u komplementarnom lancu zastupljenost citozina 15% . Na}i zastupljenost guanina i adenina u prvom lancu, kao i zastupljenost istih baza u komplementarnom lancu. 8. Na planeti Zedon DNK se sastoji iz 6 vrsti nukleotida: A, B, C, D, E i F. A i B su nazvani marzini, C i D su orzini, a E i F pirini. Slede}a pravila va`e za zedonsku DNK: Ukupni marzini= ukupnim orzinima= ukupnim pirinima A= C= E B= D= F Ako je procentualna zastupljenost nukleotida D u specifi~noj zedonskoj DNK 20%, odredi procentualnu zastupljenost za svaku od baza. Sta mislis, kakva bi bila struktura zedonske DNK? 9. Na planeti Menex DNK se sastoji iz 9 nukleotida: A, B, C, D, E, F, G, H i J. A, B i C su drizdini; D, E i F gacini; G, H i J flumini. Slede}a pravila va`e za DNK na planeti Menex: Ukupni drizdini= ukupnim gacinima= ukupnim fluminima A= D= G B= E= H C= F= J Ako je procentualna zastupljenost nukleotida A u specifi~noj menexskoj DNK 10 %, a nukleotida H 5%, na|i procentualnu zastupljenost za svaku od baza (A, B, C, D, E, F, G, H i J) u ovom molekulu menexske DNK. 10. Ako jedan lanac specifi~ne DNK sadr`i 20% A, a njemu komplementarni lanac 10% C i 5% G, na}i zastupljenost za svaku od baza u tom molekulu DNK. DNK

21

GENETIKA I Nivoi organizacije hromatina Pojedina~ni hromozomi dobijaju svoje tipi~ne kondenzovane oblike samo za vreme deobe }elije (M faza }elijskog ciklusa). Za vreme interfaze (period izme|u 2 mitoze), kada se DNK ne replikuje, hromozomi se difuzno rasipaju u hromatin i ne mogu se pojedina~no razlikovati. Hromatin se sastoji iz DNK, proteina i male koli~ine RNK. Postoje 2 tipa hromatina: euhromatin (7- 10% ukupnog hromatina), manje zbijen i heterohromatin (90% hromatina), koji je ja~e zbijen. Ova 2 tipa hromatina se me|usobno razlikuju i po tome {to se euhromatin genetski eksprimira (aktivan u transkripciji), dok se heterohromatin ne eksprimira (nije aktivan u transkripciji). U hromatinu (hromozomima) DNK je vezana za proteine. Postoje 2 grupe ovih proteina: histoni (bazni jedarni proteini) i nehistonski (kiseli) proteini. Histoni ~ine vi{e od polovine mase hromatina. Postoji 5 glavnih klasa ovih proteina: H1, H2A, H2B, H3 i H4. Oni se vezuju za fosfatne grupe DNK. Redosled aminokiselina u histonima H2A, H2B, H3 i H4 poseduje visoku evolutivnu stabilnost, tj. Malo se menjao u toku evolucije ( npr. H4 histoni krave i gra{ka, vrsta koje su se razdvojile pre 1,2 milijarde godina, razlikuju se samo u 2 promenjene aminokiseline). H1 histoni su znatno varijabilniji od ostalih histona. Sinteza histona se vr{i za vreme sinteze DNK. U organizaciji hromatina postoji vi{e nivoa. Prvi nivo organizacije hromatina ~ine nukleozomi( kompleksi DNK- histoni). Tako se pakovanjem u nukleozome smanjuje zapremina molekula DNK. Drugi nivo spiralizacije DNK predstavljaju tzv. Solenoidne strukture koje se sastoje od gusto pakovanih nukleozoma. Naime nukleozomi se namotavaju u hromatinske niti koje sadr`e 6 nukleozoma po navoju. U tre}em nivou organizacije hromatina, niti formiraju petlje. Pakovanjem DNK u nukleozome, hromatinske niti i petlje ne posti`e se kona~an stepen kondenzacije DNK. To ukazuje na postojanje jo{ vi{ih nivoa organizacije hromatina.

22

GENETIKA I Dvolan~ana zavojnica DNK Perlasta nit hromatina od nukleozomskih paketa Hromatinska nit od nukleozomskih paketa

Hromatinska nit savijena u petlje

Kondenzovani deo hromozoma

Metafazni hromozom

[ematski prikaz razli~itih nivoa organizacije hromatina

DNK

Oktamer histona (H2A, H2B, H4 i H3)

H1 Oktamer histona

DNK Histon H1

[ematski prikaz strukture jezgra nukleozoma

Model hromatinske niti (aksijalni presek)

23

GENETIKA I Replikacija DNK Replikacija (duplikacija) DNK predstavlja udvajanje molekula DNK uz prisustvo odgovaraju}ih enzima, ~ime se dobija identi~na kopija originalnog geneti~kog materijala. Pri replikaciji svaki lanac DNK slu`i kao kalup za sintezu komplementarnog lanca. Tako nastaju dva molekula DNK }erke, u kojima po jedan lanac poti~e od roditeljske DNK. Po{to ovim mehanizmom potomci zadr`avaju polovinu geneti~kog materijala roditelja, on je nazvan semikonzervativnim (polukonzervativnim). Kod eukariota se replikacija DNK vr{i u interfazi }elijskog ciklusa i to u S fazi. Pre nego {to su Matthew Meselson i Franklin Stahl dokazali semikonzervativni na~in replikacije DNK (hipotezu Votsona i Krika), postojale su jo{ hipoteze i o konzervativnom kao i o disperzivnom na~inu replikacije DNK. Kod konzervativnog na~ina replikacije molekul DNK jedne }erke bi sadr`ao oba novosintetisana lanca, dok bi drugi molekul DNK tj. “druga }erka “ustvari bio roditelj (sadr`i oba stara lanca). Kod disperzivne replikacije }erke molekuli bi se sastojale iz segmenata roditeljske DNK, kao i novosintetisane DNK.

Semikonzervativni na~in replikacije

Konzervativni

Disperzivni

Tri hipoteze replikacije DNK

Mezelson-- Stalov eksperiment Mezelson Hipotezu Votson i Krika (o semikonzervativnom na~inu replikacije DNK) eksperimentalno su potvrdili 1957. Godine Mezelson i Stal. Po{to su uzgajali }elije E. coli nekoliko generacija u sredini gde je jedini izvor azota bio amonijum hlorid, ~iji je azot bio radioaktivno obele`en(15N), svi azotni sastojci ovih }elija, uklju~uju}i i DNK, sadr`avali su “te{ki” azot 15 N umesto normalnog 14N. Te{ka DNK izolovana iz ovako pripremljenih bakterija ima znatno ve}u gustinu od normalne (lake) DNK, pa se mo`e od nje razdvojiti centrifugovanjem u gradijentu gustine cezijum hlorida (CsCl). Posle mnogo }elijskih deoba bakterija uzgajanih na radioaktivnom azotu, DNK ovih }elija je sadr`ao u svojoj DNK te`ak azot. Zatim su takve }elije preba~ene u medijum sa “normalnim”(lakim) azotom 14N. Posle jedne i 2 }elijske deobe uzeti su uzorci. DNK je ekstrahovan iz }elija oba uzorka i stavljen u rastvor CsCl u ultracentrifugu. DNK izolovana iz 24

GENETIKA I }elija posle jednog generacijskog vremena rasta (vreme za koje se broj }elija udvostru~io), pokazivala je jednu traku na sredini izme|u neobele`ene 14N- DNK i obele`ene 15N- DNK. Ovaj rezultat mogao se i o~ekivati ako DNK }elija }erki sadr`i jedan 15N- obele`en (roditeljski) i jedan novosintetisan (neobele`en) lanac. Posle 2 generacije (2. Uzorak) rasta u medijumu koji je sadr`avao 14NH4Cl, izolovana DNK je imala 2 trake u gradijentu gustine. Jedna traka je imala gustinu kao neobele`ena(14N) DNK, a druga kao hibridna DNK( DNK koja sadr`i jedan lanac 14N- DNK i drugi lanac 15N- DNK) koja je prisutna posle prve generacije. Ovi rezultati potpuno potvr|uju Votson- Krikovu hipotezu o semikonzervativnom na~inu replikacije DNK. Replikacija DNK u }elijama eukariota se tako|e obavlja semikonzervativnim mehanizmom {to je dokazao Tejlor sa saradnicima na }elijama korena gra{ka. Kontrole

Prva generacija

Druga generacija

14

NDNK 15

NDNK

F2 generacija, formiraju se 2 laka i 2 hibridna lanca

Roditeljska “laka” DNK(2 laka lanca) Hibridna DNK(F1 generacija, obe Roditeljska “te{ka” DNK(2 te{ka lanca) hibridne DNK sadr`e po jedan te`ak i jedan lak lanac)

Op{ti pregled replikacije DNK Replikacija DNK po~inje na odre|enom mestu molekula koji se zove replikativni po~etak. Mesta na hromozomu na kojima se replikacija odvija imaju imaju oblik slova “Y” i nazvana su replikativne vilju{ke. U toku replikacije uvek postoje 2 replikativne vilju{ke. Dvostruka DNK se replikuje tako {to se razdvoje 2 roditeljska lanca koji tada postaju kalupi za sintezu komplementarnog lanca. Zatim se sinteti{e RNK prajmer koji se vezuje za specifi~an deo DNK matrice (kalupa) na kome po~inje replikacija. Posle vezivanja prajmera uz pomo} enzima DNK polimeraze istovremeno se naspram kalupa ugra|uju komplementarni nukleotidi koji obrazuju novosintetisani lanac DNK. Kao rezultat nastaju dva molekula DNK}erke, od kojih svaka sadr`i po jedan stari lanac i jedan novosintetisani. Replikacija DNK tj. ugradnja komplementarnih nukleotida se odvija uvek u 5’- 3’ smeru3, a razlikujemo vode}i i zaostaju}i lanac. Vode}i lanac se sinteti{e kontinuirano (neisprekidano), dok se lanac koji zaostaje sinteti{e diskontinuirano tj. u isprekidanim deli}ima- segmentima koji se nazivaju Okazaki fragmenti. DNK polimeraza nadogra|uje nukleotidima Okazaki fragmente i uklanja RNK prajmere susednih fragmenata. Najzad DNK ligaza slepljuje fragmente novosintetisane DNK. U replikaciji DNK u~estvuje oko 20 enzima i drugih proteina. Me|u njima najzna~ajniji su: 1) DNK polimeraza I koja osim {to ugra|uje komplementarne nukleotide ima i sposobnost korekture gre{aka u toku sinteze novog lanca DNK (zamenjuje pogre{no uba~ene 3 Odvijanje replikacije u 5’- 3’ smeru zna~i da DNK polimeraza ugra|uje komplementarne nukleotide uvek za slobodnu 3’- OH grupu prethodno sintetisanog oligonukleotida.

25

GENETIKA I nekomplementarne nukleotide), kao i mnoge druge funkcije. Postoje i polimeraza II i III, koje uglavnom imaju istu ili sli~nu funkciju kao polimeraza I. 2) DNK helikaze se kre}u du` jednog ili drugog lanca DNK i kidaju vodoni~ne veze uz hidrolizu ATP. 3) SSB proteini spre~avaju ponovno vezivanje razdvojenih lanaca DNK. 4) Topoizomeraze uklanjaju supernavoje dvolan~ane zavojnice DNK i spre~avaju ponovno uvrtanje. 5) primaze. Po{to DNK polimeraze mogu obavljati elongaciju4 lanca DNK, ali ne i zapo~eti komplementarni lanac, sinteza lanca DNK mora biti zapo~eta prajmerom5. RNK prajmere sinteti{e ili RNK polimeraza ili primaza. Primaza sinteti{e kratak RNK lanac koji je komplementaran specifi~nom regionu na DNK. Zatim se RNK lanac pro{iruje nadovezivanjem DNK nukleotida pomo}u DNK polimeraze. 6) DNK ligaza- enzim koji katalizuje formiranje fosfodiestarske veze na mestu prekida jednog lanca DNK, tj. spaja (slepljuje) izprekidane delove lanca DNK.

Vode}i lanac

DNK polimeraza Topoizomeraza

Helikaza Primaza Prajmer

Okazaki fragment Zaostaju}i lanac

Replikacija DNK

4

Elongacija lanca DNK predstavlja ugradnju nukleotida na 3’ kraj. Kod replikacije DNK nakon vezivanja prajmera za matricu, DNK polimeraza dodaje nukleotide komplementarne sa matricom na 3’ kraj prajmera. 5 Prajmer je kratak oligonukleotidni lanac na ~iji 3’ kraj DNK polimeraza dodaje nukleotide u procesu ekstenzije (dodavanje nukleotida na 3’ kraj) prajmera. 26

GENETIKA I Kalupi Zaostaju}i lanac Vode}i lanac

Sinteza zaostaju}eg lanca

RNK prajmer komplementaran specifi~nom segmentu DNK matrice

Novosintetisana DNK Okazaki fragment

DNK polimeraza je uklonila prajmer i sintetisala umesto njega DNK komplementarnu matrici.

Slepljivanje uz pomo} ligaze

27

GENETIKA I Genetski kod i sinteza proteina Koli~ina DNK u haploidnom genomu je veli~ina koja je karakteristi~na za svaku vrstu i ozna~ava se kao C- vrednost. Logi~no je o~ekivati da sa morfolo{kom slo`eno{}u organizama raste njihova C- vrednost. Me|utim, neki organizmi jednostavne gra|e imaju vi{u C- vrednost od mnogih morfolo{ki slo`enijih organizama (paradoks C- vrednosti). Funkcija ovog “vi{ka” DNK nije poznata. DNK ima slo`enu infrastrukturu. Osim jedinstvenih nizova( nizovi nukleotida koji su u haploidnom genomu zastupljeni u samo jednoj kopiji), kod DNK ve}ine organizama zastupljeni su i nizovi koji se ponavljaju: intermedijarni i satelitski nizovi. Jedinstvenim nizovima pripada najve}i broj strukturnih gena (geni koji kodiraju sintezu proteina). Intermedijarnim nizovima pripadaju na primer geni rRNK, tRNK i 5S RNK. Jedinice satelitske DNK se ponavljaju i do vi{e miliona puta uzastopno. Satelitska DNK se ne transkribuje. RNK(ribonukleinska kiselina) RNK su makromolekuli koji su za razliku od DNK jednolan~ani, kra}i i raznovrsniji u jednoj }eliji ili organizmu od DNK. Molekuli RNK su gra|eni od ~etiri nukleotida Nukleotid RNK se sastoji iz 3 jedinjenja: 1) fosfatna grupa 2) {e}er: riboza timina) 3) 1 azotna baza( purinske: adenin, guanin ; pirimidinske: citozin, uracil-umesto uracil Komplementarni nukleotidi su AU i GC. Molekuli RNK nastaju po geneti~koj {ifri i u~estvuju u sintezi proteina. Po ulozi koju imaju u sintezi proteina RNK se deli na: 1) informacionu RNK (iRNK) iRNK ima ulogu prenosioca geneti~ke informacije. Na osnovu redosleda nukleotida u molekulu iRNK procesom translacije se stvara specifi~ni polipeptidni lanac sa odgovaraju}im redosledom aminokiselina. 2) ribozomalnu RNK (rRNK) rRNK predstavlja skup molekula RNK (5S, 7S, 28S- u ve}im ribozomskim subjedinicama kod eukariota i 18S u manjim ribozomskim subjedinicama kod eukariota) koje se nalaze u sastavu ribozoma. 3) transportnu RNK (tRNK) Molekuli tRNK su najmanji molekuli RNK. Transportne RNK vr{e preno{enje aminokiselina u procesu sinteze proteina. One imaju ulogu “prevodioca” geneti~kih {ifri tj. ulogu adapterskih molekula. Svojim antikodonom ~itaju kodone u iRNK i donose odgovaraju}e aminokiseline na mesto formiranja peptidne veze. Za svaku od 20 aminokiselina koje ulaze u sastav proteina postoji bar jedna specifi~na tRNK. Za preno{enje nekih aminokiselina postoji i ve}i broj tRNK. Sve tRNK koje pokazuju specifi~nost prema jednoj aminokiselini nazivaju se izoakceptorske tRNK. Gen Gen je deli} hromozoma koji se sastoji iz odre|enog dela lanca DNK( ili re|e RNK). Ima odre|eni polo`aj, specifi~nu strukturu (sastoji se iz odre|enog redosleda nukleotida), kao i odre|enu funkciju. Gen nosi geneti~ku {ifru (koja je zapisana redosledom nukleotida u DNK)

28

GENETIKA I za sintezu 1)polipeptidnog lanca odnosno proteina6, 2) tRNK,3) rRNK. U }eliji se redosled nukleotida prevodi u ta~an redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. Gen se sastoji iz kodiraju}ih delova (egzona), koji u~estvuju u sintezi proteina (sa njih se ~ita redosled nukleotida), koji su ispresecani nekodiraju}im delovima- intronima. Introni ne nose {ifru za sintezu proteina i sa njih se ne o~itava redosled nukleotida. Geni koji sadr`e introne nazvani su diskontinuirani.

Egzon2 Egzon 1

Intron B

Egzon 3

Intron A

DNK

RNK primarni traskript(prepis) iRNK

[ematski prikaz diskontinuiranog gena

Geneti~ki kod i sinteza proteina

Kao {to je re~eno, {ifra za sintezu proteina je zapisana u molekulima DNK tj. genima brojem i redosledom nukleotida. Po 3 uzastopna nukleotida ~ine triplet ili kodon i predstavljaju {ifru za odre|enu aminokiselinu. Broj kodona iznosi 43= 64, tako da zbir svih kodona predstavlja geneti~ki kod ili geneti~ku {ifru i ona je univerzalna (univerzalnost geneti~kog koda zna~i da 1 kodon odre|uje uvek istu aminokiselinu u }elijama svih `ivih bi}a). Sinteza proteina odvija se u citoplazmi }elije a geneti~ka {ifra- geni nalaze se u hromozomima. Zato se proces sinteze proteina odvija u 2 faze: 1) Transkripcija (odvija se u jedru) tj. prepisivanje {ifre sa DNK tj. gena na iRNK

6

gen koji kodira jedan polipeptidni lanac se naziva CISTRON. 29

GENETIKA I 2) Translacija (odvija se u citoplazmi na ribozomima) tj. prevo|enje {ifre za sintezu polipeptidnog lanca sa iRNK u redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu.

Transkripcija Transkripcija predstavlja sintezu molekula iRNK na matrici DNK. Transkripcija ili prepisivanje se ostvaruje komplementarnim vezivanjem slobodnih ribonukleotida(nukleotida RNK) na nukleotide odgovaraju}eg dela DNK. Sinteza ovog lanca RNK koji je komplementaran matrici (kalupu) je katalizovana enzimom RNK polimeraza.

DNK sekvenca : 3’-G-A-A-C-T-5’ transkript: 5’-C-U-U-G-A-3’ RNK polimeraza zapo~inje sintezu RNK posle vezivanja za specifi~an niz nukleotida koji se nalazi u okviru regiona DNK nazvanog promotor(npr. 10bp pre startne ta~ke inicijacije kod promotor bakterijskog gena nalazi se sekvenca TATAATG). TATAATG Postoje 3 stupnja transkripcije: 1) inicijacija (zapo~injanje) 2) elongacija i 3) terminacija (svr{etak) Na osnovu najnovijih saznanja o mehanizmu transkripcije u eukariotskim }elijama, formulisan je model po kome napredovanje enzima RNK polimeraze dovodi do destabilizacije nukleozoma ispred enzima i favorizovanja ponovnog formiranja nukleozoma iza enzima.

30

GENETIKA I Histonski oktamer

RNK polimeraza

transkript RNK

Model transkripcije DNK u nukleozomu

Neposredni proizvod transkripcije naziva se prekurzorska RNK (pre- RNK) ili primarni traskript. Primarni transkript je izgra|en od nukleotida RNK koji su u potpunosti komplementarni sa DNK matricom. Prema tome, u primarni transkript su osim kodiraju}ih delova gena (egzona) prepisani i nekodiraju}i delovi gena (introni) koji ne nose {ifru za sintezu proteina. Da bi se dobila kona~na funkcionalana RNK sa koje }e se o~itavati {ifra za sintezu polipeptidnog lanca, prvo se odstranjuju nekodiraju}i delovi. Posttranskripciona obrada predstavlja skup svih enzimskih reakcija pomo}u kojih se primarni transkript pretvara u

31

GENETIKA I funkcionalni molekul RNK. Introni se iskrajaju u jedru. Oni se isecaju 7, zatim se egzoni me|usobno povezuju, grade}i funkcionalnu iRNK. Ovaj proces se naziva iskrajanje gena.

Geneti~ki kod Geneti~ke informacije se nalaze u redosledu nukleotida u DNK. Geneti~ki kod je odnos koji postoji izme|u redosleda baza u DNK (ili njegovog transkripta iRNK) i redosleda aminokiselina u proteinima. Geneti~ki kod je, kao {to je ve} re~eno, univerzalan, tako da se jedan redosled nukleotida mo`e prevesti u isti polipeptidni lanac u svim }elijama, od bakterijskih do sisarskih. Na primer, niz nukleotida u nekoj iRNK GCUGGUAAG... bi}e uvek preveden u niz aminokiselina ala- gly- lys-... Geneti~ki kod je degenerisan ili izro|en, po{to za jednu aminokiselinu postoji vi{e kodona. Postoje 3 stop kodona (UAA, UAG, UGA) koja ne odre|uju nijednu aminokiselinu. Oni predstavljaju znak za kraj sinteze polipeptidnog lanca. DRUGO SLOVO T R E ] E S L O V O

P R V O S L O V O

Geneti~ka {ifra (kod)

ZA ONE KOJI ZELE VISE DA ZNAJU:

Osim jedarne DNK, izvesne organele imaju sopstvenu DNK(npr. Mitohondrije i hloroplasti). Na slici je dat prikaz geneti~kog koda ljudske mitohondrije. Kao {to prime}ujete u nekim slu~ajevima ti kodovi se razlikuju(slu~ajevi u kojima se nuklearni kod razlikuje su navedeni u zagradama). Mitohondrijalni geneti~ki kod se razlikuje u razli~itim vrstama tj. NIJE UNIVERZALAN.

7

Utvr|eno je da introni uvek po~inju sa GU na 5’ kraju (donori) a zavr{avaju se sa AG na 3’ kraju (akceptori). Grani~ni nizovi (donori i akceptori) su evolutivno o~uvani nukleotidi i predstavljaju signale za isecanje introna. 32

GENETIKA I DRUGO SLOVO P R V O

T R E ] E

S L O V O

S L V O

Mitohondrijska DNK je cirkularna i uglavnom sadr`i gene za sintezu rRNK, tRNK i subjedinice proteina povezanih sa proizvodnjom mitohondrijskog ATP-a . [to se ti~e nasle|ivanja gena i mutacija organela, organele se nalaze u citoplazmi,a po{to su kod ~oveka gameti razli~ite veli~ine (jajna }elija je mnogo ve}a od spermatozoida) smatra se da sva citoplazma, pa i organele poti~u od majke. Ovaj tip nasle|ivanja se naziva materinsko nasle|ivanje. Translacija (Biosinteza proteina) Translacija je zavr{na faza u realizovanju geneti~ke informacije. Termin translacija ozna~ava prevo|enje, po{to se redosled nukleotida u iRNK prevodi u redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu. Biosinteza proteina odvija se na ribozomu na kome se nalazi iRNK. Ulogu “prevodilaca” igraju tRNK, koje se svojim antikodonima vezuju za kodone u iRNK, nose}i sa sobom odgovaraju}u aminokiselinu. U jedan ribozom mogu istovremeno da stanu dve tRNK, pa se izme|u susednih aminokiselina vezanih za njih stvara peptidna veza. Tada jedna tRNK napu{ta ribozom, a njega ulazi slede}a, nose}i aminokiselinu ~iji je kodon na redu za prevo|enje. Tako se aminokiseline ugra|uju u polipeptidni redosled koji im odre|uje niz kodona u iRNK, koji je, sa svoje strane, kopija redosleda nukleotida u odgovaraju}em strukturnom genu za dati polipeptid.

33

GENETIKA I Stvara se peptidna veza izme|u aminokiselina aminokiselina

ribozom tRNK sti`e tRNK odlazi

antikodon tRNK

iRNK

Kodon (3 nukleotida)

Translacija

34

GENETIKA I

ZADACI: Replikacija: 11. Kakvi bi bili rezultati Mezelson- Stalovog eksperimenta kod konzervativnog na~ina replikacije. Objasni slikom. 12.Sta je prajmer i zasto je on neophodan u DNK replikaciji? Transkripcija: 13. Napisati primarni transkript slede}eg segmenta DNK: AGCCTAATCACAG 14. Napisati primarni transkript kao i iRNK koja je dobijena posle posttranskripcione obrade za slede}i segment DNK (obele`eni su egzoni i introni): AT CAGATTCGTC ACTG

egzon

intron

egzon

Translacija 15. Pretpostavimo da odre|eni deo gena (tj. fragment jednog lanca DNK) ima slede}u strukturu, odnosno poredak trijada nukleotida: TTT- CGG- TAC- GGC- CAC. Konstrui{i: 1) strukturu iRNK 2) Aminokiselinsku strukturu dela proteina koji }e se sintetisati na osnovu navedenog dela gena. 16. Dopuni tabelu: C DNK dupli T G A heliks C A U iRNK(mRNK) G C A Odgovaraju}i tRNK antikodon Aminokiseline Trp ugra|ene u protein 17. Utvr|eno je da se jedan fragment odre|enog enzima sastoji iz slede}ih aminokiselina: Pro- Glu- Asp- Ile- Val. Konstrui{i: 1) Nukleotidni sastav fragmenta molekula DNK (jedne vrpce) koji je determinisao sintezu gornjeg proteinskog fragmenta. 2) Nukleotidni sastav iRNK i fragmenta tRNK (antikodoni) koji su poslu`ili kao posrednici u sintezi navedenog proteinskog fragmenta. 18. Ako se redosled aminokiselina u polipeptidnom lancu promenio iz Gly- Asn- His- Gln- Leuu Gly- Lys- His- Gln- Leu, na}i promenu koja se ostvarila u nukleotidnom sastavu odgovaraju}eg gena. 35

GENETIKA I 19. Dat je fragment iRNK kao i struktura dela proteina koji }e se sintetisati na osnovu navedenog dela iRNK. A ↓CGA- UCG- GAA- CCA- CGU- GAU- AAG- CAUArg- Ser- Glu- Pro- Arg- Asp- Lys- HisNapisati novu aminokiselinsku strukturu koja }e se dobiti kao posledica dodatka adenina (A) na po~etak navedenog fragmenta iRNK. ° 20 . Adicijom (dodatkom) 1 nukleotida i delecijom (izbacivanjem) 1 nukleotida, menja se sekvenca proteina iz His- Thr- Glu- Asp- Trp- Leu- His- Gln- Aspu His- Asp- Arg- Gly- Leu- Ala- Thr- Ser- Asp-. Koji je nukleotid dodat, a koji izba~en? ° 21 . Dodatkom 1 nukleotida i izbacivanjem 1 nukleotida, menja se sekvenca proteina iz Lys- Ser- Pro- Ser- Leu- Asn- Ala- Ala- Lysu Lys- Val- His- His- Leu- Met- Ala- Ala- Lys- . Koji je nukleotid dodat, a koji izba~en? 22*. Vi prou~avate gen E. coli koji sinteti{e specifi~an protein. Deo sekvence tog proteina je: - Ala- Pro- Trp- Ser- Glu- Lys- Cys- HisOtkrili ste seriju mutanata kod kojih ovaj protein ne pokazuje enzimsku aktivnost. Nakon {to ste izolovali proteine iz ovih mutanata, na{li ste slede}e sekvence: Mutant 1 - Ala- Pro- Trp- Arg- Glu- Lys- Cys- HisMutant 2 Ala- ProMutant 3 - Ala- Pro- Trp- Phe- Phe- Thr- Cys- His-. Na|ite molekularnu osnovu za svaku ovu mutaciju.

36

GENETIKA I Mendelovi zakoni nasle|ivanja G. Mendel (1866) je otkrio osnovne principe (zakone) nasle|ivanja, na kojima se zasniva obja{njenje da postoje posebni nasledni ~inioci, partikularne prirode, koji kontroli{u razvi}e osobina. On je negirao mi{ljenje koje je vladalo tokom pro{log veka da prostim me{anjem telesnih te~nosti roditelja nastaju potomci ~iji izgled nije mogu}e predvideti. Pre nego {to se upustimo u analizu Mendelovih eksperimenata, razjasni}emo neke osnovne pojmove iz genetike koji }e se pominjati u daljem izlaganju. Pojam biolo{kog nasle|a. Biolo{ko nasle|e predstavlja proces koji obezbe|uje sli~nost izme|u predaka i potomaka. Ono osigurava postojanost vrste u prirodi. Pojam biolo{kog svojstva. Svaku jedinku karakteri{e veliki broj razli~itih osobina. Te osobine su oblik, veli~ina, gra|a, funkcije i hemijski sastav tela. Prema pona{anju u procesima nasle|ivanja, biolo{ka svojstva delimo na alternativna i fluktuiraju}a. Alternativna svojstva (osobine) su ona koja se isklju~ivo dejstvom spolja{njih faktora izrazito ne menjaju od generacije do generacije. Ove osobine su zato pogodne za pra}enje iz generacije u generaciju. Kategorija fluktuiraju}ih svojstava obuhvata one osobine koje, pod dejstvom spolja{nje sredine, znatno variraju od jednog do drugog pokolenja. Zato su ove osobine, kao test za izu~avanje zakona nasle|ivanja, nepodesne. Istra`ivanja su pokazala da se mnoga biolo{ka svojstva grupno nasle|uju. Njihovi geni (supergeni) se dr`e zajedno uprkos centrifugalnim silama geneti~kih rekombinacija. Broj tih nezavisnih grupa odgovara haploidnom broju hromozoma u gametima. Svojstva koja pripadaju jednoj zajedni~koj grupi se zajedno nasle|uju i ozna~ena su kao korelativna, a taj oblik nasle|a kao korelativno nasle|e. S geneti~kog aspekta organizam je kombinovan od 2, me|usobno zavisne komponente: 1. Genotip. Geneti~ka konstitucija tj. alelogenski sastav naslednog materijala u odre|enom `ivom sistemu, koji uslovljava fizi~ki izgled, fenotip tog sistema. Nasledna osnova organizma. 2. Fenotip. Sveukupnost osobina koje karakteri{u jedan organizam. Ne odnosi se samo na morfolo{ke odlike jedinki, ve} isto i na karakteristike koje ozna~avaju sposobnost jedinki da obave neku radnju, na fiziolo{ke ili biohemijske odlike pojedinih procesa. Fenotip se u u`em smislu odnosi na izgled (i variranje) jedne odre|ene osobine (npr. oblik zrna gra{ka, boja o~iju ljudi...). Homologi hromozomi. hromozomi Hromozomi koji sadr`e identi~ne genske lokuse, iako je mogu}e da se na tim lokusima nalaze razli~iti alelski oblici. Kod diploidnih organizama, npr. ~oveka hromozomi se pojavljuju u homolognim parovima, pri ~emu jedan ~lan vodi poreklo od majke (poti~e iz jajne }elije), a drugi od oca (poti~e iz spermatozoida). Alelni geni (aleli). Aleli su alternativne forme jednog gena na istom lokusu (poziciji, mestu) homologih hromozoma. Haploidni organizam (ili haploidna faza) `ivotnog ciklusa ima samo 1 alel, diploid 2 a poliploid vi{e od 2 alela. U odnosu na odre|eni lokus, diploid mo`e biti homozigotan-AA (dva identi~na alela u paru homologih hromozoma), ili heterozigotan (dva razli~ita alela u paru homologih hromozoma)Aa. Hibridizacija. Ukr{tanje biljaka i `ivotinja koje se razlikuju u geneti~koj strukturi. Hibrid. Jedinka dobijena ukr{tanjem roditelja razli~ite geneti~ke konstitucije. Monohibridno ukr{tanje. Pri monohibridnom ukr{tanju analiziramo nasle|ivanje jedne osobine uslovljene jednim parom gena.

37

GENETIKA I Dihibridno ukr{tanje. Pri dihibridnom ukr{tanju analiziramo nasle|ivanje 2 razli~ite osobine koje moraju biti uslovljene aktivno{}u 2 posebna gena, odnosno 2 para posebnih i nezavisnih alela. Interakcija gena (odnos izme|u gena) Genski aleli sme{teni na odgovaraju}im lokusima homologih hromozoma mogu imati : 1) dominantno- recesivni odnos (produkt samo jednog od njih dolazi do izra`aja) 2) kodominantni odnos (produkti oba alela se ispoljavaju na fenotipu) 3) intermedijarni odnos (produkt oba alela daje zajedni~ki, intermedijarni efekat) Interakcija gena koji su sme{teni na razli~itim hromozomima ozna~ava se kao epistaza. Pri tome geni mogu me|usobno da “sara|uju” da bi se ostvario odre|eni fenotip (komplementarnost gena), ili mo`e jedan da inhibira efekat drugog (epistaza u u`em smislu re~i).

38

GENETIKA I Pravila nasle|ivanja Pravila nasle|ivanja (mendelizma) formulisali su razni istra`iva~i (Mendel, Correns,...). Postoje 2 osnovna pravila (zakona) teorije nasle|ivanja: I Mendelov zakon je zakon razdvajanja (rastavljanja) osobina i naslednih ~inilaca. II Mendelov zakon je zakon slobodnog kombinovanja osobina i naslednih ~inilaca, usled slobodnog kombinovanja hromozoma pri }elijskoj deobi i pri oplo|enju gametima. Ali se ~esto u literaturi navodi i pravilo uniformnosti, koje se odnosi na prvu filijalnu generaciju. Po tom pravilu pri ukr{tanju genetski ~istih roditelja, koji poseduju razli~ite genske komplekse ili alele, potomci u prvoj filijalnoj generaciji su me|usobno jednaki (uniformni).

Mendelovi eksperimenti

Mendel je za prou~avanje svake osobine koristio ~iste linije (genetski ~iste roditelje). ^Ista linija je populacija koja ne pokazuje varijacije u odre|enoj karakteristici koju prou~avamo. Uzajamnim ukr{tanjem jedinki te populacije prou~avana karakteristika }e kod svih potomaka biti ista (ako nije do{lo do mutacije). ^Istu liniju nazivamo parentalnom (roditeljskom) generacijom. Pogledajmo sad Mendelovu analizu naslednosti boje cveta ba{tenskog gra{ka (Pisum sativum): P

Uklanjanje pra{nika makazama

P

Ljubi~asti cvet

F1

Preno{enje polena ~etkicom

Beli cvet

P

Ljubi~asti cvet

Beli cvet

F1

Svi cvetovi su ljubi~asti

Svi cvetovi su ljubi~asti

I @enski cvet ljubi~ast, a mu{ki beo

II @enski cvet beo, a mu{ki ljubi~ast

Mendelova analiza naslednosti boje cveta kod ba{tenskog gra{ka

Mendel je izvr{io unakrsna ukr{tanja biljke sa ljubi~astim i biljke sa belim cvetovima. Ukr{tanja su izvr{ena na 2 na~ina: 1)`enski ljubi~asti cvet sa mu{kim belim cvetom i 2) `enski beli cvet sa mu{kim ljubi~astim cvetom. 39

GENETIKA I Mendel je zaklju~io da nema razlike u rezultatu kod ova 2 ukr{tanja. Ako je jedan roditelj ljubi~ast a drugi beo, sve biljke u F1 (prvoj filijalnoj) generaciji }e imati ljubi~aste cvetove kao jedan od roditelja. Zatim je Mendel “pustio” F1 generaciju da se samooplodi tj. da kod svakog cveta polen padne na tu~ak istog cveta. Tako je dobio F2 (drugu filijalnu) generaciju i gajio je. Interesantno je da su pojedine biljke F2 generacije imale bele cvetove. Beli fenotip se opet pojavio. Mendel je onda uradio ne{to {to je vi{e nego i{ta obele`ilo po~etak moderne genetike: on je prebrojao biljke za svaki fenotip (ljubi~asti i beli) i zabele`io njihov odnos(3:1- 3 ljubi~asta : 1 belom cvetu). Za{to se beli fenotip nije ispoljio u F1 generaciji? Mendel je koristio pojmove dominantan i recesivan da bi opisao ovaj fenomen bez obja{njenja samog mehanizma. Ljubi~asti fenotip je dominantan (vladaju}i) u odnosu na beli, a beli fenotip je recesivan (pot~injen) u odnosu na ljubi~asti. Ovakav na~in nasle|ivanja osobina se naziva dominantnodominantno- recesivno nasle|ivanje.

40

GENETIKA I Dominantno-- recesivno nasle|ivanje Dominantno [ema dominantno- recesivnog nasle|ivanja bi izgledala ovako:

41

GENETIKA I Za geneti~ka istra`ivanja je od zna~aja ne samo me|usobno ukr{tanje hibridnih oblika nego i ukr{tanje izme|u hibrida i jednog od roditelja, koji je homozigotan bilo u odnosu na dominantni, bilo na recesivni gen. Razlikujemo 2 slu~aja: 1) povratno ukr{tanje izme|u pripadnika F1 generacije i jednog od homozigotnih roditelja (Aa × AA ili Aa × aa). 2)Analiziraju}e ukr{tanje. Da bismo u F2 generaciji utvrdili kod individua sa dominantnim fenotipom(AA ili Aa) koja je homo- (AA) a koja heterozigot(Aa), ukr{ta se dominantna individua iz F2 generacije sa recesivnim roditeljem (AA × aa ili Aa × aa).

Intermedijarno nasle|ivanje Ako ukrstimo dve jedinke ~ije su osobine skoro podjednako fenotipski ekspresivne(oba alela su podjednako dominantna), nastaju tzv. Intermedijarni hibridi, tj. Potomci kod kojih potpuno ne preovla|uje osobina nijednog roditelja. Po fenotipu, oni zauzimaju sredi{ni polo`aj u odnosu na oba roditelja. Ovaj tip nasle|ivanja je, stoga, ozna~en kao intermedijarno nasle|ivanje ili nasle|ivanje sa nepotpunim dominiranjem. Slu~aj intermedijarnog nasle|ivanja je zastupljen kod biljke Mirabilis jalapa. Jedan oblik ove biljke ima crvenu, a drugi belu boju cveta. Nijedan oblik potpuno ne dominira nad drugim. Ako se ova dva oblika ukrste, njihovi potomci, me|usobno istovetni, ne}e imati ni crvenu ni belu boju cveta, ve} ru`i~astu. Pri ukr{tanju pripadnika F1 generacije u F2 generaciji se dobijaju fenotipski razli~ite jedinke(pored individua sa ru`i~astim cvetom, u ovoj generaciji su zastupljene jedinke sa crvenom i belom bojom cveta). Tri fenotipa su zastupljena u srazmeri 1:2:1. U istoj srazmeri su izra`ene i genotipske kombinacije.

Intermedijarno nasle|ivanje boje cveta kod Mirabilis jalapa AA- crveni cvet, aa- beli cvet, Aa- roze cvet

42

GENETIKA I Korelativno ili vezano nasle|ivanje Korelativno ili vezano nasle|ivanje je nasle|ivanje koje je pod kontrolom vezanih gena. Ti geni, odnosno lokusi sme{teni su na istom hromozomu i prilikom }elijske deobe idu zajedno, izuzev u slu~ajevima kada se izme|u njih dogodi krosingover. Osobine koje su pod kontrolom vezanih gena se zovu vezane osobine i njihovo nasle|ivanje je uzajamno vezano. Ima i primera da 1 gen uti~e na 2 ili vi{e osobina , pa kada se struktura tog dela DNK promeni, uo~ava se i promena u svim tim osobinama. Me|utim, najve}i broj osobina je odre|en ve}im brojem gena (poligene ili kvantitativne osobine).

Kodominantno nasle|ivanje Kodominantnost je oblik genske interakcije (odnos izme|u gena), kada se produkti oba alela dolaze do izra`aja i rezultiraju u ispoljavanju obe osobine. Tako, na primer, iz braka u kome jedna osoba ima A- a druga B- krvnu grupu, mogu se dobiti deca i sa AB- krvnom grupom. U ovom slu~aju oba genska alela u heterozigotnom stanju dovode do stvaranja odgovaraju}eg produkta- antigena, tako da se stvaraju A- i B- antigeni, tj. Sadejstvo gena je kodominantno.

Za radoznalce Anemija srpastih }elija je zanimljiv primer za kodominantnost. 3 genotipa odre|uju 3 razli~ita fenotipa: HbA/ HbA svi eritrociti normalni HbS/ HbS fatalna anemija, svi eritrociti su srpastog oblika HbA/ HbS Blaga anemija; prisutni su i normalni i srpasti eritrociti HbA-genotip za normalan hemoglobin HbS- genotip za nefunkcionalan hemoglobin kod srpastih eritrocita Razli~ite forme hemoglobina se mogu vizuelizovati pomo}u elektroforeze- tehnike koja razdvaja molekule po naelektrisanju i veli~ini. Tako je utvr|eno da normalna forma i nefunkcionalna S Dihibridno ukr{tanje forma imaju razli~ito naelektrisanje. Nefunkcionalni hemoglobin se sporije kre}e u elektri~nom polju. Utvr|eno je da su ljudi sa prisustvom srpastih eritrocita otporniji na malariju od “obi~nih” ljudi.

Normalni i srpasti eritrociti

Elektroforeza Pozicije do kojih su hemoglobini migrirali HbS/HbA S

Hb /Hb

S

Po~etne pozicije hemoglobina

HbA/HbA

←Migracija

43

GENETIKA I Povratno ukr{tanje Povratno ukr{tanje je ukr{tanje hibridnih jedinki sa jedinkama sa recesivnim ili dominantnim roditeljskim prototipom. Povratno ukr{tanje sa recesivnim roditeljskim tipom ima dijagnosti~ki zna~aj, zato {to otkriva genotip hibrida.

Dihibridno ukr{tanje Dihibridno ukr{tanje predstavlja ukr{tanje jedinki koje se me|usobno razlikuju po dvema osobinama, tj. po 2 para alternativnih osobina. Hibrid dobijen dihibridnim ukr{tanjem se naziva dihibrid. Mendel je odlu~io da analizira nasle|ivanje oblika i boje semena. Ukr{tao je 2 biljke gra{ka, jednu homozigotnu koja ima `uto i okruglo seme (AABB)8, sa drugom, koja ima zeleno i naborano seme (aabb).

P

aabb

AABB

ab

AB

Gameti F1

AaBb

AaBb

Gameti `enski m u { k i

AB

Ab

aB

AB

AaBB AABB

F2

Ab

aB

ab

ab

AABb

AaBb

AABb

AAbb

AaBB

AaBb

AaBb

Aabb

AaBb

aaBB

aaBb

Aabb

aaBb

aabb

Punnetova mre`a9 8

Velikim slovima su obele`eni dominantni aleli 44

GENETIKA I U F1 generaciji su sva semena bila `uta i okrugla. Ispoljile su se dominantne osobine. Zatim je Mendel izvr{io dihibridno ukr{tanje, ukr{taju}i me|usobno dihibride F1 generacije. Pojavila su se 4 tipa F2 semena: 9 okrugla 16

i `uta semena

3 okrugla 16

i zelena

3 sme`urana i `uta 16 1

1 sme`urana i zelena 16

Ovaj neo~ekivani odnos 9: 3: 3: 1 je izgledao mnogo komplikovaniji nego “prosti” odnos 3: 1 kod monohibridnog ukr{tanja. Po{to je Mendel ponovio eksperimente sa dihibridnim ukr{tanjem, prate}i neke druge kombinacije osobina, utvrdio je da je u svim slu~ajevima odnos u F2 generaciji 9: 3: 3: 1. Mendel je poku{ao da proveri da li je monohibridni odnos 3: 1 idalje bio prisutan i primetio je da, gledaju}i samo oblik, odnos okruglo: sme`urano je 3: 1. Tako|e odnos `utog prema zelenom je 3: 1. Mendel je objasnio odnose po slede}oj {emi: 3/4 `uto i okruglo 3/4 semena okruglo < 1/4 zeleno i okruglo 3/4 sme`urano i `uto 1/4 semena sme`urano < 1/4 sme`urano i zeleno 3 3 9 ⋅ = 4 4 16

okruglo i `uto

3 1 3 ⋅ = 4 4 16

okruglo i zeleno

1 3 3 ⋅ = 4 4 16 1 1 1 ⋅ = 4 4 16

sme`urano i `uto sme`urano i zeleno

Naime, ako sa n obele`imo broj ~inilaca ~ije nasle|ivanje pratimo, broj mogu}ih fenotipskih klasa u F2 generaciji bi}e 2n, a broj mogu}ih genotipova iznosi}e 3n. Tako }emo pri dihibridnom nasle|ivanju mo}i da na|emo 4 razli~ita fenotipa i 9 razli~itih genotipova.

9

Punnet-ova mre`a je tabela koju je osmislio R.Punnet, u kojoj se prikazuju sve mogu}e kombinacije gameta. 45

GENETIKA I Polni hromozomi i nasle|ivanje polno vvezanih ezanih osobina Oko 1900. godine, istra`iva~i su utvrdili da postoji jedan par hromozoma koji se razlikuje od ostalih. Kod jednog pola ~lanovi ovog para hromozoma su jednaki, dok su kod drugog razli~itog izgleda. Hromozomi koji grade ovaj specijalan par se ozna~avaju kao polni hromozomi, dok se ostali nazivaju autosomi. Otuda polove mo`emo ozna~iti na slede}i na~in: XX=`enski XY=mu{ki Pol budu}e individue se odre|uje u momentu oplo|enja jajeta. Ako jaje oplodi mu{ka polna }elija koja sadr`i kao polni hromozom Y hromozom, zigot }e imati jedan X(od majke) i jedan Y(od oca)hromozom i razvi}e se mu`jak. Ukoliko mu{ka polna }elija koja je oplodila jaje sadr`i X hromozom a ne Y, zigot }e se razviti u `enku(XX).

Za radoznalce Kod ptica, leptirova i jo{ nekih vrsta koje pripadaju drugim grupama, heterogametna je `enska individua: XX-mu`jak XY ili X0-`enka(X0 zna~i da je prisutan samo jedan X hromozom)

I jos..... Kod skakavaca Y hromozom potpuno izostaje. @enka se ozna~ava sa XX a mu`jak sa X0.

I jos... Kod opnokrilaca(p~ele, ose i mrava) neoplo|ena jaja se razvijaju u mu`jake, a oplo|ena jaja u `enke, tako da su mu`jaci haploidi a `enke diploidi. Haploidni mu`jaci imaju samo haploidnu garnituru hromozoma. Razvi}e razli~itih kategorija `enki, kao {to su kraljice i radnice kod p~ela, zavisi od razlike u ishrani.

Kod ki~menjaka embrion ima sposobnost da se razvije bilo u jedan bilo u drugi pol, ali prema sastavu hromozoma zapo~inje odgovaraju}i razvojni put. Dalje razvi}e pola nalazi se pod jakim uticajem hormona. U izvesnim stupnjevima razvi}a mo`e se desiti da neki dovoljno jak spoljni uticaj obrne proces razvi}a pola iz jednog i uputi ga u drugom pravcu: 1. “Frimartini”. Kod blizanaca teladi, od kojih je jedno mu{ko a drugo `ensko, ovo poslednje se razvija u sterilnu individuu, pokazuju}i unekoliko odlike i drugog pola, a poznata je u literaturi pod imenom “freemartin”. Kod goveda, usled povezanosti krvnih sudova kod embriona blizanaca(frimartin) dolazi do me{anja njihove krvi. Izgleda da mu{ko tele proizvodi jedan hormon(koji jo{ uvek nije identifikovan) koji potiskuje polni razvoj svoje sestre- bliznakinje. Ova pojava se ne sre}e kod ~ovekovih blizanaca. 2. Preobra}en pol kod `ivine i vodozemaca. Kod ptica se ovarijum(jajnik- organ koji proizvodi `enske gamete u procesu gametogeneze) razvija samo na levoj strani, dok desna gonada(gonada- jajnik ili testis u organizmu. Gon- ili gono- u slo`enicama ozna~ava: polno) ostaje nerazvijena. Poznati su slu~ajevi kod koko{aka koje su se u odmakloj starosti preobratile u mu`jake. U najve}em broju slu~ajeva do{lo je do oboljenja ovarijuma ili do njegovog uni{tenja, posle ~ega se ranije nerazvijena gonada razvila u testis, koji je proizveo dovoljno hormona da se izvr{i promena pola. 46

GENETIKA I Polna vezanost osobina Oko 1910. Grupa istra`iva~a zapo~ela je da prou~ava nasle|ivanje kod vinske mu{ice,

Drosophila melanogaster. Me|u osobinama koje su prve prou~avane, bila je i boja o~iju.

Naime, neke mu{ice su imale crvene, a druge bele o~i. Uskoro je prime}eno da se,prema na~inu nasle|ivanja, gen koji odre|uje ovaj karakter nalazi na X hromozomu i da je gen za crvenu boju o~iju dominantan u odnosu na gen za belu boju o~iju.

W+ gen za crvene o~i W gen za bele o~i

47

GENETIKA I

48

GENETIKA I

ZADACI: 23. 1) Izvr{eno je ukr{tanje dveju varijanata neke biljne vrste, od kojih je jedna imala `ute a druga bele cvetove. U F1 generaciji dobijene su samo biljke sa `utim cvetovima, a u F2 generaciji (posle ukr{tanja nekoliko primeraka heterozigota iz F1 generacije) dobijeno je 2304 biljaka sa `utim cvetom i 768 biljaka sa belim cvetom. Objasni {ematski. 2) Nazubljenost oboda liske kod kru{ke (Pirus communis L.) dominantna je osobina i nasle|uje se monohibridno. Ukr{tana je homozigotna kru{ka sa listovima nazubljenog oboda sa kru{kom koja ima listove celog oboda, a u F2 generaciji odgajeno je 463 sadnica. Koliko }e odgajenih biljaka imati nazubljen, a koliko nenazubljen obod liske? 24. Kod pasa koker- {paniel, genotip A?B? je crn, genotip aa B? je boje jetre, genotip A?bb je crven, a genotip aabb je boje limuna. Crni koker je sparen sa `utim i oko}eno {tene je bilo `ute boje. Da je crni pas sparen sa partnerom istog genotipa, koja proporcija bi se o~ekivala u potomstvu? 25. Boja o~iju divljeg tipa vinske mu{ice je crvena, ali se mogu na}i i ~iste linije sa belim o~ima. Ova fenotipska razlika je odre|ena postojanjem 2 alela gena lociranog na karakteristi~nom regionu na X hromozomu. Kada se ukrste mu`jaci sa belim o~ima i `enke sa crvenim o~ima, svi pripadnici F1 generacije ima}e crvene o~i. Kakav }e biti odnos fenotipova u F2 generaciji? A gledaju}i po polu? 26. Kod ljudi ahondroplazija (odsustvo rastenja kostiju u du`inu) i neurofibromatoza su retka oboljenja, odre|ena dominantnim genima. Ako se `ena sa ahondroplazijom ven~a sa ~ovekom sa neurofibromatozom, kakvi fenotipi bi se mogli na}i kod njihove dece i u kojim odnosima? 27. Da ima{ vinsku mu{icu (Drosophila melanogaster) dominantnog fenotipa, kakav bi test napravio/la da utvrdi{ da li je AA ili Aa? 28. Ukr{tanjem jedne biljke jagor~evine (Primula obconica Balf.) crvene boje cveta i nazubljenih listova sa drugom biljkom bele boje cveta i nenazubljenih listova, odgajeno je: 145 biljaka crvene boje cveta i nazubljenih listova, 151 biljka crvene boje cveta i nenazubljenih listova, 148 biljaka bele boje cveta i nazubljenih listova i 143 biljke bele boje cveta i nenazubljenih listova. Kakva je bila geneti~ka konstitucija roditelja s obzirom na odgajeno potomstvo? 29∗. Ima{ 3 biljke gra{ka obele`ene kao A, B i C izrasle iz semenâ sa istim fenotipom (`uto i okruglo). Svaka biljka je ukr{tena sa biljkom izraslom iz zelenog, sme`uranog semena. Iz svakog ukr{tanja dobijeno je po 100 semena, i ona su sortirana prema fenotipu: A: 51 `uto, okruglo 49 zeleno, okruglo 49

GENETIKA I B: 100 `uto, okruglo C: 24 `uto, okruglo 26 `uto, sme`urano 25 zeleno, okruglo 25 zeleno, sme`urano Odredi genotipe biljaka A, B i C. 30. Slepilo za boje se nasle|uje kao recesivna X-vezana osobina.10 Jedan ~ovek slep za boje ima k}er X0 koja ima normalan vid. Imate li predstavu na bazi ovih podataka, gde je do{lo do nerazdvajanja hromozoma? 31. Ako se neka karakteristika prenosi uvek direktno sa oca na sve njegove sinove, a sa ovih na njihove sinove i tako redom, na kojem hromozomu ima najvi{e verovatno}e da se nalazi gen koji ovu osobinu determini{e? 32. Kod ma~aka genotip BB je crn, Bb {aren (crno`ut), a bb `ut. Gen koji ovu osobinu determini{e nalazi se na X hromozomu. Ako se ukrsti {arena `enka sa crnim mu`jakom, kakvo se potomstvo o~ekuje? Da li o~ekujete da dobijete i crno`utog mu`jaka?

10

Ustvari kod ljudi vi|enje boja zavisi od 3 gena koja kodiraju 3 pigmenta: crveni, zeleni i plavi. Geni za crveni i zeleni pigment su na X hromozomu, a za plavi pigment na autozomnom hromozomu. Ali u ovom zadatku zanemari tu ~injenicu. Mutacija u bilo kom od ovih gena mo`e izazvati slepilo za boje. 50

GENETIKA I Mutacije Mutacije predstavljaju svake promene geneti~kog materijala organizma ~iju pojavu nije mogu}e pripisati rekombinaciji gena ili hromozoma. Ukoliko do|e do izmene geneti~kog materijala u gametskim }elijama, ovakva promena se mo`e naslediti. Ako su mutacijama pogo|ene telesne (somati~ke) }elije, promene nisu nasledne i nazivaju se somati~kim mutacijama. Mutacije se mogu podeliti na: 1.Promene u jednom genu- genske ili ta~kaste mutacije 2. Hromozomske mutacije Obi~no se prou~avaju mutacije koje se odra`avaju u nekoj fenotipskoj promeni. Tako je jo{ krajem XVII veka jedan farmer dobio posebnu varijaciju ovce sa izuzetno kratkim nogama, ~iji su potomci (ankonska ovca) mogli znatno lak{e da se ~uvaju u ogra|enom prostoru.

Nagle mutacije (kod ankonske ovce)

Somati~ne mutacije Kao {to je ve} re~eno somati~ne mutacije su mutacije u telesnim (somati~kim) }elijama.Kod somati~kih mutacija promene nisu nasledne. Ako do somati~ne mutacije do|e u nekoj }eliji u toku razvi}a telesnog tkiva, ta }elija postaje roditelj populacije identi~nih mutiranih }elija , svih koje su potekle iz nje. Ove }elije predstavljaju klonove jer poseduju istovetan geneti~ki materijal i potekle su od jednog roditelja u toku bespolnog razmno`avanja. Klon je jedna od individua sa istovetnim geneti~kim materijalom, nastalih od jednog roditelja u procesu bespolnog razmno`avanja. Zato {to ~lanovi klona te`e da ostanu blizu jedni drugima za vreme razvi}a, uo~ljiva posledica somati~ne mutacije je ~esto belega fenotipski mutiranih }elija i zove se mutantski sektor.[to se ranije u razvi}u javi mutacija, ve}i }e biti mutantski sektor.Mutantski sektor se mo`e uo~iti golim okom samo ako postoji vizuelni kontrast izme|u fenotipa }elija mutantskog sektora i fenotipa okolnih }elija divljeg tipa.

somati~ne mutacije

51

GENETIKA I Germinalne mutacije Germinalne mutacije su mutacije u klicinim }elijama11. Ako mutirana polna }elija u~estvuje u oplo|enju, onda }e mutacija biti preneta na slede}u generaciju. Jedinka sa perfektno normalnim fenotipom i iz normalne loze mo`e skrivati nedetektovane mutirane polne }elije. Ove mutacije mogu biti otkrivene ukoliko ta mutirana polna }elija u~estvuje u stvaranju zigota.

Genske (intragenske)mutacije Kod genskih mutacija alel gena se menja u drugi alel. Da bismo razmatrali promenu, moramo imati standard. Standard predstavlja divlji tip. Alel divljeg tipa mo`e biti ili forma na|ena u prirodi ili standardni laboratorijski oblik. Do promena mo`e do}i posle divljeg tipa(posle mutacije divljeg tipa se javlja mutant) ili pre divljeg tipa(posle mutacije mutanta se javlja divlji tip). Mutant- jedinka koja pokazuje efekte mutacija, sa fenotipom koji nije divljeg tipa; ili gen u kome se dogodila mutacija. Vrste genskih mutacija Na DNK nivou: ♣ Tranzicija - purin se zamenjuje drugim purinom, a pirimidin drugim pirimidinom npr. AT→GC ♣ Transverzija- purin se zamenjuje pirimidinom, a pirimidin purinom npr. AT→CG Na nivou proteina: ∗ Tihe mutacije- dolazi do promene tripleta, ali promenjen triplet kodira istu aminokiselinu kao i triplet koji bi nastao bez promene. Npr. AGG(Arg)→CGG(Arg) ∗ Sinonimske mutacije- promenjen triplet kodira drugu ali funkcionalno ekvivalentnu aminokiselinu(AAA→AGA menja se Lys u Arg;u ve}ini slu~ajeva ne}e do}i do izmene funkcije proteina) ∗ Missens mutacije- triplet kodira druga~iju i nefunkcionalnu aminokiselinu. Nonsens mutacije- triplet signalizira zavr{etak lanca(dobijaju se tripleti(kodoni) koji ne odre|uju nijednu aminokiselinu, ve} dovode do zavr{etka sinteze lanca-UAA,UAG,UGA). ∗ Adicija(dodatak) ili delecija(gubitak) baznih parova ♦ Reverzne mutacije (posle mutacije mutanta se javlja divlji tipili pseudodivlji tip): Ta~na reverzija(Exact reversion): npr. AAA(Lys)→GAA(Glu)→AAA(Lys) divlji tip

mutant

divlji tip

Ekvivalentna reverzija: npr. UCC (Ser)→UGC(Cys)→AGC(Ser) divlji tip

mutant

divlji tip

❈ Supresorska mutacija- mutacija kojom se vra}a normalna funkcija drugog gena koji se nalazi na nekom drugom mestu u genomu ili druga mutacija na razli~itom mestu u istom 11

Klicina }elija = gamet 52

GENETIKA I genu. Npr. Adicija nekog nukleotida je dovela do promena tripleta, ali se istovremeno desila i delecija nekog nukleotida, koja je povratila normalan redosled nukleotida u tripletima.

Hromozomske mutacije Hromozomske mutacije predstavljaju odstupanje od normalne strukture (strukturne hromozomske mutacije) ili normalnog broja (numeri~ke hromozomske mutacije) hromozoma. Strukturne hromozomske mutacije Od strukturnih promena hromozoma pojavljuju se ~etiri tipa : 1) duplikacija- hromozomska promena pri kojoj je deo hromozoma udvojen.

2) delecija- hromozomska promena pri kojoj deo hromozoma nedostaje (izgubljen je)

3) inverzija- hromozomska promena pri kojoj je deo hromozoma rotirao za 180° i opet se spojio sa preostalim delom hromozoma.

4) translokacija- strukturna promena na hromozomu pri kojoj se jedan deo nekog hromozoma otkida i preme{ta na drugo mesto u istom hromozomu (intra- hromozomska translokacija) ili na drugi hromozom (inter- hromozomska translokacija).

53

GENETIKA I

Mehanizmi promena ^inioce sredine koji dovode do naslednih promena nazivamo mutagenima. Mutagen- agens koji ima svojstvo da pove}ava stopu mutacije gena. U~estalost preure|ivanja hromozoma mo`e porasti kroz fizi~ko lomljenje i ponovno sastavljanje DNK molekula koji ulazi u sastav hromozoma. Ovaj proces se mo`e desiti spontano ili mo`e biti izazvan tretiranjem visoko- energetskom radijacijom, npr. X ili γ radijacijom. Drugi mehanizam je “ pogre{nim “ crossing- overom izme|u repetitivnih elemenata u genomu. Osim spontanih prekida i prerasporeda hromozoma i prekida izazvanog zra~enjem, odre|ene hemikalije pa ~ak i virusi mogu dovesti do strukturnih promena na hromozomu. Numeri~ke hromozomske mutacije Numeri~ke hromozomske mutacije se odnose na odstupanje od normalnog broja hromozoma. Broj hromozoma u osnovnom setu je monoploidni broj (x). Organizmi sa vi{estrukim monoploidnim brojem se zovu euploidi. Eukarioti normalno imaju ili 1 hromozomski set (haploidi) ili 2 seta (diploidi). Euploidi koji imaju vi{e od 2 seta hromozoma se zovu poliploidi (npr. 3x-triploid, 4x-tetraploid,5x-pentaploid,...). Kod nekih vrsta, monoploidni stupnjevi su deo regularnog `ivotnog ciklusa, ali drugi monoploidi su rezultat spontanih aberacija. Za razliku od drugih organizama, naro~ito biljnih , poliploidija je {tetna za ~oveka.

Razlikuj monoploidni broj hromozoma od haploidnog broja hromozoma -✓

Broj hromozoma u osnovnom setu je monoploidni broj (1x). Broj hromozoma u gametima je haploidni broj (n). Kod ve}ine `ivotinja i dosta biljaka su ova 2 broja ista. Ali, kod izvesnih biljaka npr. savremene p{enice n i x su razli~iti. P{enica ima 42 hromozoma, ali precizne studije otkrile su da je ona heksaploid. Dakle 6x=42, x=7, Me|utim gameti p{enice sadr`e 21 hromozom, pa je n= 21 i 2n=42.

Postoje 2 grupe numeri~kih aberacija (mutacija): 1) poliploidija -stanje u kome organizam ima ve}i broj garnitura hromozoma od diploidnog broja. Za ~oveka su karakteristi~ne triploidija (3x=69) i tetraploidija (4x=92). U carstvu poliploida razlikujemo: ♣ autopoliploide- sa~injeni su od vi{estrukih setova hromozoma iste vrste. ♣ alopoliploide- sa~injeni su od setova hromozoma iz razli~itih vrsta. 54

GENETIKA I Karpechenkov eksperiment 1928. godine Karpechenko je sintetisao alopoliploid. @eleo je da napravi fertilan hibrid koji }e imati li{}e kupusa (Brassica) i koren rotkve (Raphanus). Obe vrste imaju po 18 hromozoma, i dovoljno su bliske da bi bilo mogu}e ukr{tanje. Dobijen je hibrid koji je bio sterilan zato {to 9 hromozoma iz roditelja kupusa su bili dovoljno razli~iti od hromozoma iz rotkve da hromozomi ne mogu da se normalno pove`u u parove i razdvoje. Jednog dana nekoliko semena je dobijeno iz ovog skoro sterilnog hibrida. Daljim odgajanjem biljaka iz ovih semena, dobijene su fertilne jedinke sa 36 hromozoma. O~ito su ove jedinke dobijene iz spontanog, slu~ajnog udvostru~avanja seta hromozoma u sterilnom hibridu, po svoj prilici u tkivu koje je postalo germinalno i podleglo mejozi. Tako, postoji par za svaki hromozom i izbalansirani gameti tipa n1+ n2 su produkovani. Ovi gameti sjedinjavanjem daju 2n1+ 2n2 alopoliploide, koji su fertilni. Ova vrsta alopoliploida se nekad zove i amfidiploid (amphidiploid), {to zna~i “dupli diploid”. Gameti R O D Raphanus I 2n=18 T E LJ x I Brassica 2n=18

n=9 n=9

Sterilan F1 hibrid Raphanobrassica n+ n= 9+9 2n=18 Fertilan amfidiploid 2n+2n=18+18 4n=36

2) aneuploidijaaneuploidija pojava odstupanja broja hromozoma u pojedina~nim parovima hromozoma. Npr. Daunov sindrom je rezultat postojanja tri hromozoma 21, umesto dva. Ovakve gre{ke naj~e{}e nastaju usled gre{aka u mejozi i mitozi koje se zajedni~kim imenom nazivaju nerazdvajanje hromozoma (nondisjunction). Nomenklatura aneuploida je zasnovana na broju kopija specifi~nog hromozoma u aneuploidnom stanju. Tako se na primer aneuploid 2n-1 zove monosomik (zna~i “1 hromozom”) zato {to postoji samo 1 kopija nekog specifi~nog hromozoma umesto uobi~ajne 2 kod diploida. Aneuploid 2n+1 se zove trisomik, 2n-2 nulsomik,a n+1 disomik. Aneuploidne }elije se mogu pojaviti i u somatskom tkivu. U takvim slu~ajevima, rezultat je genetski mozaik }elijskih tipova.

55

GENETIKA I Medicinska genetika Genetika se sve vi{e primenjuje u medicini, postaje sve neophodnija za dijagnozu, prevenciju i le~enje uro|enih bolesti i sindroma. Medicinska genetika omogu}uje davanje geneti~kog saveta porodicama bolesnika sa uro|enim maloformacijama. Cilj geneti~ke konsultacije je spre~avanje ra|anja dece sa te{kim kongenitalnim maloformacijama koje se ne mogu le~iti, rano otkrivanje onih koje su dostupne le~enju, obezbe|ivanje ra|anja zdrave dece. Ovaj cilj se ostvaruje konsultacijama sa ~lanovima porodica sa pove}anim rizikom za nastajanje kongenitalnih maloformacija. Rodoslovno stablo je neophodno za davanje geneti~kog saveta. Ono pru`a osnovne podatke za dalja geneti~ka ispitivanja. ^lan familije preko koga je uspostavljen rodoslov naziva se propositus. propositus Uobi~ajno fenotip propositusa je na neki na~in izuzetan (npr. mo`e biti patuljast). Istra`iva~ tada sledi istoriju fenotipa me|u propositusovim precima i crta rodoslovno stablo (pedigre), upotrebljavaju}i odre|ene simbole. Svaka individua je ozna~ena brojem svoje generacije i rednim brojem u toj generaciji (npr. II-7 ozna~ava sedmu osobu u drugom redu).

Rodoslovno stablo Mu{karac

Broj dece odre|enog pola

@ena Obolele jedinke Par Heterozigoti nosioci mutiranog alela autosomno recesivnog nasle|ivanja Roditelji i deca: 1 de~ak i 1 devoj~ica Nosioci polno- vezanog gena recesivnog nasle|ivanja Smrt Dvojaj~ani blizanci

Abortirano ili mrtvoro|eno (pol neodre|en) Propositus

Jednojaj~ani blizanci

Identifikovanje osoba u stablu Neodre|en pol Brak ro|aka

Simboli

56

GENETIKA I Kao {to je re~eno, postavljanje dijagnoze kongenitalne maloformacije i izrada rodoslovnog stabla slu`e za odre|ivanje rizika za ponovno javljanje u istoj porodici. Precizan rizik se mo`e odrediti kada su maloformacije izazvane genima koji se prenose po jednostavnim Mendelovim zakonima, tzv. monogeno nasle|e. U autosomnim hromozomima dva gena, od kojih jedan poti~e od oca a drugi od majke, mogu biti jednaka i onda je osoba homozigotna za tu osobinu, normalnu ili abnormalnu, koji oni odre|uju. Ako su oba gena normalna, oni daju normalnu osobinu. Kada su oba gena izmenjena, mutantna, nastaje promena osobine koja od njih zavisi. Kod heterozigota aleli su nejednaki. Jedan mo`e biti normalan a drugi mutantan.

Autosomno dominantno i autosomno recesivno nasle|e U autosomno dominantnom nasle|u mutantan gen dolazi do izra`aja kod osobe koja je heterozigotna. Ako je mutantan gen abnormalan, on dominira nad normalnim alelom u drugom homolognom hromosomu i izaziva dominantno naslednu anomaliju. U autosomno recesivnom nasle|u abnormalan gen ne izaziva poreme}aj ako je prisutan samo u jednom alelu. Mutantan autosomno recesivan gen dolazi do izra`aja samo ako je prisutan na oba alela, ako je u homozigotnom stanju.

Polno-- vezane bolesti Polno Za razliku od gena u autosomnim hromosomima, geni u polnim hromosomima osobe mu{kog pola su u posebnom polo`aju. Kod osoba mu{kog pola dejstvo mutantnog recesivnog gena na X hromozomu ne mo`e biti potisnuto dejstvom normalnog alela, jer imaju samo jedan X hromosom. Kod osobe `enskog pola mutantan recesivan gen u X hromozomu ne ispoljava svoje dejstvo, ako je odgovaraju}i gen u drugom X hromozomu normalan. Zato mu{karci mnogo ~e{}e oboljevaju od hemofilije, daltonizma, Di{enove mi{i}ne distrofije,...

Neke uro|ene anomalije izazvane autosomno dominantnim genima Ahondroplazija Ahondroplazija je kongenitalna12 maloformacija izazvana abnormalnim autosomno dominantnim genom. Nosilac ovog gena uvek ima sli~ne klini~ke simptome, ispoljene pri ro|enju deteta. Upadljivi su kratki ekstremiteti, kratke i {iroke {ake i stopala, pro{irena baza lobanje, ispup~eno ~elo, ugnuta baza nosa. Radiografija pokazuje kratke i {iroke duge kosti.

Ahondroplazija 12 Kongenitalno zna~i da je takvo stanje prisutno na ro|enju. Nisu svi genetski poreme}aji kongenitalni (npr. Huntingtonova horeja), niti su svi kongenitalni poreme}aji genetskog porekla.

57

GENETIKA I Huntingtonova Huntingtonova horeja U Huntingtonovoj horeji prva pojava ove maloformacije u porodici ne mora da zna~i novonastalu mutaciju, jer je abnormalan gen mogao biti prenet sa jednog roditelja kod koga }e se simptomi tek ispoljiti. Prvi simptomi se naj~e{}e javljaju kasno- oko ~etrdesete godine `ivota: nekontrolisani drhtavi pokreti sa dugogodi{njom progresijom do ludila.

Neke uro|ene anomalije izazvane autosomno recesivnim genima TayTay- SachsSachs-ova bolest Letalno oboljenje kod ljudi usled koga deca koja su naizgled normalna na ro|enju , u toku prvih {est meseci `ivota pokazuju znake propadanja mozga i ki~mene mo`dine. Do 1. Godine starosti deca mogu samo da bespomo}no da le`e, postaju mentalno retardirana, postepeno gube vid i postaju paralizovana. Smrt nastupa izme|u 3. I 4. Godine bez mogu}nosti izle~enja. Uzrok ovakvog stanja je nagomilavanje kompleksnih lipidnih jedinjenja u centralnom nervnom sistemu usled nedovoljne koli~ine enzima heksozaminidaze A.

Uro|ene anomalije izazvane genima u X hromozomu 1) Izazvane Izazvane recesivnim genima Hemofilija Od bolesti koje se prenose genom u X hromozomu prvo je otkrivena hemofilija. Hemofilija nastaje usled nedostatka fibrina, {to dovodi do poreme}aja u procesu zgru{avanja krvi. Bolest kontroli{u 2 vezana gena na X hromozomu, koji reguli{u sintezu razli~itih faktora zgru{avanja. Hemofilija tipa A je izazvana nedostatkom antihemofilnog globulina (AHG), dok je hemofilija tipa B rezultat nedostatka tromboplastina. Oko 80% svih pacijenata sa ovom bole{}u imaju hemofiliju tipa A koja se le~i davanjem AHG u transfuziji. Di{enova mi{i}na distrofija Di{enova mi{i}na distrofija je fatalna X- vezana recesivna bolest. Fenotip je odumiranje mi{i}a. Prvi znaci su geganje,ote`ano penjanje uz stepenice, i sklonost ka lakom saplitanju. Oko desete godine oboleli obi~no vi{e ne mo`e da hoda i mora da koristi invalidska kolica. Bolest napreduje, bolesnik postaje vezan za krevet i naj~e{}e umire pre dvadesete godine.

58

GENETIKA I

Di{enova mi{i}na distrofija

2) Izazvane dominantnim genima Hipofosfatemia (Hypophosphatemia)- tip rahitisa rezistentnog na vitamin D.

Neke bolesti izazvane strukturnim aberacijama hromozoma Sindrom pla~a ma~kema~ke- Cri du chat Sindrom pla~a ma~ke nastaje usled delecije kratkog kraka hromozoma 5. Javlja se psihi~ka retardacija i karakteristi~an ma~ji pla~.

59

GENETIKA I

Cri du chat

WolfWolf-HirschhornHirschhorn-ov sindrom Nastaje delecijom kraka hromozoma 4 (4p-). Javlja se mentalna retardacija.

Wolf-Hirschhorn-ov sindrom

Neke bolesti izazvane numeri~kim aberacijama hromozoma Downov sindrom Downov sindrom nastaje usled trisomije 21 (prisustva tri umesto dva hromozoma 21 u kariotipu). Spoljni izgled dece sa Downovim sindromom veoma je karakteristi~an. Posebno je karakteristi~an izgled lica, tako da ova deca vi{e li~e me|u sobom nego na svoju bra}u i sestre. Karakteristi~ni simptomi su: mentalna retardacija, brazda ispod ~etiri prsta na ruci ili “majmunska brazda”, kratke i {iroke {ake, ve}i razmak izme|u prvog i drugog prsta na stopalu, nepravilni zubi, kratak vrat...

60

GENETIKA I

Downov sindrom

Tarnerov Tarnerov sindrom Tarnerov sindrom predstavlja monosomiju X hromozoma. Kariotip pogo|ene jedinke je 45, X0 i ona je `enskog pola. Simptomi: kratak i naboran vrat, nizak rast (125- 150cm), nizak rast kose na vratu, {titaste grudi sa {iroko razmaknutim bradavicama, gonadalna disgeneza usled ~ega nastaje sterilitet.... Ipak oko 3% ovih osoba ima menstruaciju i fertilne su. U ovim slu~ajevima se pretpostavlja skriveni mozaicizam 45,X/ 46,XX. Dijagnoza Turnerovog sindroma se obi~no postavlja u kasnijem detinjstvu, odnosno u doba kada treba da po~ne pubertet. Ponekad se u novoro|en~adi i odoj~adi na ovaj sindrom posumnja na osnovu edema na stopalima i {akama.

Edemi na stopalima odoj~eta sa kariotipom 45,X0

61

GENETIKA I Klinefelterov sindrom Kariotip je 47, XXY. Ovi mu{karci su vi{i od normalnih, vi`ljasti, ni`e inteligencije, malih testisa, oskudne kosmatosti lica, `enskog tipa pubi~ne kosmatosti, zakr`ljalih mu{kih sekundarnih seksualnih karakteristika, sterilni,...

62

GENETIKA I

ZADACI: 33. Prepoznaj vrstu mutacije u molekulu DNK: DNK a) GC→ AT b) GCT→ACT c) TCA→ AGA d) GC→TA 34. Ni`e je prikazan hromozom sa 7 gena (od a do g), a tako|e i 3 hromozoma koji su mogli nastati iz njega kao rezultat razli~itih strukturnih promena. Uka`ite na pojavu strukturnih promena i ozna~ite svaku od njih: abcdefg 1) abcdef 2) abcdcdefg 3) abedcfg 35. Pretpostavimo da su se pri razmno`avanju atlaskog kedra (Cedrus atlantica Man.) standardne boje ~etina u jednom rasadniku u Italiji kao rezultat mutacije pojavile i sadnice “srebrnaste” boje ~etina. Kasnija ukr{tanja su pokazala da je “ srebrnasta” boja kontrolisana jednim recesivnim genom. Fenotipski veoma sli~ne “srebrnaste” sadnice odgajene su pretpostavimo i u jednom rasadniku u Gr~koj, a i u ovom slu~aju utvr|en je recesivan karakter gena koji kontroli{e “srebrnastu” boju ~etina. Me|utim, kada su ukr{tene sadnice srebrnaste boje ~etine iz Italije sa srebrnastim sadnicama iz Gr~ke i dobijeno potomstvo, postalo je jasno da italijanski srebrnasti kedar ima druga~iji genotip od gr~kog (tj. Nije do{lo do iste mutacije gena, ve} nove mutacije, koja je zahvatila drugi gen). Kako se to mo`e objasniti? 36°. Ni`e su prikazani hromozomski kompleksi jedne diploidne biljke (2n=8) i 5 aneuploidnih ili poliploidnih biljaka. Dajte svakoj odgovaraju}i naziv: a) _ _ _ _ b) _ _ _ _ c) _ _ _ _ d) _ _ _ e) _ _ _ _ f) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 37. Prikazano je 6 traka na hromozomu Drosophila zajedno sa opsegom 5 delecija:

63

GENETIKA I

Recesivni aleli a, b, c, d, e, i f su u prikazanom regionu ali je njihov redosled nepoznat. Kada su delecije povezane sa svakim alelom dobijeni su slede}i rezultati: Del 1 Del 2 Del 3 Del 4 Del 5

a + +

b + + + +

c +

d + + + -

e + + -

f + + + + -

Znak - zna~i da delecija obuhvata odgovaraju}i alel divljeg tipa pa je recesivni alel otkriven, a + zna~i da je odgovaraju}i alel divljeg tipa prisutan. prisutan Koriste}i date podatke odredi koja hromozomska traka odgovara kom genu. 38. A)U navedenim rodoslovima pretpostavite da je nenormalan karakter redak u populaciji. Koji je verovatan na~in nasle|ivanja?

64

GENETIKA I

B) Pedigre pokazuje nasle|ivanje retkog oblika mi{i}ne distrofije.

Gde se nalazi lokus ~ijom je mutacijom izazvana bolest? 65

GENETIKA I Geneti~ke rekombinacije Nasledna osnova pod delovanjem razli~itih ~inilaca sredine ili spontano trpi brojne promene. Mada su mutacije naj~e{}e {tetne, ~itav niz korisnih mutacija omogu}io je raznolikost `ivih oblika, evoluciju i `ivot uop{te. Mutacije, bilo pozitivne ili negativne, de{avaju se relativno retko. Zato se smatra da su glavni izvor fenotipske i genotipske varijabilnosti rekombinacije. rekombinacije Procesi rekombinacije otkriveni su kod svih `ivih organizama. Osnovna razlika izme|u mutacija i rekombinacija je u tome {to mutacijeizazivaju promenu informacija u DNK, zna~i dovode do stvaranja kvalitativno novih oblika gena, a rekombinacije su samo nove kombinacije ve} postoje}ih gena roditelja (divljih i mutiranih, razli~itih divljih ili razli~itih mutiranih). Svako me{anje postoje}ih genoma pretpostavlja rekombinaciju. Pri tome, mogu da se rekombinuju slobodni geni (geni na razli~itim hromozomima), ali pod rekombinacijom u u`em smislu re~i podrazumeva se me{anje (razmena) vezanih gena (geni na istom hromozomu). Postoje 2 tipa rekombinacija: 1)Op{ta Op{ta ili homologna rekombinacija-odigravaju se u bilo kom delu hromozoma i rekombinacija razmenjuju se homologi delovi genoma 2) Specijalna rekombinacijarekombinacija odigravaju se na odre|enom delu hromozoma i razmenjuju se nehomologi delovi genoma Kao poseban oblik se izdvaja transpoziciona rekombinacija. rekombinacija

Op{ta ili homologna rekombinacija Pri homolognoj rekombinaciji dolazi do razmene homolognih segmenata izme|u dva molekula DNK. Kod vi{ih organizama ovaj proces se odigrava u toku mejoze. Crossing over Krosingover je proces koji se de{ava u profazi 1 mejoze. Me|u homologim hromozomima se zapa`a postojanje mostova- hijazmi, koji povezuju nesestrinske hromatide uzajamno priljubljenih homologih hromozoma. Zatim dolazi do razmene delova izme|u homolognih hromozoma tj. rekombinacije.

Holidejev model

66

GENETIKA I Su{tina mehanizma op{te rekombinacije je u slede}em: po jedan lanac iz dve paralelne homologne dvolan~ane zavojnice DNK (nesestrinske hromatide u mejozi) prekida se na jednom mestu, a prekinuti lanci se ukr{taju tako da se svaki od njih sparuje sa komplementarnim lancem iz drugog, homolognog dvolan~anog molekula DNK. Region u kome su spareni lanci koji poti~u iz razli~itih molekula DNK naziva se heterodupleks. U toku ovog procesa nastaje ~etvorolan~ana ukr{tena struktura u obliku slova X, tzv. Holidejeva struktura. Ova struktura je stabilna. Dva prekinuta lanca DNK (od 4 koja grade Holidejevu strukturu), posle ukr{tanja uspostavljaju nove fosfodiestarske veze, grade}i 2 rekombinantna (hibridna) molekula DNK.

Biolo{ki zna~aj homolognih rekombinacija sastoji se u tome {to su one osnovni izvor geneti~ke raznovrsnosti populacija.

67

GENETIKA I Molekularno kloniranje

Molekularno kloniranje ili geneti~ko in`enjerstvo ili tehnologija rekombinovane DNK predstavlja novu tehnologiju koja se razvila poslednjih nekoliko decenija. Pomo}u ove tehnologije mo`e se modifikovati geneti~ka osnova }elija i organizama putem manipulacija pojedina~nim genima. Pomo}u tehnike rekombinovane DNK ljudi su stekli sposobnost precizne integracije nizova DNK koje pripadaju razli~itim organizmima iste vrste ili ~ak razli~itim biolo{kim vrstama. Dakle, rekombinovana DNK DNK13 predstavlja molekule DNK ~iji se delovi, dobijeni iz razli~itih organizama, ve{ta~ki spajaju. Na taj na~in se mogu dobiti hibridni molekuli DNK koji se normalno nikada ne bi mogli sresti u prirodi. Kloniranje gena je najzna~ajniji proces u ovoj tehnologiji i odvija se kroz 4 koraka: 1) Isecanje `eljenog fragmenta DNK iz molekula DNK donora pomo}u specifi~nih enzima restrikcionih endonukleaza. 2) Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim molekulom DNK koji ima sposobnost replikacije (vektor za kloniranje). Hibridni molekul DNK, nastao spajanjem fragmenta DNK sa vektorom (plazmid14 ili virusna DNK), naziva se rekombinovani molekul DNK. Spajanje fragmenta DNK sa vektorom vr{i se pomo}u enzima DNK ligaze. 3) Uno{enje rekombinovanog molekula DNK u }eliju doma}ina ~iji enzimi obezbe|uju njegovu replikaciju. 4) Identifikacija }elija doma}ina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.

13

Neki geneti~ari umesto naziva rekombinovana DNK upotrebljavaju naziv himeri~na DNK po gr~kom mitolo{kom monstrumu Himeri. Ve} vekovima Himera je smatrana simbolom nemogu}eg biolo{kog jedinstva, kombinacijom delova tela razli~itih `ivotinja. 14 plazmid= cirkularni molekul DNK koji se nalazi u citoplazmi bakterijskih }elija, replicira se nezavisno od hromozoma doma}ina. 68

GENETIKA I

[ematski prikaz procesa kloniranja gena

Izolovanje DNK I korak u pravljenju rekombinovane DNK je izolovanje donorske i vektorske DNK. Ekstrahovana DNK iz donora mo`e biti ili jedarna genomska DNK eukariota ili “glavna” genomska DNK prokariota. Kao uobi~ajeni vektori koriste se plazmidi bakterija. Ovi plazmidi najpre moraju biti pre~i{}eni od bakterijske genomske DNK. Prikazan je protokol za izdvajanje plazmidske DNK pomo}u ultracentrifugiranja. Plazmidna DNK obrazuje odvojenu traku posle ultracentrifugiranja u gradijentu gustine cezijum hlorida koji sadr`i i etidijum bromid. Plazmidna traka je zatim izdvojena kroz otvor u plasti~noj tubici za centrifugiranje.

69

GENETIKA I ]elija rezistentna na tetraciklin Plazmid rezistentan na tetraciklin Hromozom

DNK ekstrakcija Cezijum hlorid i etidijum bromid

Sva }elijska DNK

Centrifugiranje Hromozomska DNK Plazmidna DNK

Frakcija

Hromozomska DNK

otvor

]elija osetljiva na tetraciklin Kalcijum hlorid Propustljiva }elija

Plazmidna DNK Plazmid rezistentan na tetraciklin

Hromozom

Transformisana, }elija rezistentna na tetraciklin

Bakteriofagi se tako|e mogu koristiti kao vektori za kloniranje DNK u bakterijskom sistemu.

70

GENETIKA I Isecanje i spajanje DNK

Tehnologija rekombinovane DNK bi bila nemogu}a bez otkri}a restrikcionih enzima. Restrikcioni enzimi su produkti bakterija i imaju ulogu odbrane bakterije od bakteriofaga. Enzimi deluju poput makaza i seku DNK fage i time je inaktivi{u. [To je veoma va`no, restrikcioni enzimi ne seku nasumi~no, ve} na specifi~nim ciljnim DNK sekvencamarestrikcionim mestima, mestima {to je jedna od klju~nih odlika koja ih ~ini pogodnim za DNK manipulaciju. Ova mesta naj~e{}e su DNK palindromi ( nizovi nukleotida u dvolan~anoj DNK koji su identi~ni kada se ~itaju u smeru 5’→ 3’). Mnogi razli~iti restrikcioni enzimi prepoznaju i seku specifi~ne palindrome. Na primer Eco RI prepoznaje slede}u sekvencu od 6 nukleotidnih parova: 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Do sada je u ~istom stanju izolovano nekoliko stotina razli~itih restrikcionih enzima.

71

GENETIKA I Enzim

Izvorni organizam

Restrikciono mesto

Oni su dobili nazive po bakterijama iz kojih su izolovani (npr. Eco - izolovan iz E. coli,...) Neki restrikcioni enzimi seku dvolan~anu DNK tako da krajevi dobijenih fragmenata ostaju ravni. Me|utim, ve}ina ovih enzima preseca 2 lanca na razmaku od 2 do 4 nukleotida, tako da krajevi dobijenih fragmenata ostaju jednolan~ani (“lepljivi krajevi”). Ovakvi restrikcioni enzimi se koriste u geneti~kom in`enjerstvu, jer se 2 razli~ita fragmenta DNK (donora i vektora) mogu lako spojiti pomo}u komplementarnih “lepljivih krajeva”. Posle hibridizacije mogu}e je, pomo}u DNK ligaze, spojiti lance i dobiti hibridni rekombinovani molekul DNK. Naime, donorska DNK i vektorska DNK su najpre ise~ene pomo}u istog restrikcionog enzima koji proizvodi lepljive krajeve, i onda pome{ane u test tubi da bi se lepljivi krajevi donorske DNK sparili sa lepljivim krajevima vektorske DNK i obrazovali rekombinantne DNK

72

GENETIKA I molekule. Zatim je dodata DNK ligaza koja stvara fosfodiestarske veze (definitivno slepljuje krajeve). Transformacija ili uno{enje rekombinovane DNK u bakteriju Slede}i korak je uno{enje rekombinovane DNK u bakterije koje su pripremljene tako da mogu da je prime. Ovaj postupak se naziva transformacija. Identifikacija }elija doma}ina u kojima kojima se nalazi ispitivani fragment DNK Sve bakterijske }elije kojima su ponu|eni plazmidi sa ugra|enim fragmentima DNK ne}e biti transformisane. Prepoznavanje ili selekcija bakterija koje su transformisane vr{i se na osnovu njihove rezistencije na antibiotik antibiotik koju nosi gen ugra|enog plazmida. plazmida Transformisane bakterije }e se razmno`avati i graditi kolonije na podlozi od agara u kojoj je dodat odgovaraju}i antibiotik. One u koje nije u{ao plazmid bi}e ubijene jer nisu rezistentne na odgovaraju}i antibiotik (nemaju gen za rezistentnost koji se nalazi na plazmidu). Gra|a plazmida Plazmidi koji se koriste kao vektori za kloniranje, naj~e{}e su modifikovani da bi najbolje zadovoljili potrebe eksperimentisanja. Tipi~an plazmidni vektor se sastoji od: 1) replikativnog po~etka 2) bar jednog gena koji obezbe|uje rezistentnost (otpornost) }elije doma}ina na odre|eni antibiotik 3) restrikciona mesta (naj~e{}e ih ima vi{e razli~itih koncentrisanih u jednom delu DNK plazmida- polilinker, polilinker da bi se jedan tip plazmida mogao koristiti za kloniranje fragmenata DNK dobijenih razli~itim restrikcionim enzimima)

73

GENETIKA I DNK biblioteka Najva`niji cilj tehnologije rekombinovane DNK je da se klonira odre|eni genomski fragment za koji je nau~nik zainteresovan. Po{to geni predstavljaju veoma mali deo hromozoma jedini na~in da se izoluju pojedina~ni geni jeste fragmentisanje celog genoma nekog organizma restrikcionim enzimom. Tako se dobija veliki broj razli~itih fragmenata. Svaki od ovih fragmenata se ugra|uje u vektor za kloniranje i tako se dobija “geno genomska genomska biblioteka” biblioteka odre|enih organizama. Ovaj metod je nekad prikazivan kao “shotgun” (lova~ka pu{ka) kloniranje, jer se umno`ava veliki broj fragmenata dok mo`da samo 1 od njih sadr`i `eljeni gen. Zadatak je onda na}i taj odre|eni klon sa `eljenim genom. Tra`enje se obavlja pomo}u probe, koja nalazi i markira tra`eni klon. klon Postoje 2 vrste probi: 1) one koje prepoznaju DNK i 2) one koje prepoznaju protein Postoji vi{e kriterijuma klasifikacije DNK biblioteka. biblioteka Prvi kriterijum je kori{teni vektor za kloniranje. kloniranje Razli~iti vektori za kloniranje mogu da “nose” razli~ite koli~ine DNK, tako da odabir vektora za biblioteku zavisi od veli~ine genoma ili drugog DNK uzorka ~ija se biblioteka pravi. Plazmidi i fage su vektori koji nose male koli~ine DNK, kosmidi15 nose ve}e koli~ine DNK dok BAC16-ovi i YAC17-ovi nose najve}e koli~ine DNK od navedenih. Drugi kriterijum klasifikacije DNK biblioteka je prema izvoru DNK. DNK Veoma va`na odluka je da li praviti genomsku biblioteku (ime ka`e: sadr`i ceo genom odre|enog organizma) ili cDNK biblioteku18(biblioteka koja sadr`i samo kodiraju}e regione genoma i pre~i{}ena je od regulatornih sekvenci19 i introna, i time je znatno manja od genomske biblioteke). Izbor izme|u genomske DNK i cDNK biblioteke zavisi od namene. Ako je konstruisanje biblioteke uvod u kloniranje celog genoma, onda }e biti potrebna genomska biblioteka. Me|utim ukoliko je potreban specifi~ni gen, koji je aktivan u specifi~nom tipu biljnog ili `ivotinjskog tkiva onda je logi~no napraviti cDNK biblioteku iz tog uzorka.

Zna~aj geneti~kog in`enjerstva Velika korist tehnologije rekombinovane DNK je u proizvodnji velikih koli~ina deficitnih i/ili novih proteina. Po{to plazmidi uneseni u bakterijske }elije mogu brzo da se umno`avaju, fragmenti DNK koji se nalaze na njima tako|e se veoma brzo kloniraju u milione ta~nih kopija. Tako|e ako se na analiziranom fragmentu DNK nalaze odgovaraju}i nizovi nukleotida koji su neophodni za aktivaciju gena(promotori ,...) uba~eni geni ne samo da }e biti kopirani ve} }e, uz pomo} metaboli~ke ma{inerije bakterije, kontrolisati sintezu za njih specifi~nih proteina i to u koli~ini koju ne bi mogla podneti }elija iz koje su ti geni izolovani. 15

Kosmidi su vektori za kloniranje poput plazmida. Replikuju se autonomno sli~no plazmidima, s tim {to se mogu spakovati in vitro u virusni omota~ ( sli~no DNK u λ fagu) i uneti u bakteriju infekcijom a ne transformacijom. 16 BAC (Bacterial artificial chromosome). F plazmid izgra|en za ulogu kloniraju}eg vektora koji mo`e da nosi velike inserte. 17 YAC(Yeast artificial chromosome)ve{ta~ki izgra|en vektor za kloniranje u kvascu. 18 cDNK ili komplementarna DNK je sintetisana DNK dobijena pomo}u mRNK(informaciona RNK) ,uz dejstvo enzima RNK zavisne DNK polimeraze (reverzne transkriptaze) koji je izolovan iz retrovirusa. Koriste}i mRNK kao kalup reverzna transkriptazasinteti{e jednolan~ani DNK molekul, koji se onda koristi kao kalup za sintezu dvolan~anog DNK molekula. 19 regulatorni geni su geni koji imaju ulogu pokretanja i zaustavljanja transkripcije strukturnih gena. 74

GENETIKA I Mogu}nost sinteze proteina u velikim koli~inama ve} se koristi i ima ogroman zna~aj u medicini, poljoprivredi i industriji. Neki od proteina sintetisanih tehnologijom geneti~kog in`enjerstva ve} su u rutinskoj klini~koj upotrebi: insulin, hormon rasta, eritropoietin,... Velike se nade ula`u i u gensku terapiju. 1990 Anderson i Blez su le~ili trogodi{nju devoj~icu A{anti De Silvu od retke nasledne bolesti SCID-a. Jaka kombinovana imunolo{ka deficijencija (SCID) je ~inila decu nesposobnom da se imunolo{ki odbrane od infekcije, a uzrok je bila brza smrt belih krvnih }elija. Takva deca su ~esto oboljevala i rano umirala. Bolest je uzrokovana gre{kom u jednom genu na hromozomu 20, koji se zove ADA gen. Anderson i Blez su uzeli bele krvne }elije iz krvi obolele devoj~ice , inficirali ih retrovirusima sa ADA genom i vratili transfuzijom natrag u devoj~icino telo. Genska terapija je radila. Broj devoj~icinih belih krvnih }elija se utrostru~io, njeni imunoglobulini su porasli i ona je po~ela da proizvodi skoro ~etvrtinu one koli~ine ADA proteina koju proizvodi prose~na osoba. Iako je nije skroz izle~ila, jer je devoj~ica i dalje primala PEG-ADA terapiju (uno{enje gotovog ADA proteina u krv, proizvoda ekvivalentnog gena gove~eta), genska terapija je pomogla. I druge bolesti }e se uskoro pridru`iti kombinovanoj imunolo{koj deficijenciji i le~iti genskom terapijom. Trenutno, posebno je u usponu geneti~ko in`enjerstvo biljaka. Razlozi su uglavnom komercijalni: pove}anje kvaliteta i kvantiteta proizvoda. Naj~e{}e se koristi bakterija Agrobacterium tumefaciens i njen Ti plazmid. Zahvaljuju}i geneti~kom in`enjerstvu dobijen je paradajz koji sporije truli na polici, pamuk otporan na `i{ke, krompir otporan na krompirovu zlaticu, i mnogo drugih genetski modifikovanih biljaka. Tako|e i transgene `ivotinje (organizam organizam koji sadr`i strani gen naziva se transgenskim organizmom) organizmom imaju veliku komercijalnu primenu.

Levo:Genetski modifikovan pamuk otporan na insekte (levo) u pore|enju sa neza{ti}enim pamukom (desno). Desno: Transgena biljka duvana koja ispoljava gen za svetlost kod svica

75

GENETIKA I Umno`avanje fragmenata DNK pomo}u PCR PCRCR-a Reakcija lan~anog umno`avanja DNK (polymerase chain reaction) je metod za selektivno omogu}ava brzu, specifi~nu i visoko senzitivnu in vitro umno`avanje DNK sekvenci.Ona sekvenci amplifikaciju (umno`avanje) `eljenog segmenta DNK. Zbog toga ima {iroki spektar primene po~ev od upotrebe u dijagnostici naslednih oboljenja pa do upotrebe u paleobiologiji za analizu DNK fosila. Da bismo analizirali neki gen pomo}u PCR-a, moramo imati bar neke informacije o sekvenci datog gena, na osnovu kojih se sinteti{u tzv. “prajmeri20”.Te informacije se mogu dobiti na primer na osnovu sekvence aminokiselina u proteinu koji taj gen kodira. Osnovni princip PCR amplifikacije `eljenog segmenta DNK je veoma jednostavan i zapravo predstavlja imitaciju replikacije DNK, DNK procesa koji se normalno odigrava u svim `ivim organizmima. Replikacija DNK je proces u kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva nova, identi~na molekula DNK. Upro{}eno re~eno, za replikaciju DNK je potrebna DNK matrica, prajmer, gradivni blokovi-nukleotidi i enzim koji katalizuje ugradnju nukleotida po principu komplementarnosti sa matricom (DNK zavisna DNK polimeraza). U PCRPCR-u, s obzirom da sami biramo prajmere, imamo dirigovanu sintezu ta~no odre|enog dela DNK ograni~enog prajmerima. Prajmerima ograni~eni deo DNK koji koji se umno`ava produkuje pribli`no 228 tj. preko milijardu kopija. PCR reakcija se odvija u mikrotubi, gde se podvrgava preciznim, cikli~nim promenama temperature, {to ima za posledicu amplifikaciju ta~no odre|enog gena ili dela gena, milion do milijardu puta. Jedan ciklus ~ine ( sl.1 ) : 1) denaturacija DNK matrice 2) hibridizacija prajmera sa matricom 3) elongacija prajmera.

Shematski prikaz procesa DNK amplifikacije PCR-om.

1) Denaturacija dvo~lane DNK Denaturacija dvolan~ane DNK mo`e se posti}i pomo}u vi{e fizi~kih i hemijskih sredstava, a naj~e{}e se upotrebljava zagrevanje na 950C. Zagrevanje smese tokom 3-5 minuta na 95°C je dovoljno za kompletnu denaturaciju DNK.DNK ima sposobnost i da se renaturi{e, postepenim hla|enjem. 20

prajmer je kratak oligonukleotidni lanac na ~iji 3’ kraj DNK polimeraza dodaje nukleotide u procesu ekstenzije prajmera. 76

GENETIKA I 2) Hibridizacija prajmera sa matricom (aniling) Najkriti~niji korak u optimizaciji PCR-a je izbor temperature za hibridizaciju prajmera sa matricom. Po{to su prajmeri za PCR obi~no du`ine oko 20 nukleotida, mo`e se o~ekivati da se sekvenca komplementarna prajmerima na|e samo na jednom mestu u genomu jednog organizma.Na disocirani lanac DNK se vezuju prajmeri kada se PCR smesa ohladi do temperature hibridizacije. Optimalna temperatura hibridizacije se kre}e u rasponu 420C-650C. 3) Elongacija prajmera prajmera Vreme trajanja elongacije prajmera zavisi od du`ine ciljne sekvence koju `elimo da umno`imo, kao i od temperature na kojoj se izvodi korak elongacije. Posle vezivanja prajmera enzim DNK-polimeraza katalizuje sintezu novih lanaca DNK dodaju}i komplementarne nukleotide. Elongacija prajmera tj. ugradnja nukleotida na 3’ krajeve prajmera se odvija na 720C i katalizovana je DNK- polimerazom. Broj DNK lanaca udvostru~ava se posle svakog ciklusa. Broj ciklusa u PCR metodi se obi~no kre}e od 25 do 35. Posle zavr{etka reakcija se obi~no analizira elektroforezom na gelu agaroze uz markere poznate veli~ine tj. ispituje se da li du`ina nastalog PCR produkta odgovara predvi|enom rastojanju izme|u prajmera. Osnovna prednost PCR-a je mogu}nost dobijanja ve}e koli~ine `eljenog produkta iz drasti~no malih koli~ina polaznog materijala. Pokazano je da se PCR mo`e uspe{no primeniti i za umno`avanje sekvenci sa jednog jedinog polaznog molekula. Po{to za reakcije PCR-a nije potrebna visokokvalitetna i pre~i{}ena DNK, PCR je mogu} gotovo na svim DNK izolatima. Taq polimeraza Prvobitni PCR eksperimenti izvo|eni su sa DNK-polimerazom iz bakterije Escherichia coli i nakon svakog koraka denaturacije morala se dodavati nova koli~ina enzima, po{to bi ova DNK- polimeraza bivala inaktivirana na tako visokim temperaturama denaturacije. Zbog toga je otkri}e termostabilnih DNK-polimeraza u~inilo mogu}im efikasnu in vitro DNK amplifikaciju, bez potrebe naknadnog dodavanja novih koli~ina. Taq polimeraza je termostabilna DNK zavisna DNK-polimeraza, koja je prvi put izolovana iz bakterije Thermus aquaticus , koja raste na temperaturi od 700C do 750C u toplim izvorima Jeloustonskog nacionalnog parka u SAD. Taq DNK- polimeraza ima ograni~enu sposobnost da sinteti{e DNK iznad 900C, enzim je relativno stabilan i nije denaturisan nepovratno pri izlaganju visokoj temperaturi. Prose~na brzina ugradnje nukleotida katalizovane Taq polimerazom na 72°C iznosi 35-100 nukleotida u sekundi. Mogu}nost primene PCR metode Ako se zna da klasi~ne metode kloniranja pojedinih delova DNK traju nekoliko nedelja, pa i nekoliko meseci, onda se vidi za{to je PCR postao neophodan svakoj laboratoriji koja se bavi kloniranjem, karakterisanjem i funkcionalnom analizom gena. Umno`avanje fragmenata DNK pomo}u PCR tehnologije koristi se u razli~ite svrhe, na primer u dijagnostici naslednih obolenja, za direktnu detekciju virusnog genoma u klini~kom materijalu, (kao {to je slu~aj sa genomom HIV-a , koji se otkriva primenom RT-PCR metode -PCR metode kojoj prethodi reverzna transkripcija). PCR se koristi za dijagnostiku mikobakterija, hlamidija i mikoplazmi, za utvr|ivanje o~instva, u sudskoj medicini. Za paleobiologe je posebno atraktivna mogu}nost analiziranja DNK fosila pomo}u PCR metode (na ovaj na~in su analizirani termit Mastotermes electrodominikus, star 30 miliona godina, i p~ela bez `aoke Proplebeia dominicana, stara 25-40 miliona godina).Pomo}u PCR-a se mo`e prou~avati i DNK iz 77

GENETIKA I egipatskih mumija starih po nekoliko hiljada godina. PCR se koristi i u otkrivanju genetski modifikovane hrane, molekularnoj ekologiji i molekularnoj evoluciji biljaka, `ivotinja, ljudi.

78

GENETIKA I Lokacija gena Mapa na kojoj su ozna~ene pozicije gena na pojedina~nim hromozomima naziva se hromozomska ili geneti~ka mapa. Lokacija gena je odre|ena sistemom traka21 na hromozomima. Ovde je prikazan crte` ljudskog hromozoma 17, na kome su prikazane karakteristi~ne ve}e trakaste {are koje se uo~avaju posle bojenja. Po konvenciji, hromozomi se crtaju sa kra}im krakom na vrhu, obele`enim p(fr. Petit=mali) i du`im krakom na dnu obele`enim q (fr. Queue=rep;kraj) Da bi pokazali lokaciju gena na pojedinom hromozomu, broj hromozoma je pra}en znakom p ili q i zatim brojem trake i pod-trake. Tako npr. 17p13.3 odre|uje p krak hromozoma 17, traka 13, podtraka 3. U nekim slu~ajevima poznata je samo pribli`na lokacija, tako da je dat opseg brojeva. Od septembra 2000., 388 gena je identifikovano na ljudskom hromozomu 17. Ovo je samo mali deo onoga {to se danas zna o humanom genomu. Najve}i deo informacija koje su ovde prezentovane su preuzete sa sajta Online Mendelian Inheritance in Man (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/). Za dalje informacije posetite ovaj sajt.

21

Trakiranje hromozoma: hromozomi su tretirani enzimima i zatim obojeni. Kao rezultat dobija se karakteristi~na {ara od svetlih i tamnih traka, specifi~na za svaki hromozom.Tamniji regioni su genetski neaktivni- heterohromatin. Svetliji regioni su manje kondenzovani i transkriptivno aktivni regioni-euhromatin. 79

GENETIKA I Populaciona genetika Populaciona genetika je nauka koja prou~ava nasle|ivanje na nivou populacija (npr. u~estalosti gena, sisteme ukr{tanja). Populacija je grupa jedinki iste vrste koje naseljavaju odre|eno stani{te. Unutar populacije jedinke se slobodno ukr{taju i daju plodno potomstvo. Ukoliko vrsta zauzima ve}a prostranstva i naseljava razli~ita stani{ta, kao {to je slu~aj sa vrstom Homo sapiens, onda je vrsta sastavljena od ve}eg broja populacija. Udaljene populacije su podlo`ne promenama, pa se populacije razlikuju izme|u sebe u prostoru i vremenu. Tokom vremena promene se akumuliraju i mogu da dovedu do divergencije unutar vrste.

Geni i u~estalost genotipova Kao {to svaka jedinka ima svoje geneti~ke karakteristike tako i populacija u jednom odre|enom trenutku ima svoju geneti~ku strukturu, strukturu odre|enu u~estalost (frekvenciju) genskih alela i njihovih kombinacija. Pod fondom gena jedne populacije podrazumeva se skup svih gena koje sadr`e jedinke te populacije.

Kodominantni aleli Zamislite populaciju od 1000 jedinki, svu testiranu na MN lokus krvne grupe. U najjednostavnijoj formi ovaj lokus mo`e biti sveden na kodominantni sistem sa dva alela M i N (u realnosti je mnogo slo`enije). Svaka jedinka u populaciji je ili M (ima 2 M alela), MN(heterozigot) ili N (ima 2 N alela). Zamislite da su rezultati uzorkovanja krvi slede}i: 300M jedinki, 600MN jedinki, i 100N jedinki. Pitanje je koja je frekvencija svakog alela u ovoj populaciji? Izra~unajmo prvo frekvenciju M alela u populaciji: U 1000 jedinki svaka ima po 2 alela na MN lokusu=2000 gena Svaka M jedinka ima 2 M alela 300×2=600M alela Svaka MN jedinka ima 1 M alel 600×1=600M alela Iz toga sledi da ukupno ima 1200M alela u populaciji od 2000gena. Genska frekvencija M alela je :1200/2000=0.6 Sada izra~unajmo frekvenciju N alela: Svaka N jedinka ima 2N alela 100×2=200N alela Svaka MN jedinka ima 1N alel 600×1=600N alela U~estalost N alela je: 800/2000=0.4 Prime}ujete kada imate 2 alela u populaciji, zbir njihovih genskih frekvencija je 1. Ako ne dobijete takav rezultat, onda ste negde pogre{ili. Napi{imo formulu za izra~unavanje genske frekvencije: Genska frekvencija=(2× broj homozigota + broj heterozigota)/ 2× broj jedinki u populaciji Genska frekvencija jednog alela je= 1- genska frekvencija drugog alela

80

GENETIKA I Hardy--Weinberg Weinberg-- ova ravnote`a Hardy Za mnoge ljudske autozomno recesivne osobine heterozigot se ne mo`e razlikovati od normalnog homozigota. Kada se ovo dogodi Hardy Weinberg-ova ravnote`a se primenjuje. Ovi autori, Hardy u Engleskoj i Weinberg u Nema~koj su koristili razli~ita dostignu}a ali su do{li do istih zaklju~aka 1908. Pretpostavili su da su za populaciju ispunjeni slede}i uslovi: 1. Velika populacija 2.Slobodno ukr{tanje 3. Nema efekta povratne mutacije 4.Nema selekcije protiv bilo kog fenotipa 5. Nema migracija iz ili u populaciju 6. Autozomalni lokus Pod ovim pretpostavkama, Hardy i Weinberg su na{li da se genska frekvencija i genotipska frekvencija u populaciji ne menja iz generacije u generaciju. [Tavi{e ako je frekvencija dominantnog alela A u populaciji p, a frekvencija recesivnog alela a u populaciji q, onda posle jedne generacije slobodnog ukr{tanja frekvencije genotipova bi ostale fiksne i bile u slede}em odnosu: 2pq (Aa) q2 (aa) p2 (AA) Po{to su samo dva alela u populaciji, p+q=1 i p2 +2pq+q2=1 Pogledajmo sada da li je uzorak iz realne populacije podeljen kao p2 (M), 2pq (MN), q2 (N). 1975. Race i Sanger su uzorkovali 1279 jedinki u Londonu. Na{li su da su 363 osobe M, 634 MN i 282 N. Koriste}i ovaj originalan metod izra~unavanja frekvencije gena, frekvencija M alela(p) bi bila: p=(2×363+ 634)/(2×1279)=0,53167 Frekvencija N alela(q) bi bila: q=(2×282+634)/ (2×1279)=0,46833 Kada bi populacija bila po Hardy- Weinbergovoj ravnote`i, broj M individua bi bio p2×1279, broj MN individua 2pq×1279 i broj N individua q2×1279 ili Posmatrano O~ekivano

M 363 361,54

MN 634 636,93

N 282 280,53

Zna~i mo`emo biti sigurni u upotrebu Hardy- Weinberg-ove ravnote`e u slu~ajevima kada heterozigot ne mo`e biti detektovan. Razmotrimo primer upotrebe Hardy-Weinberg-ovog principa u medicinskoj genetici: Pretpostavimo da postoji autozomno recesivna bolest kod koje je frekvencija obolelih u populaciji 1/10000. Ako je populacija po Hardy Weinberg-ovoj ravnote`i, ova frekvencija bi 1 {to iznosi iznosila q2. Genska frekvencija recesivnog alela (q) bila bi onda q 2 tj. 10000 1/100. Frekvencija nosilaca (heterozigota) je (2pq) je ~esto pribli`na 2q po{to je p(0,99) pribli`no 1. Onda je frekvencija nosilaca 1/50. Zna~i za autozomno recesivnu bolest sa populacionom frekvencijom od 1/10000, frekvencija nosilaca je 1/50. 81

GENETIKA I Ako ,slu~ajno, osoba ima brata ili sestru sa autozomno recesivnom bole{}u koja je prisutna po ro|enju, verovatno}a da je ta osoba nosilac je 2/3. Ako ta osoba `eli da ima dete sa “nasumi~no” izabranim partnerom iz op{te populacije sa kojim nije u srodstvu, a frekvencija bolesti u op{toj populaciji je 1/10000, verovatno}a da }e dete biti obolelo je : (2/3)(verovatno}a da je student nosilac)×(1/50) (Verovatno}a da je nasumi~no odabrana 2 1 1 1 jedinka nosilac)×(1/4)(verovatno}a da 2 nosioca dobiju obolelo dete)= ⋅ ⋅ = . 3 50 4 300 Uporedite gore dobijeni rezultat sa verovatno}om da dve nesrodne jedinke, bez istorije bolesti u svojim familijama, dobiju obolelo dete, kada je frekvencija nosilaca 1/50: 1 1 1 1 ⋅ ⋅ = 50 50 4 10000

82

GENETIKA I

ZADACI: 39. U populaciji od 1000 jedinki utvr|ena je slede}a distribucija genotipova : AA 800 Aa/aA 185 aa 15 Izra~unati frekvencije A i a alela. 40. U Populaciji od 2000 jedinki utvr|ena je slede}a distribucija genotipova: AA 586 Aa 1200 aa 214 Izra~unati frekvencije A i a alela. 41.U populaciji od 1200 jedinki utvr|ena je slede}a distribucija genotipova: AA 400 Aa 600 aa 200 a) Izra~unati frekvencije alela. b) Kolika bi bila o~ekivana distribucija kada bi populacija bila po Hardy- Weinberg -ovoj ravnote`i? 42.U populaciji od 2000 jedinki, frekvencija A alela je: p=0,6. Kolika je distribucija Aa genotipova, ako je populacija po Hardy- Weinbergovoj ravnote`i? 43. U populaciji od 1500 jedinki, distribucija AA genotipa je 421. Kolika je distribucija Aa genotipa, ako je populacija po Hardy Weinbergovoj ravnote`i? 44*. Mladic, koji ima brata sa retkom autozomnom recesivnom bole{}u, `eli da ima dete sa devojkom koja ima sestru sa istom bole{}u. Njihovi roditelji ne ispoljavaju znake te bolesti. A) Kolika je verovatno}a da }e njihovo dete biti bolesno? Devojka se ipak na kraju uda za mladicevog prijatelja koji je zdrav i nije imao znake te bolesti u porodici. Frekvencija obolelih od te bolesti u populaciji je 1/40000. B) Kolika je verovatno}a da }e njihovo dete biti obolelo? 45. Frekvencija obolelih od neke autozomno recesivne bolesti je 1/3600. Kolika je verovatno}a da 2 zdrave osobe, koje nisu u srodstvu i koje nemaju obolele u familiji imaju obolelo dete? 46.* U velikoj populaciji Mimulus guttatus , po jedan list je uzet od svake biljke. Listovi su smrvljeni i podvrgnuti gel elektroforezi. Gel je zatim bojen za specifi~an enzim X. 6 razli~itih traka je dobijeno:

83

GENETIKA I

a) Prona|i geneti~ko obja{njenje za postojanje ovih 6 tipova. B) Kolika je frekvencija alela u populaciji? C) Da li je populacija u Hardy- Weinbergovoj ravnote`i?

84

GENETIKA I mutacije Stopa mut acije Stopa mutacije je mera u~estalosti mutiranja jednog gena. Ozna~ava ukupnu proporciju odre|enih gena u populaciji koji mutiraju po jednoj generaciji. Stopa mutiranja je karakteristi~na za svaki gen ponaosob, ali mo`e biti manja ili ve}a zavisno od uslova pod kojima se odvija razvi}e organizma. Mutageni ~inioci(npr. Jonizuju}a zra~enja, neke hemijske supstance...) mogu znatno pove}ati stopu mutiranja gena. Ako autozomno dominantan poreme}aj pokazuje potpunu izra`enost,i zato je uvek ispoljen kod heterozigota, prora~un njegove stope mutacije se lako dobija prebrojavanjem broja novih slu~ajeva u odre|enom broju ro|enih. Razmotrimo uzorak od 100000 dece, od kojih 12 je obolelo od autozomno dominantne bolesti ahondroplazije. Samo dvoje od ove dece ima obolelog roditelja, tako da kod ostalih 10 bolest se javila kao posledica nove mutacije. Dakle 10 novih mutacija se desilo me|u 200000 nasle|enih gena kod ove dece (svako dete je nasledilo 2 gena), pa je stopa mutacije 1 u 20000 gameta u generaciji.

Geneti~ki drift U prirodi u najve}em broju slu~ajeva broj gameta u jednoj generaciji daleko prevazilazi broj jedinki koje se dobijaju u slede}oj generaciji, tj. veoma mali deo stvorenih gameta u~estvuje u formiranju adulta slede}e generacije. Kod “dovoljno velike” populacije tj. “idealne” populacije (broj jedinki u populaciji te`i ∝) “uzimanje” gameta iz populacije ne dovodi do slu~ajnih promena u u~estalostima genskih alela. Prirodne populacije nisu idealne jer sadr`e kona~an broj jedinki. Kolika god da je realna populacija, u slede}oj generaciji }e se javiti odstupanje u u~estalostima genskih alelageneti~ki drift, pri ~emu je u manjim populacijama odstupanje ve}e, a {to je populacija ve}a odstupanje se smanjuje. Geneti~ki drift- slu~ajne promene u~estalosti alela u populaciji tokom generacija.

85

GENETIKA I Re{enja zadataka 1. ATCCGTACAGAT ↓ A→T, G→C, T→A, C→G TAGGCATGTCTA 2. GC=56%, G=C=56%: 2=28% , AT= 100%-56%= 44% , A=T= 44%: 2=22% 3. A=10%, C=40% 4. T=15% ⇒ AT=30% ⇒ GC=100%-30%=70% ⇒ C=35% 5. A=32% 6. Ako je C=24% u jednom lancu, onda je i G=24% u komplementarnom lancu. Analogijom T=18%, C=20% i A= 100%-(24%+18%+20%)=38% 7. A=30%, G=40% u komplementarnom lancu. G=15%, A= 100%-(30%+40%+15%)=15% u prvom lancu. 8. D=20% ⇒ B=20% ⇒ F=20%, (A+C+E)= 100%-3×20%= 40%, A=C=E=40/3=13,333%. 9. A=10% ⇒ D=10% ⇒ G=10%; H=5% ⇒ E=5% ⇒B= 5%; G+F+J=100%-(30%+15%)= 55% ⇒G=F=J=55%/3=18.33% 10. I lanac II lanac A= 20% ⇒ T=20% G=10% ⇐ C=10% C=5% ⇐ G=5% T=100%-(A+G+C)=65% ⇒ A=65% Na|ena je zastupljenost baza u pojedina~nim lancima DNK. Zastupljenost u molekulu se dobija tako {to se sabere zastupljenost baze u I i zastupljenost baze u II lancu i rezultat podeli sa 2. Tako se dobijaju rezultati: A=42.5%, T=42.5%, C=7.5%, G=7.5% 11.

12. Prajmer je kratak segment RNK koji sinteti{e primaza, koriste}i DNK kao kalup u toku DNK replikacije. Nakon {to je prajmer sintetisan DNK polimeraza dodaje DNK na 3’ kraj RNK. Prajmeri su potrebni zato sto DNK polimeraza ne moze da inicira(zapocne) DNK replikaciju i zahteva 3’ kraj. DNK kasnije zamenjuje RNK. 13.UCGGAUUAGUGUC 14. Primarni transkript:UAGUCUAAGCAGUGAC iRNK:UA UGAC AT CAGATTCGTC ACTG egzon

intron

egzon

86

GENETIKA I 15. 1) AAA-GCC-AUG-CCG-GUG 2) Koriste}i kod dobijamo: Lys-Ala-Met-Pro-Val 16. C G T A C C A C G C A T G G T G G C A U G G U G C G U A C C A C Ala

Trp

T A A U

G C C G

Stop

C G G C Arg

A T U A

DNK dupli heliks iRNK(mRNK) Odgovaraju}i tRNK antikodon Aminokiseline ugra|ene u protein

17. 1) GG(A,G,T,C)- CT(T,C)- CT(A,G)- TA(A,G,T)- CA(A,G,T,C) 2)CC(U,C ,A ,G)-GA(A,G)-GA(U,C)-AU(U,C,A)- GU(U,C,A,G) tRNK: GG(A,G,U,C);CU(U,C); CU(A,G); UA(A,G,U); CA(A,G,U,C) Navedeno je “najgrublje” re{enje za t RNK, jer ako za|emo u finese oko kodon- antikodon sparivanja kod tre}eg nukleotida antikodona(5’kraj antikodona) koji je “kolebljiv” tj. jedan antikodon mo`e odgovarati ve}em broju kodona, imamo jo{ mogu}nosti. Ukratko pravila za kodon- antikodon sparivanje su: 5’kraj antikodona 3’ kraj kodona G U ili C C samo G A samo U U A ili G I U,C ili A I-inozin (retka baza na|ena kod tRNK,~esto u antikodonu)

18.Vidimo da je u lancu Asn zamenjen sa Lys. Nukleotidni sastav za Asn je AA(U,C), tj. u DNK TT(A,G) a za LysAA(A,G) tj. U DNK TT(T,C). Zna~i izvr{ena je zamena nukleotida:A→T ili A→C ili G→T ili G→C. 87

GENETIKA I 19. Dodatkom A na po~etak kodiraju}e sekvence, deo za ~itanje se pomera, pa nova trijada nukleotida glasi: -ACG-AUC-GGA-ACC-ACG-UGA-UAA-GCA, a redosled aminokiselina je: - Thr - Ile - Gly - Thr - Thr - stop - stop20.ORIGINAL: His- Thr- Glu- Asp- Trp- Leu- His- Gln- AspPROMENJENA: His- Asp- Arg- Gly- Leu- Ala- Thr- Ser- Asp-. Napi{imo sekvencu mRNK(iRNK-m messenger ili informaciona RNK) za originalnu proteinsku sekvencu (His- Thr- Glu- Asp- Trp- Leu- His- Gln- Asp-) CA(U,C)-AC(U,C,A,G)-GA(A,G)-GA(U,C)-UGG-CU(U,C,A,G)-CA(U,C)-CA(A,G)-GA(U,C)-UU(A,G)-

Upore|ivanjem originalne sekvence sa promenjenom, zaklju~ujemo da je do promene do{lo posle prve aminokiseline (His) i to ,kako je u zadatku re~eno, usled adicije 1 nukleotida. Zna~i Thr se promenio u Asp. Ova promena je rezultat adicije G ispred kodona za Thr, {to dovodi do pomeranja dela za ~itanje, pa je trijada nukleotida promenjena.Napi{imo sekvencu mRNK za promenjenu proteinsku sekvencu:: ↓ (A,G) CA(U,C)- GAC-(U,C,A,G)GA-(A,G)GA- (U,C)UG-G(C,U)U- (U,C,A,G)CA-(U,C)CA↑- GA(U,C)-

His- Asp- Arg- Gly- Leu- Ala- Thr- Ser- AspDa bi krajnji kodon bio za Asp, moralo je do}i do delecije A ili G na kraju pretposlednjeg originalnog kodona. Zna~i dodat je G, a izba~en je A ili G. 21.ORIGINAL: Lys- Ser- Pro- Ser- Leu- Asn- Ala- Ala- Lys↑

A

ORIGINAL:AA(A,G)- GU-CCA-UCA-CUU-AAU-GC(U,C,A,G)-GC(U,C,A,G)- AA(A,G) PROMENJEN: Lys- Val- His- His- Leu- Met- Ala- Ala- Lys- . ↓ PROMENJEN:AA(A,G)-GUC-CAU-CAC-UUA-AUG-GC(U,C,A,G)-GC(U,C,A,G)AA(A,G) Zna~i, izvr{ena je delecija A a adicija G. 22. Deo sekvence proteina je: - Ala- Pro- Trp- Ser- Glu- Lys- Cys- HisMutant 1 Arg→Ser, npr. promena AGU→AGC Mutant 2 Trp→Stop, UGG→UGA Mutant 3 DNK original CGN-GGN-ACC-AGN(TC A/G)-CT T/C-TT T/C- AC A/G-GT A/G Ala- Pro- Trp Ser - Glu - Lys Cys His N =A,G,T,C Promena- inverzija Promenjena DNK CGN-GGN-ACC - AAA-AAG-TGA-  AC A/G-GT A/G Ala - Pro - Trp - Phe - Phe - Thr - Cys - His

88

GENETIKA I

23. 1)

2)

89

GENETIKA I

Nenazubljen obod ima 1/4 sadnica, 463/4=115,75. Nazubljen 463/(3/4)=347,25. 24. AB ab Ab AaBb × AaBb AB crn crn crn ab crn `ut crven Ab crn crven crven aB crn jetre crn 9/16 crne boje, 3/16 boje jetre, 3/16 crvene boje, 1/16 boje limuna. 25.

aB crn jetre crn jetre

90

GENETIKA I 3/4 mu{ica }e imati crvene o~i a 1/4 bele. Sve `enke }e imati crvene o~i, a pola ukupnog broja mu`jaka }e imati crvene, a pola bele o~i. 26. P Aa nn × aa Nn F1 1Aa nn , 1 aa nn , 1 aa Nn , 1 Aa Nn 1 ahondroplazija , 1 normalnom , 1 neurofibromatoza, 1 ahondroplazija i neurofibromatoza 27. Ukr{tanje sa mu{icom recesivnog fenotipa. Ako je mu{ica dominantnog fenotipa AA, u F1 generaciji }e biti prisutan samo dominantan fenotip, a ako je Aa bi}e prisutan i recesivan fenotip. 28. AaBb i aabb. 29. A: AaBB B: AABB C: AaBb A-`uta boja, a-zelena boja,B-okruglo seme,b- sme`urano seme. 30. Nerazdvajanje se moralo desiti kod oca, tj. on je morao obrazovati spermatozoid koji nije sadr`ao ni X ni Y hromozom. 31. Na Y hromozomu. 32.Polovina `enki }e imati crn fenotip, a polovina {aren; polovina mu`jaka }e biti crna, a polovina `uta. 33. Prepoznaj vrstu mutacije u molekulu DNK: DNK a) GC→ AT ,tranzicija b) GCT→ACT, nonsens mutacija.GCT- u iRNK CGA (Arg), prelazi u ACT -u iRNK UGA (stop kodon) c) TCA→ AGA , tiha mutacija. Prevedeno u iRNK oba tripleta kodiraju Ser. d) GC→TA, transverzija 34. Ni`e je prikazan hromozom sa 7 gena (od a do g), a tako|e i 3 hromozoma koji su mogli nastati iz njega kao rezultat razli~itih strukturnih promena. Uka`ite na pojavu strukturnih promena i ozna~ite svaku od njih: abcdefg 1) delecija 2) duplikacija 3) inverzija 35.Da je srebrnasta boja ~etina atlantskog kedra u Italiji i atlanskog kedra u Gr~koj kontrolisana istim recesivnim genom-a, tada bi ukr{tanje davalo uniformno potomstvo sa srebrnastom bojom ~etina. Ali ako su u pitanju 2 razli~ite mutacije , boja ~etina italijanskog atlantskog kedra kontrolisana je recesivnim genom- a, a gr~kog kedra - genom b,tada su genotipovi: italijanski kedar-aaBB, gr~ki- Aabb. Rezultat njihovog ukr{tanja su hibridi genotipa AaBb, koji usled dominacije alela A i B imaju standardnu boju ~etina. 36°. a) diploid b) trisomik c)monosomik d)nulsomik e) tetraploid f)triploid 37. b-1, a-2, c-3, e-4, d-5, f-6. 38. a)1. Autozomno dominantno nasle|ivanje. 91

GENETIKA I 2. Preko Y hromozoma. 3.Autozomno recesivno nasle|ivanje. 4. X- vezano recesivno nasle|ivanje. 5. Recesivno nasle|ivanje. B)situiran je na mitohondrijalnom genomu. 39. p(A)=(2×800+185)/(2×1000)=0,8925; q(a)=(2×15+185)/(2×1000)=0,1075 ili kra}e q=1-p 40. p(A)=(2×586+1200)/(2×2000)=0,593 q(a)=1-p=0,407 41.U populaciji od 1200 jedinki utvr|ena je slede}a distribucija genotipova: AA 400 Aa 600 aa 200 a) p=0,58333 i q=0,41667. b) AA bi bilo p2×1200=408,329 ; Aa bi bilo 2pq×1200=583,335; aa bi bilo q2×1200=208,337 42. Ako je p=0,6 , onda je q=1-p=0,4. Distribucija heterozigota Aa je 2pq×2000=960. 43. Ako je distribucija AA genotipa 421, onda p2×1500=421 ⇒ p=0,52978 a q=1-p=0,470. Distribucija Aa genotipa je 2pq×1500≈747. 44*.A) Po{to je mladi} zdrav, njegovi roditelji su zdravi(tj. ne ispoljavaju simptome oboljenja), a ima obolelog brata prema Mendelovim pravilima verovatno}a da je mladi} nosilac “defektnog” alela je 2/3. Isto va`i i za devojku. Verovatno}a da 2 nosioca dobiju obolelo dete je 1/4 pa je verovatno}a da }e njihovo dete biti bolesno je: (2/3) ×(2/3) ×(1/4)=1/9. B) Mladi}ev prijatelj nije u srodstvu s devojkom i mo`emo smatrati da je “nasumi~no” izabran. Po{to je frekvencija obolelih 1/40000⇒ q2=1/40000⇒ q(frekv. “defektnog” alela) = 1 =1/200. Frekvencija nosilaca je 2pq=0,00995 pa je i verovatno}a da je mladi}ev 40000 prijatelj nosilac 0,00995 (po{to je re~eno da je zdrav).Verovatno}a da je devojka nosilac je 2/3, a verovatno}a da 2 nosioca dobiju obolelo dete je 1/4 pa je verovatno}a da }e njihovo dete biti obolelo= (2/3) ×0,00995×(1/4)=0,0016583. 45. q2=1/3600 ⇒ q=1/60⇒2pq=0,0327778. Verovatno}a da dete bude obolelo je: 0,0327778×0,0327778×1/4=0,0002686. 46.* U velikoj populaciji Mimulus guttatus , po jedan list je uzet od svake biljke. Listovi su smrvljeni i podvrgnuti gel elektroforezi. Gel je zatim bojen za specifi~an enzim X. 6 razli~itih traka je dobijeno:

92

GENETIKA I

a) Postoje 3 pozicije traka(npr.S-spora, i-srednja,F-brza), svaka individua poseduje ili 1 ili 2 trake, pa je najjednostavnije obja{njenje da su prisutna 3 alela jednog lokusa(npr. AS,Ai,AF), a individue sa 2 trake su heterozigoti. Dakle 1=S/S, 2=i/i, 3=F/F, 4=S/i, 5=S/F, 6=i/F. B) Frekvencija AS je f(S)=0,04+(1/2)(0,12)+ (1/2)(0,20)=0,20 Frekvencija Aialela je f(i)=0,09+(1/2)(0,12)+(1/2)(0,30)=0,30 Frekvencija AF alela je f(F)=0,25+(1/2)(0,20)+(1/2)(0,30)=0,50 C) Hardy Weinbergove frekvencije genotipova su: (p+q+r)2=p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr=0,04+0,09+0,25+0,12+0,20+0,30=1. Dakle, populacija jeste u ravnote`i.

93

GENETIKA I

Dodatak 11- Geneti~ki kod

94

GENETIKA I Dodatak 22- Strukturne formule 20 aminokiselina u proteinima Nepolarne aminokiseline

Polarne aminokiseline (neutralne)

Kisele aminokiseline

Bazne aminokiseline

95

GENETIKA I Dodatak 3

]elijski ciklus ]elijski ciklus predstavlja seriju faza kroz koje prolazi }elija u toku deobe. Ciklus obuhvata tri faze INTERFAZE (G1, S, G2) i MITOZU.

Mitoza Mitoza je vrsta }elijske deobe u kojoj se od jedne roditeljske }elije formiraju dve }erke }elije(vr{i se deoba jedra- kariokineza, i deoba citoplazme- citokineza), pri ~emu ne dolazi do promena u broju hromozoma. Mitoza je povezana sa rastom i oporavkom o{te}enja u tkivu. Iako predstavlja kontinuiran proces, mitozu delimo na ~etiri glavna stadijuma: 1) PROFAZA- hromozomi se uvijaju i zadebljavaju i postaju vidljivi pod mikroskopom. Svaki hromozom se uzdu`no deli na 2 sestrinske hromatide koje ostaju vezane centromerom. Dolazi do nestanka jedrove membrane i jedarceta.Vr{i se deoba centrozoma, i tako dobijene polovine se kre}u ka polovima }elije . 2)METAFAZA- hromozomi(sada me|usobno vezane sestrinske hromatide)migriraju ka sredini }elije i vezuju se za sredine mikrotubula deobnog vretena, formiraju}i metafaznu plo~u. 3)ANAFAZA-najkra}a faza mitoze. Va`nu ulogu imaju mikrotubule. Sestrinske hromatide se razdvajaju i kre}u prema suprotnim polovima- hromatide postaju nezavisni hromozomi. 4) TELOFAZA-poslednja faza. Ponovo se formira jedarna membrana, jedarce, hromozomi se izdu`uju i vi{e nisu vidljivi. Tako|e se zavr{ava i deoba citoplazme i formiraju se 2 }erke }elije koje imaju iste osobine kao }elija majka. Period izme|u 2 }elijske deobe se naziva INTERFAZA. On traje znatno du`e od perioda aktivne mitoze.

96

GENETIKA I Mitoza

97

GENETIKA I Dodatak 44- Mejoza Mejoza je proces }elijske deobe tokom kojeg se broj hromozoma reproduktivnih }elija smanjuje na polovinu diploidnog(2n) ili somati~nog broja. Rezultat tog procesa je formiranje gameta sa haploidnim (n) brojem hromozoma. Razlikujemo 2 }elijske deobe u okviru mejoze: Prvu mejoti~ku deobu (MEJOZU I) i drugu mejoti~ku deobu (MEJOZU II).

MEJOZA I I u mejozi I razlikujemo 4 faze: profazu I, metafazu I, anafazu I i telofazu I. PROFAZA I: Ova faza je podeljena na 5 podfaza: 1)leptoten- Hromozomi postaju vidljivi, u vidu tankih i dugih niti. Proces kontrakcije hromozoma se nastavlja u leptotenu i kroz celu profazu. Na hromozomima se javljaju zadebljana podru~ja(hromomere), {to im daje izgled ogrlice sa perlama. 2)Zigoten- faza u kojoj dolazi do karakteristi~nog sparivanja homologih hromozomasinapsisa, tako da su odgovaraju}i geneti~ki segmenti postavljeni jedan naspram drugog i spremni za krosing-over. Pri tom svaki od homologih hromozoma je podeljen na 2 hromatide (DNK se ve} replikovala za vreme premejoti~ke S faze). 3)Pahiten- faza u kojoj su dve sestrinske hromatide jednog homologog hromozoma vezane za dve sestrinske hromatide drugog homologog hromozoma. Ova grupa od 4 hromatide je poznata kao tetrada. 4) Diploten- Sestrinske hromatide se polako odvajaju, a javljaju se ukr{tene strukture- hijazme (jednina-hijazma) izme|u nesestrinskih hromatida, koje su pokazatelji krosing-overa. 5)Dijakineza- malo se razlikuje od diplotena. Jedino se nastavlja uvijanje i kontrakcija hromozoma. METAFAZA I- Jedrova membrana i jedarce nestaju. Svi parovi homologih hromozoma se raspore|uju u ekvatorijalnoj ravni. Nesestrinske hromatide se vezuju za niti deobnog vretena suprotnih polova. ANAFAZA I- Homologi hromozomi se udaljavaju ka suprotnim stranama (polovima). TELOFAZA I- kod mnogih organizama ovaj stupanj, kao i interfaza koja sledi(naziva se jo{ interkineza22), ne postoje- ne javlja se jedrova membrana i }elije odmah prelaze u mejozu II. Me|utim kod drugih organizama, hromozomi opet postaju difuzni,javlja se jedrova membrana i nastupa kratka interkineza.

MEJOZA II Razlikujemo 4 podfaze: profaza II, metafaza II, anafaza II i telofaza II. PROFAZA II- nestaje jedrova membrana. METAFAZA II- hromozomi se raspore|uju u ekvatorijalnoj ravni. Veze izme|u hromatida slabe-hromatide se delimi~no rastavljaju i vezuju za niti deobnog vretena. ANAFAZA II- hromatide se odvajaju i odlaze na suprotne polove. TELOFAZA II-Obrazuje se jedrova opna oko hromozoma na polovima, tj. nastaju 4 haploidna jedra, od kojih svako sadr`i po jedan primerak od svakog tipa hromozoma.

22 Interkineza je kratak period “odmora” koji mo`e da postoji izme|u prve i druge mejoti~ke deobe. Za razliku od mitotske interfaze, za vreme interkineze nema hromozomske reduplikacije.

98

GENETIKA I Mejoza I

Mejoza II

99

GENETIKA I Literatura: 1. Griffiths A. J. F., Miller J. H., Suzuki D. T., Lewontin R. C., Gelbart W. M. 2000. An introduction to genetic analysis,7th ed. New York: W. H. Freeman and Company. 2. Mihailovi} M. B. 2000. Biohemija, IV izdanje. Beograd: Nau~na. 3. Crow J. F.1967. Bele{ke iz genetike. Beograd: Savremena administracija. 4. Tuci} N. 1999. Evolucija, ~ovek i dru{tvo. Beograd: Dosije, Alternativna akademska obrazovna mre`a. 5. Mueller R. F., Young I. D. 2001. Emery’s elements of medical genetics.Churchill Livingstone. 6. Calladine C. R. , Drew H. R. 1997. Understanding DNA: The molecule and how it works, 2nd ed. Academic Press. 7. Lewin B. 2000.Genes,7th ed. Oxford University Press. 8. Dikli} V., Kosanovi} M., Nikoli{ J., Duki} S.1997. Biologija sa humanom genetikom. Beograd: Grafopan. 9. Ridli M. 2001. Genom: Autobiografija vrste u 23 poglavlja. Beograd: Plato. 10. Dumanovi} J., Marinkovi} D., Deni} M. 1985. Geneti~ki re~nik. Beograd: Nau~na knjiga 11. Hale W. G., Morgham J. P. 1998. [kolska enciklopedija biologije. Beograd: Knjigakomerc. 12. Tucovi} A. R. 1975. Praktikum iz genetike sa oplemenjivanjem biljaka. Beograd: Gra|evinska knjiga. 13. Kora} D. Medicinska genetika u klini~koj praksi, II izdanje. Beograd- Zagreb: Medicinska knjiga. 14. Romac S., Vukosavi} S., Stojkovi} O., ^uljkovi} B. 1999. PCR u klini~koj dijagnostici. Beograd: Biolo{ki fakultet, PCR Centar. 15. [arac- Sto{i} J.2003. Amplifikacija specifi~ne sekvence DNK pomo}u PCR metode. Republi~ka smotra mladih talenata, Kladovo. 16. Tati} S.,Kosti} G.,Tati} B. 2002. Humani genom: Genetske osnove oboljenja kod ~oveka.Beograd: Zavod za ud`benike i nastavna sredstva. 17. Tati} B. 2000. Biologija za I razred gimnazije i poljoprivredne {kole, XII izdanje. Beograd: Zavod za ud`benike i nastavna sredstva. 18. Timberlake K. C. 2004.Chemistry, Platinum ed. Pearson Education: Benjamin Cummings 19. Pedder I. J., Wynne E. G. 1972. Genetics: A basic guide. London: Hutchinson Educational. 20.Spasojevi} V. S. 1978. Citogenetika.Beograd: Nau~na knjiga. 21. Radoman P. 1972. Organska evolucija. Beograd: Zavod za ud`benike i nastavna sredstva Srbije 22. D`ek ^.2001.Vizuelni re~nik hemije. Beograd: NNK Internacional 23. PRIRODA.1982. Beograd : IRO “Vuk Karad`i}” 24. http:/ www.dnaftb.org 25. http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/

100

GENETIKA I Bele{ke o autoru: [arac- Sto{i} Jana Ro|ena 28.4.1987. u Beogradu. Zavr{ila osnovnu {kolu “Vojvoda Radomir Putnik” u Beogradu i napisala roman”Zami’87” u 8. razredu. Zavr{ila prvi razred Zemunske gimnazije a potom drugi razred gimnazije “Sveti Sava” u Beogradu. Tre}i razred poha|a u Zemunskoj gimnaziji i kona~no zavr{ava ud`benik ”GENETIKA I”. Gotivi skateboarding, prirodne nauke (naro~ito bios i hemiju), istoriju starog veka, klasi~nu filologiju... Dosada{nji polaznik seminara u ISP. Dalji planovi? Najverovatniji student i kasnije nezaposleni molekularni biolog i/ili biohemi~ar.

101

GENETIKA I Jana [arac[arac- Sto{i} Genetika I Izdava~ Marica [arac Jana [arac[arac- Sto{i} Urednik Marica [arac Kompjuterska priprema Jana [arac[arac- Sto{i} [tampa Jana [arac[arac- Sto{i} Tira` 50

102