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Extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura. Article · January 2006

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CIENCIA 14 (Número Especial2), 331 - 340, 2006 Maracaibo, Venezuela

Extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura Alexis Ferrer1 *, Lauris Urribarrí1, José Petersl, Orlaidy González1, Maria Terán 1, David Chacón 1 y Alfonso Bravo 2 'Laboratorio de Instrumentación Analítica, Departamento de Química, Facultad Experimental 2 de Ciencias. Laboratorio de Investigación y Desarrollo en Nutrición, Escuela de Nutrición y Dietética, Facultad de Medicina. La Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela Recibido: 11-09-06

Acep tado: 14-12-06

Resumen En este trabajo se establecieron las condiciones de extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura, para obtener concentrados proteicos con aplicación potencial en dietas avícolas y porcinas. La Lemna obscura, es una planta acuática, que se caracteriza por un crecimiento acelerado y un alto valor nutricional, constituyendo un gran potencial como fuente proteica. Para la obtención del concentrado proteico fue necesario extraer las proteínas del material fibroso y precipitarlas cerca de su punto isoeléctrico. La Lemna obscura se recolectó en la Punta Don Alons o. Barranquitas, Edo. Zulla, se secó , molió y luego se sometió a extracciones con soluciones a diferentes pH (soluciones de hidróxido de calcio a pH 7 y 10, y agua destilada a pH 5 ,56). relación sólido/liquido 1:15, diferentes temperaturas (30, 45, 60, 75°C) y tiempo de extracción d e 45 rnin. Se realizaron las precipitaciones a partir de extractos obtenidos en condiciones óptimas de extracción, variando la temperatura en baño maria a 50, 65 y 80°C y ajustando el pH a 3 y 3 ,5 con HCL O, 1 M. Las proteínas precipitadas se separaron por crornatografia de permeación de gel (GPC) con Sephadex G- 100 y las fracciones obtenidas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) determinándose sus masas molares. Se establecieron como condiciones óptimas de extracción: agua destilada corno agente extractan te (pH 5,56). temperatura de 45°C, relación sólido /liquido 1: 15 y tiempo de 45 min. condiciones para las que se obtuvo el máximo rendimiento , 40o/o. El máximo rendi miento de precipitación de proteínas para la Lemna obscura fue de 42% a pH 3,5 y 50°C. La proteína más abundante tuvo una masa molar similar a la de la enzima Rubisco. El concentrado obtenido presentó un contenido proteico de 36%. Palabras clave: Extracción; Lemna obscura; precipitación; proteínas.

* Autor para la correspondencia. E-mail : [email protected]

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Extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura

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Protein extraction and precipitation from Lemna obscura Abstract Extraction and precipitation conditions for the proteins of Lemna obscura were established in this work in arder to obtain protein concentrates with potential application in poultry and swine.diets. Lemna obscura is an aquatic plant with an accelerated growth and high nutritional value, constituting a great potential as a protein source. It was necessary to extract the proteins from the fibrous material and precipitate them near their isoelectric point. Lemna obscura was collected at Punta Don Alonso, Barranquitas in Zulla State, dried, milled and then subjected to extraction at different pH val u es (calcium hydroxide solutions at pH 7 and 1O, and distilled water at pH 5. 56), 1: 15 solid/liquid ratio, different temperatures (30, 45, 60 and 75°C) and 45 min as extraction time. Protein precipitations from protein extracts obtained at optimal conditions were carried out at 50, 65 and 80°C and adjusting the pH at 3 and 3.5 with 0. 1M HCL Precipitated proteins were separated by gel permeation chromatography (GPC) with Sephadex G-100 and the resulting fractions were subjected to sodium dodecyl sulfate- polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) determining their molar masses. Optimal extraction conditions were: distilled water as the extraction agent at pH 5.56, 45°C, 1: 15 solid/liquid ratio and 45 min, which produced the highest yield. 40%. The highest protein precipitation yield was 42% at pH 3,5 and 50°C. The most abundant protein hada molar mass similar to Rubisco. The . protein content of the concentrate was 36%. Key words: Extraction; Lemna obscur~ precipitation; protein.

Introducción Dado el crecimiento abundante de la Lemna obscura en el Lago de Maracaibo

(entre 4 y 9% de la superficie del lago) en el último año, los investigadores se han abocado a estudiar posibles alternativas para su aprovechamiento. Actualmente, se suele esperar que la Lemna se acerque a las costas del estrecho del Lago de Maracaibo para facilitar su recolección. Como resultado, cada cierto tiempo se dispone de una gran cantidad de biomasa con problemas de disposición. Existen muchas evidencias en la literatura del uso directo de Lemna sp. con alto contenido proteico (30%) en la alimentación de cerdos y aves ( l-3) con excelentes resultados. Por lo general. la Lemna sp. se suele cultivar en fincas con pequeños estanques y se recoge cada dos días para alimentar un número reducido de cerdos o aves sin necesidad de deshidratarse. En el caso de la Lemna recogida en el Lago de Ma-

racaibo, es necesario secarla para garantizar su conservación si se quiere usar como alimento. El uso de esta planta por animales de estómago simple, tiene el potencial de sustituir la harina de soya importada que es la fuente proteica más importante utilizada en los alimentos balanceados. Esta propuesta requiere que la biomasa tenga un nivel muy bajo de fibras (4), ya que éstas dificultan la disponibilidad de las proteínas y limitan la absorción de otros nutrientes por parte de los animales. Dadas estas premisas, el objetivo principal de este trabajo fue establecer las condiciones de extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura, para obtener concentrados proteicos con posible aplicación en dietas avícolas y porcinas, así como iniciar los estudios de fraccionamiento. De esta manera se estaría dando uso a este nuevo recurso presente en la Cuenca del Lago de Maracaibo, que pudiera incrementar la oferta de alimentos en el futuro.

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Materiales y Métodos Material La Lemna obscura se recolectó en la Punta Don Alonso, Barranquitas, Edo. Zulia. El material se secó en un homo de convección forzada a 60°C por 72 h. Luego se molió hasta un tamaño de partícula de lmm, en un equipo de laboratorio.

Caracterización de la biomasa A las muestras se les determinó el contenido de humedad (5). proteína cruda por el método de Kjeldahl y el contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina por el método de Goering y Van Soest (6).

Extracción de proteínas Para las extracciones se siguió el procedimiento planteado por Urribarri y col. , (7,8). Se utilizaron 2 g de muestra en base seca para las extracciones por triplicado, usando como agente extractante soluciones de hidróxido de calcio. Se realizaron ensayos preliminares utilizando diferentes valores de pH inicial del agente extractante (10 , 11, 12 y 12,6). relación sólido/líquido ( 1: 1 O y 1: 15) y diferentes tiempos de extracción (5, 10, 20, 30, 45 y 60 min) para seleccionar la relación sólido/líquido y el tiempo de extracción adecuados. Una vez seleccionados estos parámetros, se realizaron extracciones con soluciones de hidróxido de calcio a pH 7 y 1O y agua destilada (pH 5 ,56). a una relación sólido/ /liquido 1:15, diferentes temperaturas (30, 45, 60, 75°C) y un tiempo de extracción de 45 min. Posteriormente, se les determinó proteína soluble (por duplicado) a los extractos por el método de Lowry (9). previa construcción de la curva de calibración, utilizando para medir la absorbancia un Espectrofotómetro UVvisible Cary 50 (Varían Associates INC , California, USA) a una longitud de onda de 741,9 nm. Se calculó el porcentaje de rendimiento como el cociente de los gramos de proteína soluble extraída y los gramos de proteína cruda inicial por cien.

333

Determinación del punto isoélectrico de las proteínas Para la determinación del punto isoélectrico de la proteínas se construyó un gradiente de pH (2,0- 6 ,5) a partir de alícuotas de 1O mL de solución proteica ajus tando el pH con una solución de HCl O, 1 N en intervalos de 0,5 a temperatura ambiente. Luego se centrifugaron a 6880g durante 10 minutos. Se tomaron alícuotas de 1 mL del sobrenadan te de cada uno de los tubos y se les determinó proteína soluble por el método de Lowry. Con los valores de absorbancia obtenidos se estimó por diferencia la cantidad de proteínas que precipitó. Se confirmó la proteína precipitada pesando el precipitado obtenido y determinándose el contenido de proteína cruda por el método Kjeldahl. Precipitación de proteínas Se siguió la técnica reportada por Urribarrí y col. (7). Se agregaron alícuotas de 10 mL del extracto prot eico en erlenmeyers de lOO mL, se ajustó el pH cercano al punto isoeléctrico de las proteínas (pH 3 y 3,5) con una solución de HCL O, 1 N. Los erlenmeyers se colocaron en baño maria a temperaturas de 50, 65 y 80°C durante 30 min. Una vez cumplido el tiempo de precipitación se centrifugaron a 10.000 rpm a 10°C por 10 min en una Centrifuga Centra NTMP4R (Internacional Equipment Company, Nedham Heights. Massachussets, USA). separando así la proteína precipitada del sobrenadante. Finalmente se determinó la proteína soluble a los sobrenadantes por el método de Lowry modificado. La proteína precipitada se determinó por diferencia entre la proteína del extracto respectivo y la del sobrenadante . El porcentaje de rendimiento de precipitación se calculó como el cociente entre la proteína precipitada y la proteína soluble en el extracto. Fraccionamiento de las proteínas La resolución de las proteínas se realizó por cromatografía preparativa de Exclusión Molecular, en una columna de 1O cm de

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Extracción y precipitación de las proteínas de la Lemna obscura

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longitud por 1 cm de diámetro. Se usó como soporte Sephadex G-100 de tamaño de partícula 20-50 m y como eluyente una solución amortiguadora de fosfato pH 7,0. El volumen de exclusión molecular se estimó con una solución de Blue Dextran. A cada fracción eluida se le monitoreó la absorbancia a 280 nm en un Espectrofotómetro UV-Visible. Posteriormente se graficó absorbancia vs el número de fracciones eón la finalidad de determinar los grupos de proteínas presentes. Para la determinación de la masa molar aparente de las proteínas (o polipéptidos en el caso de las proteínas con estructura cuaternaria) se utilizó un equipo de electroforesis (mini-cámara EC 120 Mini Vertical Gel System) con un soporte discontinuo de gel de poliacrilamida. La resolución de las muestras se efectuó en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS). Se utilizaron marcadores de pesos moleculares (Sigma 123H9458, ST. Louis. USA). Se utilizó una fuente de poder marca SHANDON, modelo Vokan 400. Se siguió el método propuesto por Laemmli (10). Se utilizaron varias proteínas para la estandarización. Además de la precipitación termoácida (calentamiento en el pi) se realizó una precipitación por salado (salting out) agregando una solución saturada de sulfato de amonio. Seguidamente se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min a4°C. Luego se dializó con una membrana de poro de 3500 Da contra agua destilada por 24 horas y se determinó la caneentración de proteínas por el método de Lowrv. La comparación de los resultados entre la precipitación termoácida (pi) y por salado informa sobre la eficiencia de la precipitación. ya que por salado precipitan prácticamente todas las proteínas presentes en el sobrenadante. Se realizaron varias experiencias de extracción y precipitación de proteínas en condiciones óptimas. Los concentrados se prepararon por liofilización. A todos se les determinó proteína cruda por micro~ Kjeldahl.

Resultados y Discusión El contenido de humedad inicial de la muestra fue de 93%. Una vez sometida a secado , el contenido de humedad bajó a 5,30%. Los contenidos de proteína cruda, celulosa, hemicelulosa y lignina en base seca (b.s.) fueron 15; 17; 18,4; y 2,4%, respectivamente. Se ha encontrado que el contenido proteico de la Lemna sp. en el lago es muy variable, dependiendo de la zona y del tiempo de recolección (edad de la planta), encontrándose desde valores altos, 31 o/o, hasta muy bajos, 6% (J. E. Rincón, comunicación personal). El valor de 15% de proteínas obtenido e~ este trabajo, está alrededor del valor promedio observado en muestras de diferentes sitios en el lago. Por lo tanto, el reporte de contenido proteicos hasta 45% ( 11) puede ser una quimera en las condiciones del Lago de Maracaibo. Lo que ha sido una constante es un contenido elevado de fibra en todos los casos. El contenido global de celulosa. hemicelulosa y lignina, alcanzó un valor de 37,8% en base seca, que es un valor muy alto, nada comparable con el contenido de fibra de la Lemna que se cultiva en estanques y se recoge cada dos días (5,7-16,2%) (11). El contenido de fibras está muy por encima del recomendado para dietas de aves (<4%) (12) y de cerdos (10- 15%) (13). Extraer la proteína y presentarla en un concentrado con un nivel bajo de fibra se hace imperativo, si se quiere utilizar la Lemna del Lago de Maracaibo en grandes proporciones en la alimentación de animales de estómago simple. En ensayos preliminares se seleccionaron el tiempo de extracción y la relación sólido/líquido de la solución extractante. En la Tabla 1 se observa que los rendimientos de extracción máximos se obtuvieron a 45 y 60 minutos. Aunque el rendimiento a 60 minutos fue más alto, no tuvo diferencias significativas (p>0,05) con respecto al obtenido a 45 minutos, por lo que se tomó este último para el resto de las pruebas.

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Tabla 1 Efecto del tiempo sobre el rendimiento de extracción de las proteínas de la Lemna sp. a 30°C, pH 10 y relación S/L 1:15. Tiempo (min)

Rendimiento de extracción (%)

5

31,34 a

10

32,72 a

20

34,73 b

30

34,78 b

45

36,60 be

60 38 e Letras distintas corresponden a valores con diferencias significativas (p
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tracción esté más cercano a la neutralidad el proceso tendrá menor costo. El efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extracción de las proteínas de la Lemna obscura se muestra en la Figura 2. Se observa en dicha figura que al aumentar la temperatura de extracción de 30 a 45°C, el rendimiento de extracción de las proteínas aumenta de 32 a 40%, valor que se mantiene casi invariable a 60 y 75°C (p>0,05), por lo que se seleccionó 45°C como la temperatura óptima de extracción. La Tabla 2 muestra el rendimiento de extracción de proteínas al variar el pH de la solución extractante a 45°C, relación sólido /líquido 1: 15 y tiempo de 45 min. Se observa que un aumento en el pH por encima del pH del agua destilada con hidróxido de calcio no ejerce influencia en el rendimiento de extracción. Este comportamiento es diferente al de otras fuentes de proteínas como gramíneas y leguminosas (7). La Figura 3 presenta los resultados de la determinación del punto isoélectrico de las proteínas, mostrando una típica curva de pi entre pH 2 ,5 y 6,5. con un máximo a 3 ,5 , que representaría el punto isoeléctrico. Es decir, por encima y por debajo del pi las proteínas tienen mayor solubilidad. El precipitado a pH 3 también es rico en proteínas. Es importante destacar que también se observaron precipitados abundantes a pH 2 y a pH 2,5. Sin embargo, en estos casos precipitó una cantidad apreciable de hemicelulosa y lignina, lo que le resta calidad al precipitado proteico. Lo único que puede explicar que la cantidad de proteína a pH 2 sea mayor que a pH 2,5 (y cercana a la obtenida a pH 3,5) es que la precipitación extra de lignina y hemicelulosa por el p H más ácido arrastre compuestos nitrogen ados. En base a los resultados obtenidos. se tomaron los valores de pH 3 y 3.5 para realizar la precipitación de las proteínas con calor. Un valor de pi igual a 3,5 es más bajo que el de las proteínas de las hojas de gramíneas y leguminosas, que está alrededor de 4 ,8 (14). Los

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336 40 35 ~ 30

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Ql a:: 10

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10

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12

pH

mSiL 1:10 oS/L 1:15

Figura l.

Rendimiento de extracción de las proteínas de la Lemna obscura a 30°C a diferentes pH y relación sólido / líquido por un tiempo de 45 min. ;JU

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Ql

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45 40 35 30 25 20 15 10 5

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30

60

75

Temperatura (°C)

Figura 2.

Efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extracción de las proteínas de la Lemna obscura a pH 10, relación sólido / líquido 1:15 (solución de hidróxido de calcio) y tiempo de 45 min.

valores relativamente bajos del punto isoélectrico explican la precipitación a un pH de 5,56 d el agua destilada. Dicho pH está suficientemente alejado del punto isoélectrico de las proteínas como para garantizar que los grupos carboxilos de los aminoácidos se encuentren como carboxilatos, de modo que exista repulsión de cargas negativas entre las proteínas, facilitando su movilidad y por lo tanto, su extracción. Por otro lado, el utilizar solo agua destilada representa un aho rro de reactivos. Por lo tanto, las proteínas de la Lemna obscura son extraíbles con agua destilada a 45°C , 45 min y relación sólido /líquido 1:15, alcanzándose un rendimiento

máximo del 40%. Este resultado coincide con la extracción de nitrógeno de Lemna sp. en un tiempo de 90 min (15). Es evidente que una gran parte de la proteína de la Lemna se encuentra asociada químicamente a la pared celular o a organelos, ya que la extracción solo llegó a 40%. Para eliminar las barreras fisicoquímicas que impiden la extracción de las proteínas de la Lemna, ésta tendría que someterse a pretratamientos fisico-químicos que disminuyan la cristalinidad de la celulosa, solubilicen parcialmente a la lignina y a la hemicelulosa, y desacetilen a la hemicelulosa, en el

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Tabla 2 Rendimiento de extracción de proteínas a diferentes valores de pH de la solución extractante. Temperatura= 45°C, relación sólido/líquido= 1:15 y tiempo= 45 min. Concentración de proteína soluble

pH

Rendimiento de extracción (%)

--------------------------~~/mU 5,56

3217,8

40,2 ± 2,4

7

3247,4

40,3 ± 1,8

10

3181,4

39,8 ± 2,9

35 30 ~ 25

o

"E., 20

·e r::: ., 0:: "t:l

15 10 5

o 2

2,5

3

3.5

4 ,5

4

5

5,5

6

6,5

pH

Figura 3. Rendimiento de precipitación de las proteínas de la Lemna obscura a diferentes valores de pH para la determinación del punto isoeléctrico. caso de que exista este tipo de grupos en la hemicelulosa de la lemna. La Figura 4 muestra la influencia de la temperatura sobre el rendimiento de precipitación de proteínas de la Lemna obscura a pH·s cercanos al punto isoeléctrico . Los experimentos se realizaron a pH 3 y 3.5. Se observa que la temperatura entre 50 y 80°C no tuvo un efecto significativo (p>0,05) debido a que el rendimiento para cualquiera de los valores de pH se mantuvo casi invariable en el rango de temperatura estudiado. No obstante, se observa un aumento al comparar los resultados con el rendimiento obtenido en la prueba de la determinación d el pi la cual se realizó a temperatura ambiente (25°C) y que se incluyó en la figura. Dicho aumento se atribuye a desnaturalización de las proteínas por el calor aplicado . La precipitación a pH 3,5 fue superior en un 13.5% a

la obtenida a pH 3, lo cual concuerda con lo observado en la prueba de la determinación del pi. De acuerdo a los resultados obtenidos, las proteínas de la Lemna obscura son precipitables a pH ácido (pH=3,5) y temperatura de 50°C , aJcanzándose un valor máximo de rendimiento de 42%. Al tomar en cuenta de manera conjunta la extracción y la precipitación de las proteínas de la Lemna., se obtiene una recuperación total d e proteína verdadera de 16,8%. Este valor se considera elevado comparado con la recuperación de proteínas de follajes de leguminosas y gramíneas sometidas a extracción en condiciones más drá sticas de pH y temperatura (7, 16, 17). El concentrado proteico obtenido presentó una concentración de proteína cruda de 36%. Es importante resaltar que este contenido corresponde a proteína verdadera, ya que el método de

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338 45 40 o~

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li:llpH 3 opH 3,5

Gl

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30

Gl

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25 20 25

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50

80

0

Temperatura ( C)

Figura 4.

Rendimiento de precipitación de las proteínas de la Lemna obscura a diferentes temperaturas y pH.

análisis utilizado mide polipéptidos con masa molar superior a 3500 Da. Es posible optimizar la selectividad del método de precipitación para elevar la concentración de proteínas hasta 46-48%, valor típico de la harina de soya. Se conoce muy poco de las proteínas de la Lemna sp. El estudio de las mismas requiere el uso de técnicas clásicas de fraccionamiento molecular tales como la cromatografia preparativa de exclusión molecular e intercambio iónico y electroforesis en gel de poliacrilamida, ambas basadas en la resolución de mezclas complejas de polipéptidos, en función del tamaño y cargas de las proteínas. La Figura 5 muestra varias fracciones de masas molares distintas obtenidas de proteínas prec ipitadas con calentamiento en el punt o isoeléctrico, aunque sobresale una fracción d e elevada masa molar. Cuando los extractos se precipitaron con el método del salado (Figura 6), se observa un gran pico (proteína en abundancia) de elevada masa molar que coincide aproximadamente c on el gran pico mostrado en la Figura 5. El resto de las proteínas está en baja concentración y son de menor masa molar. Si se observa el valor de la absorbancia de ambos picos se concluye que hay mucha mayor precipitación en el método del salado, lo cual se esperaba. No se muestra evidencia

de que la precipitación en el método termoácido haya sido selectiva, sino que fue de menor eficiencia. En la precipitación termoácida (Figura 5) puede ocurrir que las proteínas de alto peso molecular se hidrolicen parcialmente o que ocurra un desdoblamiento de proteínas con estructura cuaternaria, típica de enzimas, disminuyendo la masa molar de las proteínas fraccionadas. Si ésto ocurre, aumentarla la susceptibilidad de dichas proteínas a la hidrólisis enzimática, y por lo tanto aumentarla su digestibilidad. El método termoácido es fácil de industrializar mientras que la precipitación con sal es más que todo de carácter analítico. En general se puede decir que no se observa gran diversidad en las fracciones proteicas de la Lemna obscura. Cuando se extraen proteínas de follaje de plantas superiores como gramíneas, leguminosas y tubérculos se observa un gran número de fracciones. La Figura 7 muestra el perfil electroforético de patrones moleculares SIGMA y proteínas de Lerrma sp. La elución electroforética de las proteínas de la Lemna precipitadas por calentamiento en el pi mostró dos bandas definidas cercanas de masas molares aproximadamente de 66 y 70 KD correspondientes al primer pico eluído por cromatografia de exclusión molecular (Figura 5). La aparición de

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15

10

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Número de Fracciones

Figura 5. Fraccionamiento por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-100 de las proteínas de la Lemna obscura precipitadas con calentamiento en el punto isoeléctrico. 0,16 - -- - -- - - - - - - - - -- . 0 ,14-

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Número de fracciones

Figura 6.

Fraccionamiento por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-100 de las proteínas de la Lemna obscura precipitadas con el método del salado.

bandas irregulares no definidas de fragmentos pequeños (posiblemente hidrolizadas) en el orden de los 14 y 15 KD corresponde al resto de las proteínas eluídas por exclusión molecular, lo cual es coherente con el cromatograma mostrado en la Figura 5. La masa molar de las proteínas más abundantes está en el orden de la masa molar de la enzima Rubisco, responsable de la fotosíntesis, y la que suele estar en mayor proporción en las plantas verdes (alrededor de un 50%). De acuerdo a los resultados de esta investigación, estas bandas represen-

tan la fracción predominante de las proteínas de la Lemna.

Conclusión De este trabajo se concluye que es posible obtener concentrados de alto tenor proteico de la Lemna obscura, los cuales tienen un gran potencial para la alimentación de animales de estómago simple.

Agradecimiento Al ICLAM, por financiar el proyecto. Al Dr. José Elí Rincón , del Laboratorio de Contaminación Acuática de la Facultad Experi-

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Pm

dures , and sorne applications) . Agríe Handbook No. 379. ARS-USA, Washington, D.C. (USA) , pp. 8, 1970.

M

--

Albúmina (66 KD)

f3 - Caseína (24 Km

k-Caseína (19 KD)

a -Lactoalbúmina (14 KD)

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....·- - 2

Figura 7. Perfil electroforético de las proteínas. Pozo 1: patrones SIGMA. Pozo 2: proteínas de Lemna obscura.

mental de Ciencias de la Universidad del Zulia, por su gran contribución en la selección y recolección de las muestras.

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