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Factores de Crecimiento y Señalización de proteínas en el Desarrollo Craneofacial Robert Spears y Kathy K.H. Svoboda

La regulación del crecimiento y desarrollo son controlados por las interacciones de las células entre sí y el medio ambiente extracelular a través de las señales de transducción de los caminos que controlan el proceso de diferenciación mediante la estimulación de la proliferación o causando la muerte celular. Esta opinión definirá las moléculas de señalización comunes y provee una visión de los principios generales de los eventos de transducción de señales. También se revisa las vías de las señales de transducción controlando un mecanismo específico encontrado en desarrollos craneofaciales denominado Transformación Epitelial – Mesenquilales (EMT) empleado durante la gastrulación, migración cranial de la cresta neural, y la formación paladar secundaria. Semin Orthod 11:184 –198 © 2005 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados

Factores de Crecimiento y Transducción de Señales La señalización intracelular es usualmente desencadenada por un evento de la superficie celular tal como una proteína específica (ligando) que se une a un receptor de superficie celular para formar una interacción receptor – ligando. Dichas células contiene células vecinas y los tejidos circundantes no celulares son denominados Contactos de Matriz Célula - Célula ó Matriz Extracelular (ECM) (Fig 1A).1 Las interacciones de las células con otras células o la ECM pueden estimular muchas reacciones, incluyendo: incremento de la división celular, movimiento celular, diferenciación e incluso muerte celular programada (apoptosis). Las proteínas de la union superficial celular (repectores) son clasificadas por la estructura de la proteína y características del ligando. Estas proteínas son usualmente localizadas en la superficie celular en la membrana plástica. Parte de esta proteína puede estar situado fuera de la célula para interactuar con el ligando. Esta parte de las proteínas es llamado el dominio de union al ligando extracelular. Parte de la proteína atravesará a través de la membrana, denominado el dominio que abarca la membrane, y la porción de la proteína estará dentro de la célula y se denomina dominio citoplásmico. La mayor parte de la lista de libros de biología celular moderna muestra al menos cuatro tipo de receptores de superficie celular, incluyendo los receptores acoplados a Department of Biomedical Sciences, Baylor College of Dentistry, Texas A&M Health Science Center, Dallas, TX. This work was supported by grant sponsors: Baylor Oral Health Foundation; Tobacco Endowment Fund, Texas A&M University System; Grant Number: 304-202850-4013. Address correspondence to Robert Spears, PhD, Texas A&M University System, Baylor College of Dentistry, Department of Biomedical Sciences, 3302 Gaston Ave, Dallas, TX 75266; Phone: 214-828-8297; Fax: 214828-8951. E-mail: [email protected]

proteínas G (GPCR, Fig 1A), receptores de canales iónicos, receptores enlazados de Tirosina – Quinasa, y los receptores con actividad intrínseca enzimática.2 Los CPCRs son caracterizados por dominios multiples transmembrana (usualmente siete) que enrolla a la proteína dentro y fuera de la membrana en la conformación serpentina (Fig 1A, GPCR). Los receptores de canales iónicos son relacionados estrechamente y actualmente abiertos a un canal de membrana cuando se une el ligando. Muchos receptores de citoquinas están en la clase enlazada Tirosina – Quinasa ya que carecen de actividad intrínseca; pero cuando el ligando se une, la Tirosina – Quinasa intracelulares son activadas para generar cambios celulares. Los receptores del factor clásico del crecimiento tienen actividad de Quinasa dentro de la proteína (intrínseca) y por lo tanto forma la cuarta clase de receptores – el repector Tirosina – Quinasa, o receptor de Quinasas Serina / Treonina (Fig 1A y C). Estos receptores usualmente tiene un dominio transmembrana, y al menos dos moléculas que deben convertirse estrechándose asociadamente (combinación) para activar la señal. Además de estas clases clásicas de receptores, las células pueden responder a su entorno ECM a través de receptores de integrina o receptores proteoglicanos tales como la familia sindecano (Fig 1A y B). Los dominios de transmembrana individuales con largos extracelulares y dominios citoplásmicos mucho más pequeños caracterizan estos receptores. Las moléculas de sindecan tienen largas cadenas glicosaminoglicanos que asisten en la apoderación de los factores del crecimiento de fibroblastos cercanos a la membrana celular.3-6 Los receptores de integrina son heterodímeros compuestos por subunidades. La familia es muy grande con al menos 25 integrina heterodímeros, incluyendo 19 subunidades y 8 subunidades idenficadas. 7 Las integrinas no tienen actividades de Quinasas, pero en la unión en moléculas ECM, algunas proteínas asociadas se activan por autofosforilación y luego fosforilan (activan)

184 1073-8746/05/$-see front matter © 2005 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1053/j.sodo.2005.07.003

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Figura 1 (A) Muchos tipos de receptores están las células que contribuyen a las mismas vías de señales. En esta ilustración, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR), receptor tirosina quinaza, las moléculas de adhesión celular (CAMs), selectinas, integrinas, sindecán, y cadherinas son representadas con algunas de las señales de moléculas intracelulares que han sido identificadas. Todas las moléculas receptoras tienen tres características estructurales en común: unión en dominio ligando extracelular, dominio transmembrana, y un dominio intracelulares citoplásmicos. (B) Las moléculas de integrina (cuadrado inferior) son alargados para demostrar que las interacciones del dominio citoplásmico con otras proteínas (FAK, paxilina, Src y ILK). Estas proteínas se convierten en fosforiladas cuando las integrinas se unen a ligandos (ECM) y se agrupan para formar adhesiones focales. (C) Receptores TGF están en los receptores de tirosina quinasa (cuadrado superior) y la señal de activación a través de varias vías incluído el Smad y las vías de quinasa – PI3, para estimular la EMT (como se explica en el texto).

que rodea proteínas para generar señales para las actividades celulares específicas que usualmente cambian el citoesqueleto de actina. Una de las primeras proteínas para convertirse fosforilada es la Quinaza de Adhesión Focal (FAK) (Fig 1B). Otro concepto en la reciente literatura es que las diferentes señales moleculares pueden ser retiradas en microdominios 8,9 de las membranas denominadas series lipídicas que pueden facilitar la transferencia entre diferentes receptores y 1,10-16 vías de señalización.

Proteínas de Intracelular

Señalización

Un principio básico de transducción de señales es que existen problemas en al menos en dos estados: activado e inactivado. En este momento sabemos de varios métodos para convertir las señales de encendido y apagado, incluyendo fosforilación, desfosforilación, localización intracelular, ciclos nucleótidos (ADP / ADP o GDP / GTP), y niveles de calcio / iones (ver glosario; tabla 2).

186 Cascada de GPCR. Uno de los primeras señales de los mecanismos de transducción descritas ha sido la cascada CPCR que genera el ciclo clásico de segundos mensajeros AMP (cAMP), GMP cíclico (cGMP), diacilglicerol (DAG), Fosfato Inositol (Ca2). Cuando los receptores de la proteína ligada u hormona llegan a ser activados, se desencadenan una serie de eventos en la superficie celular que causan un incremento transitorio en las moléculas del segundo mensajero.2 Como en otros eventos de señalización, hay un incremento transitorio en la forma activa de la molécula acompañado por una rápida disminución para producir una “señal”. En pocas palabras, cuando el ligando se une al receptor causa un cambio en la estructura de la proteína que permite la sub-unidad de la proteína G de unirse al dominio citoplásmico del receptor (Fig 1A, GPCR). Esta interacción causa el intercambio de GDP para la sub-unidad GTP y la disociación de las sub-unidades desde la sub-unidad. La subunidad activada (GTP ligado) interactúa con la Adenilil Ciclasa, la enzima unida a la membrana responsable de la producción de cAMP. Después de la activación del Adenilil Ciclasa, la subunidad revierte al estado GDP y se reúne con las subunidades. No solo es el número muy grande de CPCRs, pero las subunidades son también numerosos, proporcionando una amplia variedad de señales a la célula. Una vez que las proteínas G son activadas, la señal puede ser amplificada por las interacciones con otras proteínas. Clásicamente, la Adenilil Ciclasa produce cAMP que activa otras quinazas que derivan el ciclo de quinazas AMP dependientes (cAPKs), también llamados proteína quinaza A (PKA). Estas quinazas puede fosforilar (activar) un número de substratos, dependiendo del estímulo específico para amplificar la señal desde la superficie celular.2 Uno de los efectos de la activación de la liberación de calcio desde las áreas de almacenamiento intracelulares, tales como el retículo endoplásmico rugoso y las mitocondrias. Desde los niveles libres de calcio en las células son mantenidos a muy bajos niveles, el rápido incremento en los niveles de calcio desde estos organelos intracelulares ha sido una manera de visualizar los eventos de las señales. El calcio puede ser etiquetado, ya sea con colorantes de radiométrica cuantitativos o colorantes de longitud de onda individuales para monitorear estos cambios rápidos en células siguiendo 17 la estimulación. El secuestro rápido de los libres iones de calcio por moléculas tales como calmodulina que se unen muchos iones de calcio se desconecta la señal de calcio. Fosforilación y Desfosforilación. La fosforilación y desfosforilación provee otro mecanismo para las señales de encendido y apagado. Las enzimas que fosforilan otras proteínas son llamadas quinazas. Los aminoácidos comunes que se convierten en fosforiladas son tirosina, teorina y serina. Como se dijo anteriormente, las proteínas fosforiladas pueden ser activados adicionando moléculas de fosfato, y se desactivan removiendo el fosfato, una función usualmente hecha por otra clase de enzima, la fosfatasa. Algunas proteínas pueden auto fosforilarse; una vez activado, pueden fosforilar sustratos a su alrededor. Un ejemplo de este tipo de proteína se discutió previamente describiendo Las moléculas de integrina; quinaza de

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adhesión focal (FAK) se convierte en fosforilada cuando las integrinas se unen a su ligando, ECM (es decir, colágeno, fibronectina, o laminina). Una vez que el FAK se convierte en fosforilada, éste va a activarse o fosforilación paxillin, 18 una actina proteína asociada, y otra quinaza, Src (Fig 1B). Src puede también iniciar activando las proteínas que rodean, Para complicar las cosas, algunas proteínas son inactivas en el estado fosforilado y se activan después de la desfosforilación. Por lo tanto, es importante entender los posibles cambios en las proteínas antes de iniciar una investigación. Las células pueden contener un aumento constante de una proteína dada en una fuente, pero la proteína tiene que estar en un estado activo para producir 19 una señal que va a cambiar las proteínas alrededor de ella. Es importante recordar que sólo porque un mRNA para una proteína dada es expresado; esto no indica que la proteína fue producida o que haya sido activada. Unión de Nucleótidos. La proteína está generalmente en un estado inactivo si el nucleótido ADP o GDP se unen y son activados cuando el ATP o GTP se unen. Un ejemplo de este tipo de activación es la pequeña familia de proteínas G, Ras y Rho. Estas proteínas se alternan entre la unión activa GTP desde (encendido) y la unión de forma inactiva GDP (apagado) para regular otras quinazas que fluyen con la corriente. Muchas otras proteínas regulan el estado “encendido” y “apagado” de las pequeñas proteínas G. Los factores de intercambio de guanina – nucleótido (GEFs) son la señal de “encendido”, ya que se añade GTP a la proteína. La activación de proteínas GTP (GAPs) son la señal de “apagado”, ya que se eliminan un fosfato para desactivar la proteína. La disociación del inhibidor de proteínas Guanina – Nucleótido (GDIs), apoderándose las proteínas inactivas en la fuente de citoplasma. Se ha demostrado que una de estas proteínas reguladoras (p190RhoGAP; proteína 190 kDA que funciona como GAP para Rho) se fosforila muy rápidamente en el epitelio embrionario muy rápidamente en 19 respuesta a las células de unión ECM. También se demostró la disminución los niveles de proteínas de Rho o la disminución de actividad de otras señalizaciones de 24 moléculas de integrina. Locación Intracelular. Algunas proteínas se mueven a las estructuras intracelulares específicos, tales como las adhesiones focales 1, 25 cuando son activados. Paxilina, Actinina y Talin se acumulan en las adhesiones focales tanto en células migratorias como en estacionarias. Además, las moléculas de integrina llegan a estar agrupadas en la adhesión focal de las células de fibroblastos (Fig 1A) y nuevas evidencias indican que estas proteínas pueden actuar como sensores para las 14 fuerzas mecánicas. Muchas proteínas se mueven a la membrana plasmática cuando se activan . El movimiento a la membrana plasmática pueden tener muchas medidas, incluyendo la liberación de una proteína chaperona citoplásmica y/o la adquisición de una cola lipídica. Las pequeñas proteínas G (tales como el Rho) requiere tanto la liberación del inhibidor de la disociación de la proteína guanina-nucleótido (GDI) y una matiz de lípidos

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para mover la membrana. Además de tener el GTP unido a la proteína, ésta en sí se mueve al sitio en acción. Muchos de las pequeñas proteínas GTPase (Ras, Raf, Rac) siguen patrones de translocación intracelulares similares en la activación. Otras proteínas activadas mueven al núcleo y pueden actuar como factores de transcripción. Ejemplos de este tipo de translocación intracelular son algunos de las proteínas de 28-30 quinaza MAP. Las quinazas MAP pueden responder a una variedad de señales extracelulares, incluyendo estrés osmótico, choque térmico, citoquinas y los mitógenos.31 Dos de las quinazas MAP, las quinazas reguladas por señales extracelulares (ekr-1 y ekr-2; también referidos como erk-1/2), traslada al núcleo después de la activación para regular la expresión de varios factores de transcripción 30, 31 (Tabla 1). La activación de las vías de quinaza de MAP ha sido identificado como un mecanismo usado por integrinas para regular la expresión de genes que conduce a cambios en la forma celular durante la propagación o 10,21,32,33 migración de células, y como un camino de 1, 10, 34 diafonía entre integrinas y los factores de crecimiento A veces, la señal de la proteína necesita unirse a otra proteína, una chaperona, antes de la translocación al núcleo. Las proteínas de transformación de crecimiento factor beta (TGF-) activa una clase de proteínas llamados Smads. Estos factores de crecimiento se unen a los receptores de superficie de células (T RI y T RII) y activa las proteínas específicas Smad (Smad 2 o 3) que luego se unen a una proteína chaperona, Smad 4, antes de la translocación al núcleo (Fig 1C), para actuar como factores de 35-38 transcripción. Similarmente, las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) se unen a los receptores BMP, activándose los Smads 1 al 5, donde se une el Smad 4 para moverse al núcleo. Para mayores detalles acerca de esta vía se discutirán más adelante en esta revisión (regulación EMT).

Resumen Las respuestas intracelulares a los receptores de superficie celular son complicados y es tema de muchas investigaciones activas. Un número de estudios han establecido un vínculo recíproco entre las integrinas ECM, la señalización del factor de crecimiento, adhesión de moléculas célula – célula, dominios de membrana especializados (grupo de lípidos), y receptores de proteína vinculado G. 1 Además, se estableció la diafonía entre el ECM y la vía estimulada de los mitógenos intracelulares.; las pequeñas proteínas G y el fosfoinositol. 39, 40 El micro medioambiente y los tejidos resultantes de las células influyen profundamente sus vínculos. Por lo tanto, para lograr un fenotipo diferenciado de las células o para responder a los cambios micro medioambientales, las moléculas ECM y sus receptores deben integrarse tanto en sus formas como en sus funciones. En contraste, los genes mutados y las interacciones aberrantes con el micro medioambiente pueden degradar esta integración, posiblemente resultando en una transformación maligna o un desarrollo abnormal. 41 Recientemente, también se ha

convertido aparentemente que las integrinas regulares Rho GTPases y viceversa. Las integrinas y GTPases podrían, por lo tanto, estar organizados en una señal en cascada compleja que regula el comportamiento celular. 1, 10, 21 En la próxima sección de esta revisión, la importancia acerca de las vías de señal para el desarrollo craneofacial van a ser discutidas más adelante.

Factores Importantes de Crecimiento en las Interacciones Epiteliales Mesenquimales

/

La transformación del fenotipo celular, desde epiteliales hasta mesenquimales (transformación epitelial / mesenquimal, EMT) y viceversa, ha sido bien documentada en el desarrollo embrionario, tanto en la curacíon de heridas y en metatarsis en tumores. La Epitelial sirve como límite entre el medio ambiente externo y el resto de los órganos mientras que las células mesenquimales son encontradas en el compartimiento del tejido conectado. La función de la barrera epitelial es parcialente soportada por uniones firmes de célula – célula, tales como uniones ajustadas y desmosonas. En adición, las células epiteliales normalmente tiene polaridad apical y basal y añade hemidesmosomas a la lámina basal. Las células mesenquimales son tambíén movibles y rodeados por la matriz extracelular. Ellos tiene polaridad antero – posterior, y forma solo de contactos transitorios con sus células vecinas. Durante la transición del fenotipo de la célula EMT, la célula epitelial pierde adhesión célula – célula, rompiéndose a través de que la lámina basal se convierte en movible, y las proteínas mesenquinales expreso (Fig 2B). Desde los mediados de los 90’s y más recientemente, muchas revisiones fueron publicadas en EMT tanto en 42-48 desarrollo y en patogenesia. EMT y su oposición, la transformación mesenquimal – epithelia, ocurren durante el desarrollo normal del proceso. EMT ocurre durante la gastrulación, uno de los primeros eventos de desarrollo que cambia dos capas del disco embrionario, en tres capas del embrión. Este proceso involucra la imaginación en la capa superior de células (epiblasto) para formar tanto las capas de 50,51 mesodermo y capas germinales. En adición, varios 52 procesos de otro desarrollo tales como la esclerotoma y el 53-55 desarrollo de la mesénquima del cojín cardíaco requiere EMT. En contraste, la transformación mesenquimal – epitelial ocurren en la formación de somitas, riñones y el 56 caudal o secundario tubo neural. Esta revisión va a concentrarse en el EMT durante el desarrollo de la estructura craneofacial, específicamente en la cresta cráneo neural (CNC) y la formación del paladar secundario.

Cresta Cráneo Neural Antes del cierre de los pliegues neurales en la cabeza del mamífero, las células de la cresta neural se separan desde la capa epitelial embrionario del tubo neural dorsal cambiando su forma y propiedades desde las células neuroepitelial a células mesenquimal. En una reciente reunión celebrando las contribuciones de James A. Weston para el entendimiento de la cresta neural, Weston propuso que el CNC son derivados

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Table 1 Factores de transcripcion Cbfa 1 Dax 1 Dlx E12 Egr-1 Emx-2 En-1 -2 Eya-1-2 GATA-4 Gbx2 Gli-1-3 Goosecoid HNF-3 HNF-3 Hox a-d Id Krox-20 Lbx-1 Lef-1 Lbx-3-4 Lim-1 Lmx-1

MEF-2 MFH-1 Msx-1 MyoD Nkx2-5 Oct-3-4 Otx-1-2 Paraxis Pax-1-9

Pdx-1 Pit-1 Pitx-1 Rpx SF-1 SIP-1

Factor de union al nucleo a1, control de la diferenciacion de las celulas mesenquimales dentro los osteoblastos Hormona receptor nuclear de la familia expresada en diferentes tiempos gonadales Genes distales de modelos pareados (6 miembros) que estrechamente relacionados con los genes Hox y estan implicados en la morfogenesis de la mandibular y el oido interno Activador de transpcripcion para MyoD Crecimiento temprano respuesta-1, que se encuentra en el estadio brote mesenquimal del diente G e n e s Homeobox es necesario para la formacion del cuerpo calloso Engrailed-1 and -2, con Pax-1 and -2 son criticos para organizacion del desarrollo del mesencefalo y el cerebelo en ambos lados del organizador itsmico. Ojos ausentes-1, -2—expresados en la placode del cristalino, requiren Pax-6 para la expresion Es importante en el desarrollo temprano del corazon Gastrulacion cerebro homeobox 2—expresada en el cerebro posterior para formar la frontera medio del cerebro posterior , necesario para formacion de rombomeres 1 y 3 Zinc factores de regulacion de morfogenesis del dedo; S e l i b e r a Gli-1 a partir de los microtubulos complejos abajo del shh, whereas Gli-3 es anterior y suprime shh Homeodomain proteinica expresada en la region primitivo del nodo; activada el chordin, noggin y otros genes en la region organizadora Factor nuclear Hepatico 3—expresado tempranamente en el intestine GATA-4 Factor nuclear Hepatico 3 —expresado en la region organizadora temprana con goosecoid y chordin Homeobox—contienen a-d— pertenece a los genes que se encuentran en el grupo de los cuatro cromosomas— necesario en la segmentacion craneocaudal del cuerpo Inhibidor del nucleo de union del ADN que puede formar un heterodimero con MyoD y bloquear de dimerizacion del MyoD Gen de segmentacion q u e g u i a l a formacion de rombomeros 3 y 5, kreisler y Hoxa-1 estan envueltos en la formacion d e rombomeros 5 Lim-tipo homeobox contienen genes Potenciador linfoide del factor 1, que envuelve a la via Wnt-catenin durante la transformacion- epitelio mesenquimal Expresado in Rathke’s primordium con Rpx de la forma Rathke’s bolsa Homeobox contiene el factor de transcripcion necesario para el desarrollo de la cabeza Se encuentra en la extremidad del brote del mesodermo—responde a la rama de la molecula de senalizacion del ectodermo, Wnt- 7a para inducir las caracteristicas dorsales; produce el ectodermo ventral En-1 para suprimir Wnt-7a y Lmx-1 Potenciador del factor miocitos-2—importante en el dearrollo temprano del corazon El factor de transcripción forkhead-1-winged hélice-deficiencia del mesénquima en ratones conduce a la interrupción del arco aórtico izquierdo Expresado en rápida proliferación del mesénquima en los tipos del primordio facial, brote de las extremidades, y la lámina dental, MSX-1 y -2 expresan en diente fase de brote mesénquimal Durante el desarrollo musculo miogenico regulado por los factores se expresan en secuencia (Myf-5,Pax-3, MyoD, miogenina MRF-4) Importancia del desarrollo temprano del corazon Genes Homeodominio de la familia POU; Oct-4 es importante en las etapas de escisión temprana y es en todos los blastómeros hasta el estadio mórula Orthodenticle homólogas-controles formación del prosencéfalo / cerebro medio, Otx-2 el cual caracteriza precursores del primer arco Helix-loop-helix factor transcipcion sometido mediante el epitelio mesenquimal de transformacion Paired box-1 to -9—contiene un par dominante y un par parcial homeobox; Genes Pax son importantes para órganos de los sentidos y el desarrollo del sistema nervioso; además de que están involucrados en los tejidos que utilizan la transición epitelio-mesenquimal en los procesos de desarrollo Pancreático duodenal homeobox-1 expresada en las células progenitoras pancreáticas con Hlxb-9 Pituitaria-1, miembro de la familia de genes POU expresa en la pituitaria Expresado en el desarrollo de las extremidades posteriores arriba del Tbx-4; Pitx-2 que se expresa en el temprano desarrollo de la membrana orofaríngea Bolsa Rathke homeobox que contienen genes de se expresados en la bolsa de Rathke primordio con Lbx-3 y Lbx-4, estimulada por BMP-4 y FGF-8 Se expresa el factor-1 Steroidogenico expresados en diferentes tiempos gónadales , el desarrollo de la corteza adrenal, pituitaria y el hipotálamo Proteínas Zinc del dedo que reconoce E-box motifs y encontró la transformación de células epiteliales mesénquimales (EMT) y reprime la E-cadherin

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Table 1 Continuacion Slug

Snail Sox

Sry Tbx-4-5

Twist Vax-2 Wt-1 ZFY

Proteínas zinc del dedo que se expresa en células epiblasticas durante la gastrulación y las células de la cresta neural en el estadio de desarrollo de la etapa de placa neural ; las células que expresan transformación del slug de los fenotipos del epitelio mesenquimal Proteínas dedo de zinc que reconoce E-box motificado y encontró en las células transformando del epitelio al mesénquima (EMT) y reprime la E-cadherin; estrechamente relacionado con el slug Familia larga (más de 20) que tienen un grupo comun de alta movilidad (HMG) de dominio que se une a 7 nucleótidos en el surco menor de la hélice del ADN; Proteínas Sox trabajan con otros factores de transcripción en una gran variedad de tejidos; Sox-9 controla la diferenciación de las células mesenquimales en precartilago Sex-región determinante, un miembro de la familia de genes Sox se encuentra en el cromosoma Y, desencadena el desarrollo testicular inhibiendo Dax-1 T-box familia, -5 expresado en la extremidad anterior; -4 Expresado en la extremidad posterior con Pitx-1, Tbx-5 expresada en la retina dorsal Proteína básica hélice-loop-hélice que es un regulador de la morfogénesis que juega un papel esencial en la EMT incluyendo el desarrollo mesodermo durante la gastrulación por la represión de la E-cadherin Ventral anterior homeobox-2—expresado en la retina ventral Tumor de Wilms de suprecion del Gen-1- expresados en los conductoos mesonéfricos regulado por la transformación del epitelio mesénquimal. Zinc dedos Y

*Compilación de varios incluyendo Carlson.138 57,

desde una temprana población de ectodermo no neuronal. 58 Mientras esta teoría controversial es averiguado para atraer muchos investigadores en los próximos años, esta revisión se concentrará en la teoría actual que el CNC ha derivado desde el epitelio neural. Sin embargo, tanto como el ectodermo y el neuroepitelio son tipos de células epiteliales, tienen que completar el EMT. Una publicación reciente del Desarrollo de la Dinámica dedica a este tema como un asunto subtitulado: “Especial atención a la Cresta 59 Neural y las Contribuciones de James A. Weston.” La mayor diferencia entre las células de cresta neural en la región craneofacial y aquellas en el baúl es que las células CNC son formados con instrucciones de nivel específico en la cabeza, mientras aquellas en el baúl no aparecen ser 60 programadas. En la región craneal, el CNC migra en corrientes difusas a través de la mesénquima craneal, con un nivel de instrucción específico, a alcanzar sus destinos finales. Estas células también son referidas como 61 ectomesénquima en algunos textos. Los extensos experimentos demostraron que el mantenimiento de esta parcial característica es muy importante en el desarrollo de los patrones en el rostro. :Las células CNC son como células multipotentes, que responden a señales expresadas espacialmente temporales y convirtiéndose en “comprometidas”. Los candidatos a reguladores incluyen factores de crecimiento – miembros de 65 la familia TGF factor de crecimiento fibroblastos (FGF)66,67, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)68, y productos gen Wnt69,70 (Tabla 2). El papel de la familia TGF-en los procesos de desarrollo CNC ha sido recientemente revisado.71 La implicación de varias moléculas de transducción de señales y factores de transcripción también han sido reportados.44 Los procesos maxilares pareadas y la prominecia mandibular del primer arco branquial dan lugar principalmente a las estructuras de los maxilares superior e inferior. El componente de la cresta neural de la mandíbula superior se deriva del cerebro anterior y el mesencéfalo, mientras que la de la mandíbula inferior desde el mesencéfalo y

rombencéfalo (rhombomeres 1 y 2). Estas células CNC contribuyen principalmente a las siguientes estructuras en el primer arco branquial: paladar y maxilar, la dermis y la grasa de la piel, papila dental, las células de Schwann de los nervios periféricos, los melanocitos, y parte del tejido conectivo. Un estudio reciente demostró que la eliminación condicional de la señalización de receptor gen transmembranal (T rII) en sólo el linaje craneal y la cresta neural resultó en la hendidura del defectos del paladar y atrofias secundarias. La patogénesis de paladar hendido en estos ratones parece estar relacionada con el deterioro de la célula de proliferacion.72 la formación normal de algunos derivados del primer arco branquial, tales como paladar y el labio, necesitan la transformación epitelial-mesenquimal durante remodelación embrionaria.

Regulacion del EMT Factores de crecimiento y las señales de transducción. La regulación de la EMT es críticada durante los procesos de desarrollo dinámicos y homeostasis postnatal. Hay (1989) postulo que el gen (s) maestro activado en epitelios por los cambios en el medio ambiente al iniciar el EMT (teoría del gen maestro) (Fig 2). Recientemente varias moléculas han sido identificados como posibles genes maestros INCLUYENDO factores Twist de transcripción, Snail o SIP1 (Tabla 1). Los cambios en el entorno que pueden iniciar EMT incluyen factores de crecimiento, moléculas de adhesión celular, matriz extracelular, y la superficie del receptores y baja señal transduccion de los eventos (Tabla 2), y factores de transcripción (Tabla 1). Las células epiteliales se caracterizan por adherencias célula-célula (adherencia unidas, desmosomas y hemi-desmosomas,) y un lámina basal intacta. Durante EMT las células pierden la expresión de las proteínas de adhesión celular, especialmente la Ecadherin y aumentan la expresión de las enzimas que rompen la lámina basal (Figura 2B). Esta revisión se centrará en el TGF y su señalización bajo las moléculas principalmente durante el desarrollo del paladar. El TGF-superfamilia incluye muchas pequeñas

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Figure 2 (A) Los estantes de las promiencias palatinas crecen como se ilustra en las etapas tempranas principales de fusión horizontal . La consecuencia de las crestas palatinas es estimulada por Fgf10 en el mesénquima que estimula la Fgfr2b en el epitelio y aumenta shh que señala de nuevo al mesenquima.64,72 Cuando los estantes palatinas se reúnen en la línea media, las células epiteliales de borde medial (MEE) desaparecen.42 Las células de la superficie de la epidermis progresan a través de la muerte celular programada (apoptosis), y algunas células basales migran al epitelio oral o nasal, pero otras células cambian y se vuelven fenotipos a mesenquimales a través de un programa regulado. (B) La teoría del gen maestro propone que un regulador hace que la regulación sea bajo los genes epiteliales, en particular E-cadherin, y la regulación positiva de los genes mesenquimales tales como la vimentin, fibronectin y N-cadherin. Las células también degradan la lámina basal que incluye colágeno de tipo IV y la lamina incrementando la matriz metaloproteinasas (MMP). (C) El cambio del fenotipo puede ser visualizado mediante el etiquetado de las células epiteliales con un marcador fluorescente (CCFSE) y luego el cultivo de las crestas palatinas durante 3 días. El marcador de marcado se visualiza en secciones ópticas con focal individuales en la región mesenquimal en los procesos palatinos que habían fusionado recientemente (C, flechas) .46

proteínas que son multifuncionales (control del crecimiento, migración y diferenciación) tanto durante el desarrollo embrionario y postnatal del tejido homeostatico.73-75 Las respuestas celulares al TGF durante el desarrollo craneofacial y regulación CNC han sido estudiado ampliamente y recientemente revisados.71 Los estudios diseñados para investigar cómo las células

interpretan señales TGF han identificado los tres tipos de receptores transmembranales de señalización TGF-: tipo I, tipo II (T y T RI RII), 76 y T RIII (figura 1C). Tipos receptores I y II TGF tienen un receptor citoplasmática serina / treonina. Quinasa dominate TGF-s iniciado la señalización mediante el ensamblado de los complejos de receptores. La inicial referencia de T RII al ligando es

Desarrollo Craneofacial reconocido por T RI y la formación de ligando / T RI / T RII / con resultados complejos en la activación de T RI por T RII.77 Activado T RI propaga la señal de muchos efectos fosforilados, tales como proteínas Smad (Fig 1C)78 Las proteínas Smad son homólogos a la Drosofila "madres contra dpp" (mad), las proteínas Caenorhabditis elegans Sma proteinas. En los vertebrados se han encontrado al menos nueve genes que comprenden la familia Smad.. Diferentes miembros de la familia Smad tienen diferentes funciones de señalización. Smads 1, 2, 3, y 5 e interactuar con los receptores y se denominan R-Smads. Estas proteínas se convierten en fosforilados que actúan en los los receptores de acciones activadas y se transportan a la nucleos.71,79-81 Sin embargo, cuando no hay señales de afuera hacia adentro, R-Smads permanecen en el citoplasma, en parte mediante la unión a la proteína SARA tempranas (Smad activación del receptor de anclaje) fosforilación .82 Receptor fosfato de RSmads debilita la afinidad del R-Smads por SARA y expone su señal importación nuclear. La activación de R-Smads también aumenta su afinidad con Smad4 (CoSmad ).83,84 Los resultados,el Smad de traslocacion completa dentro del nucleo,donde el Smads interactua con los factores de transcripción. El Smad señala el camino bajo control por muchos agentes reguladores incuyendo la proteína transmenbranal, BAMBI, que tiene un dominio intracelular que imita la estructura de un receptor de tipo I y previene la formación del recpetor complejo 85; la ubiquitin ligasa, Smurf 186; el antagónicos del Smad6 y Smad7,87,88 y las oncoproteínas de Eski / Sno.89 En adicion, en el núcleo celular responsable de otras entradas de señal que determinan qué genes serán reconocidos por el complejo Smad 90Recientemente, el factor regulador interferón del gen 6 (IRF6) fue identificado como el candidato a la causa de una forma de dominante autosómico del labio leporino y paladar hendido.91 Van der Woude sindrome,sin embargo, no está claro cómo la mutación puntual en este gen contribuye al labio leporino o paladar hendido. Aunque la vía Smad ha recibido mucha atención en los últimos 5 años, ahora se apreciará que el TGF - complejo receptor activado también puede indicar a través de otras vías, 92 tales como los que implican las proteínas quinasas activadas por proteínas quinasa (MAPKs), 93,94 fosfoinositol3 quinasa (PI-3-quinasa) (figura 1C), 95,96 y PP2A / p70S6K, aunque los detalles moleculares de este acoplamiento son todavía oscuros. La importancia relativa y la interacción de estas diversas vías en las respuestas cambiantes de las células a TGF están comenzando a ser sondeado. Miembros de la familia TGF son esenciales para la EMT durante el desarrollo. El cojín cardíaco embrionario ha sido estudiada consecutivamente en un modelo de cultivo de órganos que demostró la separación de células de las células endoteliales iniciales TGF-2 mediada por TGF-3, mientras que se requería para el cambio morfológico de células que permitió la migración de las células en la matriz extracelular .97 Estas conclusiones se basaron en experimentos que se han utilizado en la oligodesoxinucleótidos y neutralizantes de anticuerpos de TGF-3 para inhibir la EMT en vitro.97

191 Desarrollo del paladar .como se muestra en la figura 2, las formas del paladar secundario como una consecuencia de la prominencia maxilar. Interesantemente, se ha demostrado recientemente que la cobertura del cerdo (shh) y la Fgfr2b también se expresaron en la epitelio palatal temprano 98 y parecen ser inducida por Fgf10. Cuando esta vía fue interrumpida en animales transgénicos, los procesos palatales fallaron en crecimiento.98 Los estantes normales palatinos se elevan y crecen hacia la línea media donde se fusionan en algunos de los epitelios en las celulas del borde medial (MEE) se mueven en el mesénquima a través el proceso de EMT (Fig 2). La migración de células MEE se pueden visualizar si las células epiteliales donde se bañan en un marcador que sólo penetra el epitelio superficial tal como carboxi 2,7 = diclorofluoresceín succinimidiléster diacetato (CCFSE). Después de las crestas palatinas han sido órgano que cultivaron durante 3 días, en donde se encuentraron células mesenquimales (Fig 2C) demostrando que las células marcadas habían progresado a través de EMT.99 Durante el desarrollo del paladar en mamíferos TGFisomorfos 1, 2, expresión 3, T RII, RIII y T se detectaron en el epitelio del borde medial (MEE) en el sitio de hibridizacion100 y inmuno-histoquimico.101,102 de particular interés fue las localizadas de TGF-3 ARN, y en menor medida en TGF-1 y TGF-2 en el MEE y el epitelio del tabique nasal, que estaban destinados a someterse a incremento EMT.100 usando oligodesoxinucleótidos antisentido o anticuerpos neutralizantes a TGF-3, pero no TGF-1 o TGF-2 , resultado en el fracaso de la fusión del paladar in vitro.103 Otros experimentos demostraron que el TGF-3 transgénicos y golpe fuera de los ratones tienen el paladar hendido como su único defecto.104,105 Cuando los procesos palatinos de TGF-3 en ratones golpe fuera se cultivaron, los epitelios de la línea media no pudo pasar por EMT.106,107 Sin embargo, la sobreexpresión de Smad2 en el TGF-3 animales nula partia del rescate fusión palatal.108 Además, aunque algunos pollos tiene paladar naturalmente abierta, los estantes de pollo en cultivo fusionado cuando se añadió TGF-3 en el medio.109 Está claro que a partir de estos experimentos que el TGF-3 es un factor de crecimiento esencial al inducir EMT durante la fusión del paladar. Investigadores han propuesto que los posibles mecanismos de TGF-3- fusión palatal inducida incluyen la regulación de la fusión mediante la inducción de filopodia de la membrana celular en MEE antes plataforma de contacto.107 En segundo lugar, la regulación de la matriz extracelular y la degradación mediante la modulación de la producción del inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2), MMP13, y MMP2 ha sido propuesto.110 Recientemente, se encontró que el TGF-3 es necesaria para inhibir la proliferación MEE durante EMT.111 Varios grupos de investigación han empezado a investigar el TGF-3 intracelular estimulada por moléculas de señalización que son responsables de EMT durante la fusión del paladar. Smad2 la expresión se detectó durante la fusión palatal, 112 y ha sido sugerido que la fosforilación de Smad2 puede ser necesario para TGF-3 de regulación a la baja de la proliferacion MEE.111 Los grupos y la sobreexpresión de Smad2 en el TGF-3 - / - ratón no hizo el rescate de las

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Table 2 Proteinas senal de transduccion, Abbreviaturas y Definiciones Activin Angiopoietin-1 BAMBI bax b-catenin

bcl-2 BMP-1-9 CAM cAMP cAPKs Cereberus cGMP Chordin Cripto Cyclops COL DAG Dia dpp E-cadherin ECM EGF erk ET-1 FAK FGF 1-10, Follistatin GAP Gdf-5 GDI GDNF GEF GPCR grb2 HGF ICE IGF Ihh Inhibin integrim ILK JNK/SAPK Kinase Lefty LIF MAP kinase MAPKK MAPKKK MIS MMP

Proteina de senalizacion, miembros de la familia TGF, actividad de induccion en el mesodermo Factores brotes—interactuando con el Tie-2 (receptor) durante la angiogenesis. Proteina transmembranal, cuyo dominio intracelular se asemeja a la homodimeracion interface T RI receptor y la formacion de la prevencion of TGF- receptor complejo bcl-associated x proteina de la muerte cellular acelerada (apoptosis) Se une al E-cadherin en uniones celula-celula, pero puede ser modulado por agentes de senalizacion (Wnt, Ras, and PI-3 kinase) recolocado en los nucleos e interactuando con los factores de transcripcion (TCF/LEF-1); estabilizador nuclear catenin posee un estado que induce EMT in vitro133 B celula de linfoma proteinica donde existe bloques de muerte celular (apoptosis) Proteina del hueso morfogenico, miembros del TGF- familia—inducida por la placa neural,diferenciacion esqueletal, y otras inducciones Moleculas de adhesion celular (neuronal CAM [N-CAM], L-CAM E-cadherin) AMP ciclico, Segundo mensajero de la senal de trasduccion GPCR del camino AMP ciclico-dependen quinasa ademas el llamado protein- kinase A (PKA) Factor de senalizacion, Lim-1 y Cereberus-relato nulo de los ratones de la cbeza GMP ciclico Molecula de senalizacion activa en el desarrollo muy temprano incluyendo la formacion primitiva, expresada por el nodal, cripto, and Vgl; tambien la parte del nodo primitivo (organizado) Descripcion de Chordin Molecula de senalizacion expresado en primordios opticos para separar campos opticos Colageno—matriz d e proteinica extracelular; encima de miembros de 25 familias que estan identificados; superficie de las celulas receptoras para el colageno de las integrinas Diacilglicerol, Segundo mensajero para GPCRs p140 Diaphanous, sustrato para RhoGTP, polimerizacion de actina promotora Decapentaplegic-TGF- familia, desarrolo de senalizacion del miembro Celula de adhesion molecular encontrada en la uniones adheridas Matriz extracelular incluida el colageno, lamina de proteoglicanos y fribronectin, etc Factor de crecimiento epidermal Senal extracellular de la regulacion de proteina encontrada en la cascada de senalizacion del MAP kinase Endotelial-1, molecula de senalizacion secretada de las arterias coronarias que estimulan la conduccion del sistema de desarrollo Adhesion focal de la kinasa, asociado en la senalizacion de los recptores de integrina Factor del crecimiento fibroblastico 1-10, senalizacion de la moleculas expresadas mediante el desarrollo; asociado con el sindecan y receptores FGF I–III Molecula de senalizacion para el trabajo con el vaso y chordin (de la notocorda) del block BMP-4 que induce la formacion del sistema nervioso GTPase proteina de activacion en el Rho, vias de proteinas del Ras Cdc42 Factor de crecimiento y diferenciacion-5, miembro de la familia BMP , activada en la formacion conjunta de las articulaciones Del Wnt-14 Inhibidor de la asosiacion de la Guanina-Nucleotido, secuestra RhoGDP y lo mantiene en forma nactiva Celula Gliacil-derivado del factor neurotrofico, simulacion uterina para crecer mas que el blastema meteratrogenico Factor de intercambio de la Guanina, converted ede la familia Rho p r o t e i n i c o p a r a e s t a d i o GDP to GTP Proteina G-receptores acoplados,d e s c r i p c i o n g e n e r a l d e l o s receptors que requieren proteina G para la propagacion de la senal—mira glosario. Factor de crecimiento receptor-acoplado de la proteina 2, adaptado a la proteina de crecimiento y el factor receptor Factor de crecimiento Hepatico (factor disperso) Interleuquina-1 enzima convertida Factor de crecimiento de insulina Indian hedge hog, senalizacion de la molecula de la famila sonic hedgehog Inhibidor de la secrecion de la gonadotropina por la hipofisis ECM receptor y heterodimeros -ver glosario Integrina-vinculada con la kinasa Jun N-terminal kinasa t ambién conocido como SAPK, actividad stress proteína quinasa Enzimas que fosforila otras proteinas F a m i l i a TGF, determinacion del cuerpo asimetrico Factor inhibidor de Leukemia Actividad mitogen de la proteina Kinasa—ver glosario Actividad mitogen de la proteinica kinase tambien conocido MEK Actividad mitogen kinase-kinase-kinase o MEKK Mullerian sustancia inhibidor, familia TGF, regresion de los ductos parmesometricos Matriz metaloproteinas, larga familia de enzimas para digerir ECM proteinas

Desarrollo Craneofacial

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Table 2 Continuacion NCAM NGF Nodal Noggin Notch NT-3 PDGF PDK PKB PKC Ptc Phosphatase PI3kinase PIP2 RA r-Fng SARA ROCK Shh

Smo Smad Src TGF- 1-3 T RI, II, III TIMP VEG-f Wnt-1

Celula Neural, molecula de adhesion Factor de crecimiento del nervio F a m i l i a TGF-, formacion del mesodermo y la racha primitiva, derecho-izquierdo fijacion axial Molecula de senalizacion Receptor de la superficie celular activado por Delta o Jagged que inhibe a la célula vecina de la diferenciación en el fenotipo dominante; un mecanismo utilizado para producir las células gliales en lugar de las neuronas Neurotrofina 3, miembro de la familia del factor de crecimiento nervioso, necesario para la migración de la cresta neuronal especialmente en el tracto de la salida cardíaca Platelet-derivado del factor de crecimiento 3-Fosfoinostide-dependen de la proteina kinasa Proteina kinase B tambien conocido como Akt Proteina kinasa C Receptor inhibe el Shh que Smo unido a Shh—See Shh Enzima de la proteina de la desfosforilacion Fosfatidylinositol 3 kinasa Fosfatidylinositol (4, 5)-bisfosfato Acido retinoico Fringe-expresada en la cresta ectodérmica apical durante el desarrollo de las extremidades radical temprano Smad anclaje de activacion del receptor , TGF- senalizacion Rho espiral asociada en cual contiene la proteína Kinasa también conocido como p160 Rho kinasa Sonic hedgehog, señalando molécula que se une al receptor PTC (parcheado) que libera el efecto inhibidor de Ptc en Smo; activa en el nodo primitivo, notocorda, placa de piso, portales intestinales, de la zona de actividad polarizante, brotes de pelo y unas, consejos ectodérmicas de procesos faciales, ectodermo apical del segundo arco, puntas de brotes epiteliales pulmonares, retina, tubérculo genital Smoothened, proteína integral de la membrana, que activa Gli, un factor de transcripción smad y mad senal homologa de la proteina recolocado en 1996, activado enel camino de la TGF La kinase estuvo descrita por primera vez por el sarcoma virus Rous ;s i n e m b a r g o t a m b i e n s e e n c u e n t r a e n las celulas normales Transformacion del factor del crecimiento, familia larga en el factor de crecimiento Transformacion del factor de receptor Inhibidor del tejido de metaloproteinas Factor del crecimiento endotelial Homóloga del Wingless y drosófilas encontró en ectodermo neural anterior al organizador ístmico

*Varias referencias incluyendo Lodish e colaboradores2 y Carlson.138

fisuras palatinas secundarias. También hay evidencia de los estudios de cultivo de células epiteliales mamarias que la regulación por disminución de la señalización de la disminución del Smad del crecimiento pendiente-Smad y las respuestas transcripcionales; sin embargo, la regulación a la baja no afectó a la formación de fibras de estrés TGFmediada y EMT.113 La comprensión de las senalesde transducción puede ser complicados. Por ejemplo, hemos investigado recientemente el papel de la señalización de TGF durante la formación de paladar secundario en un modelo de ratón (Fig 3). Hemos encontrado que un efecto alternativo bajo la señalización del MEE, PI-3 quinasa, ha sido identificado como un efector en la reorganización de la actina y TGF-mediada EMT.114-116 activado PI-3 quinasa fosforila fosfatidilinositol 4,5bisphophate ( PIP2) para generar fosfatidilinositol 3, 4, 5trifosfato (PIP3), que reclutan los efectos bajo a la membrana plasmática (Fig 1C). Junto con las pequeñas GTPasas Rho y Rac, PIP3 activa varias serina / treonina quinasas tales como proteína quinasas 3-fosfoinostidedependientes (PDKs) .117,118 PDK1 activa PKC, p70S6K1,119 y se dirige a Thr308 de la proteína quinasa B (PKB, también conocido como Akt), 120 mientras que la integrina-quinasa vinculadas (CIC), un PDK recién encontrado Akt activa en su sitio.121 Ser473 en la estimulación donde migra Akt y anclajes de la membrana.122 Posteriormente, Akt activado se separa de la membrana plasmática y se transloca en el citoplasma y el núcleo, la regulación de la supervivencia celular, la síntesis de proteínas, y la célula Cy.123 También

parece que PI-3 quinasa posee tanto los lípidos y la actividad proteína quinasa 124 y puede controlar directamente las actividades de los componentes individuales de la RAS / RAF / ERK- Path- manera mitogénica mediante la formación de un complejo de señal de proteínas. Las consecuencias de la activación quinasa PI-3 son numerosos, incluyendo los efectos sobre la progresión del ciclo celular, la suspensión de medicion de la apoptosis, la migración celular, y alteraciones en la célula-célula de adhesion.125 PI-3 quinasa que tiene funciones reguladoras clave y participa en el desarrollo del cáncer. El control de la PI-3 quinasa es la actividad, por lo tanto, esencial para la homeostasis. Muchos de estos cambios celulares requieren la reorganización del citoesqueleto de actina. Como un efecto bajo de señalización TGF-senal, PI-3 quinasa está implicada en la reorganización de la actina, metaloproteina (MMP) de producción, y la célula mobil.114,115 Fue demostrado que LY294002, un inhibidor específico de la PI-3-quinasa , completamente bloqueado TGF-mediada por la C-terminal fosforilación de Smad2, la migración celular, y EMT parcialmente bloqueado en cultura de las células de las epiteliales mamarias.116 Desde MMPs son necesarios para romper la membrana basal, se especuló que el bloqueo de PI-3 actividad migración quinasa inhibidor celular y la producción de MMP, que son procesos esenciales durante la EMT. Además, la sobreexpresión de una quinasa bajo el CIC efector PI-3 inducida anclaje independiente de crecimiento epitelial celular, pérdida de expresión de E-

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Figure

3 Las distintas secciones individuales de hematoxilina y eosina (H & E, A, A ', B, B') y laminina manchado (C, C ', D, D') de los tejidos del paladar después 72 horas en el control (A, C) o 1 M LY294002tratado (B, D) medio. En paladar esta completamente unido en el control medio(A, A '). No se observaron epitelios en la línea media. En presencia de 1 M LY294002, epitelios borde medial persistieron (flechas en B, B '). La laminina se observó bajo el epitelio de la superficie oral en todos los grupos (puntas de flecha en C, D) y en las zonas mesenquimales que pueden estar desarrollando los vasos sanguíneos. Sin embargo, laminina fue negativa en la línea media del paladar en el grupo control cultivado (flechas en C, C '), indicando que la lámina basal tenía completamente degradado en el paladar fusionado. En contraste, se detectó lamina estratificado en la línea media de LY294002- grupos tratados (flechas en D, D ') lateral de dos capas del MEE. Barra de escala 80 m en D (se aplica a A-D), 40 m de D '(se aplica a A'-D'). La medida de las puntuaciones de fusión de los paladares después se calcularon 72 horas de la cultivo en los diferentes grupos de tratamiento como se describe en el estudio de Janji y leagues.127 No hubo diferencia significativa entre los controles y 100 M LY294002- tratado en los paladares. Sin embargo, los tejidos tratados con LY294002 1 y 10 M fueron significativamente diferentes de los controles (* p 0,01) . 129

cadherin y EMT.126,127 CIC también implicaciones indica en TGF-inducida por la conversión fibroblástica de células metastasicas.128 Una reciente investigación en nuestro laboratorio apoya la teoría de que la PI-3-quinasa era necesario para la EMT durante el desarrollo del paladar secundario in vitro (E13.5-

E16.5) .129 Hemos demostrado que el inhibidor de la quinasa PI-3, LY294002, y la disminución del palatal mediode fusión y la degradación de la lámina basal bloqueado. Control de los paladar fusionados (figura 3A, A ') y el MEE progresaron a través de EMT mientras que la lámina basal degradado (Figura 3 C, C') en la cultura. Los procesos

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Palatinos tratados con LY294002 tenían células mecánicas en la línea media (Fig 3B, B ') y la lámina basal aún contenía laminina (Fig 3 D, D') y por tanto no se degrada. Sin embargo, era posible que la inhibición de la PI-3 quinasa retrasó pero no bloqueó completamente el EMT como en algunos de los paladares fueron parcialmente fusionados129 (figura 3, gráfico de la puntuación media de la fusión). Aunque hay pruebas de que PI-3 kinasa puede ser guiado bajo de el TGF, también bajo de otros factores de crecimiento y receptores de integrina como se ha mencionado anteriormente. Además la PI-3 quinasa, otras vías de señalización también pueden ser activados por TGF. Una investigación de TGF-1 mediados desamblados de las uniones célula-célula epiteliales demostrado un vínculo entre la vía TGF / Smad y las alteraciones de catenin / E-cadherin fosforilacion.130 Un estudio posterior por el mismo grupo transfectados transitoriamente del epitelios con Smad2 / 4 o Smad3 / 4 ex vectores de presion pero no alteró fenotipo celular . 131Estos resultados sugieren que la vía Wnt que puede ser una vía de señalización potencial más medial de acontecimientos posteriores del siguiente receptor de TGF-vinculante. Como parte del citoesqueleto epitelial, catenin se une a la Ecadherin. La actividad de catenin se controla por un gran número de parejas de unión que afectan a su estabilidad y la localización, que puede ser modulada por muchos agentes de señalización tales como Wnt, Ras, y PI-3 kinase.42,132,133 En la liberación a partir del complejo, reubica catenin en el núcleo e interacciona con factores de transcripción tales como TCF / LEF-1. Esta bilizacion de la catenin nuclear donde se ha demostrado que induce la EMT en vitro.134 Además de los cambios en los factores de crecimiento, la modulación de entorno extracelular también incluye el mantenimiento y degradación del ECM, que está mediada en parte por metaloproteinas (MMPs) y los inhibidores de tejido o metaloproteinasas (TIMP). Se observaron la expresión de MMPs temporopatial 2, 3, 7, 9, y 13, y TIMPs 1 y 2 donde se observaron durante la fusión de la murina palatal.135,136 La la zona de fusión palatal de TGF 3-ratones deficientes, TIMP-2 estaba completamente ausente; MMP-2 y MMP-13 tiene a reducir niveles.110 En la exposición al inhibidor de MMP (BB 3103), los procesos murinos palatales han logrado fusionar en cultura.137

tratamiento de diversas anomalías craneofaciales. Sin embargo, los agentes terapéuticos eficaces y aceptables con esta propiedad se carece y aún permanecen en las etapas iniciales de exploración. Las acciones de los factores de crecimiento son muy complejas, por eso cada factor de crecimiento que tiene múltiples efectos a diferencia de los efectos de varios tejidos, así como las interacciones de cada factor puede tener otro orden sobre otra. Aún esta por determinar las complejidades de estos efectos y la forma en que se puedan ver afectadas por la concentración, el factor de duración de la exposición, y la etapa de desarrollo de las células o tejidos tratados. Antes de la terapia del factor de crecimiento puede ser eficaz en el ámbito clínico, se necesitará una serie de preguntas sin respuesta, incluidas los criterios de seguridad, dosis y medidas del requerimiento del tratamiento, preocupaciones temporales y vehículos adecuados en los que se entrega los factores de crecimiento en un sitio de acción. Muchos factores de crecimiento requieren una exposición prolongada para generar una respuesta, por lo que la elección del vehículo de entrega es de muy critica importancia. A pesar de los límites de la tecnología actual, la aplicación de factores de crecimiento en el crecimiento y en el desarrollo craneofacial muestra una promesa considerable. Es probable que las combinaciones de factores de crecimiento pueden ser útiles en algunas circunstancias clínicas. El gran potencial de factores de crecimiento para mejorar el tratamiento de diversas anomalías craneofaciales no debe ser ignorado, pero, en lugar, necesita más investigación. Estamos claramente en el umbral de una nueva era en el desarrollo de los regímenes de tratamiento, en el que vamos a ser capaces de regular los procesos que rigen el crecimiento y el desarrollo normal y anormal y quizás en última instancia, compren- dan las complejidades involucradas en el desarrollo craneofacial.

Glosario para la señal de traduccion Tipos de Receptores

Conclusiones

y

Futuras

direcciones

Crecimiento y desarrollo craneofacial es un proceso complejo y estrechamente regulado. En los últimos años, se ha hecho evidente que la interacción entre los numerosos factores reguladores de crecimiento que afectan a las células del tejido del ser humano en desarrollo y la regulación espacial 138 Mientras que una gran cantidad de información ha sido adquirida desde los primeros descubrimientos de los factores de crecimiento, se necesitan más estudios para determinar cómo estos factores pueden ser manipulados en un entorno clínico para aumentar el tratamiento. Naturalmente ocurre señales endógenas para el desarrollo craneofacial ,estos agentes terapéuticos potenciales para el

Receptores acoplados proteinico G (GPCR): La familia mas grande de moleculas receptoras. Ese es un receptor caracterizado multiple de dominios transmembranal (siete usualmente) que gana una proteina dentro y fuera de la menbrana en una conformación serpentiante. Algunos ejemplos son: los receptores de acetilcolina muscarínicos, receptores de acetilcolina nicotinamida, rodopsina, receptor adrenérgico. Receptores de canales iónicos: Los receptores de canales iónicos están estrechamente relacionados con los GPCR y en realidad pueden abrir un canal de la membrana cuando el ligando se le une. Receptores de tirosina quinasa: Estos receptores tienen usualmente un dominio transmembranal y al menos dos moléculas que deben dimerizar para activar la señal. Los

196 ejemplos incluyen: EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; PDGFR, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas; IGFR, receptor del factor de crecimiento de la insulina; T y T RI RII, TGF-receptores I y II; FGF, factor de crecimiento de fibroblastos. Clases de receptores vinculados con la tirosina quinasa : Estos receptores carecen de actividad intrínseca, pero cuando el ligando se une, tirosina quinasas intracelulares se activan para generar cambios celulares. Receptores asociados con la matriz extracelular : los receptores de integrina y la familia tienen indicando una sola transmembrana principal extracelular y con un dominio citoplásmica mucho menor. Las moléculas syndecan tienen largas cadenas de glicosaminoglicanos que ayudan en el secuestro de la FGF cerca de la celda membrana.3-6 Los receptores de la integrina son heterodimeros compuestas de subunidades. La familia es grande, con al menos 25 heterodímeros de integrina, incluyendo 19 sub-unidades y 8 subunidades identificados.7 Las integrinas no tienen actividad quinasa, pero en la unión a moléculas de ECM, las proteínas asociadas se activan por autofosforilación y luego fosforilan las proteínas circundante para generar señales a la quinasa MAP, Rho, o vias quinasa PI-3. Moléculas de señalización intracelular y 2ª Mensajeros Definiciones Generales Adaptador de proteínas: Las proteínas con específicas proteína-proteína con dominios que mantienen grandes complejos multiproteicos juntos. El Adaptador de proteínas no tienen actividad catalítica y no activan otras proteínas. Contienen diferentes dominios que actúan como sitios de ataque para otras proteínas tales como dominios para los residuos de fosfotirosina (dominios SH2 y PTB), prolina (dominios SH3 y WW), fosfoinosítidos (red dominios PH), y la secuencia única con la C residuos terminal hidrofóbica (dominios PDZ). Quinasa: La clase de enzima que fosforila aminoácidos (serina, treonina, y tirosina) mediante la transferencia de un grupo fosforilo a partir de ATP o GTP a la proteína con una secuencia de consenso específico. Fosfatasa: La enzima que elimina el grupo fosforilo a partir de una proteína. GPCR asociada a proteínas de segundo mensajero: G y activar la enzima adenilato ciclasa para producir AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (cGMP), diacilglicerol (DAG), fosfoinositol, y calcio (Ca2). Ras-Raf-MAP quinasa: La familia MAP quinasa puede responder a una variedad de señales extracelulares, incluyendo, estrés osmótico, choque térmico, las citoquinas, y los mitógenes. Señalización camino arriba conduce a una activación de tirosina quinasa que activan proteínas G (Ras, Rac, Cdc42) a través de adaptador de proteínas tales como Grb2 o mSOS1. Las proteínas G activan Raf, también conocido como quinasa activada por mitógen-quinasaquinasa (MAPKKK) o MEKK activado por estimulos del Raf (vía serina / fosforilación treonina) activada por el mitógen quinasa-quinasa (MAPKK) o MEK. Estimula el MEK (vía tirosina y fosforilación de la treonina) activada por la proteína quinasa (MAPK) o la señal extracelular

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proteína regulada (ERK). En la familia de MEKK, hay varias isoformas Raf incluyendo raf-1, B-Raf, y A-Raf. Hay por lo menos 5 MEKs con MEK 1/2 que actúan específicamente en ERK1 / 2. En la actualidad hay varias ramas de MAPK incluyendo ERK1 / 2, JNK / SAPK, p38, ERK-3, y varios homólogos relacionados con p38. Vías de señalización a través de fosfoinositol PI-3 quinasa: PI-3 quinasa fosforila PIP (PI (4) fosfato) o PIP2 (PI (4,5) bisfosfato) en la posición D3 para generar, respectivamente, PI (3,4) P2 o PI (3,4,5) P3. 138 Estos subproductos de fosfolípidos han sido implicados con la señalización y reorganización del citoesqueleto a través de interacciones con prolin, gelsolina, y Rac. PI-3-quinasa de señalización es necesaria para la EMT durante el desarrollo del paladar. Proteínas Small G Rho, Rac y Cdc42: alternar entre la forma activa unida a GTP (bajo) y la forma inactiva PIB determinada (apagado). Muchas otras proteínas regulan el "on" y el estado "off" de las proteínas G pequeñas. Los factores de intercambio de guanina-nucleótido (GEFs) son el "sobre" la señal, ya que añadir GTP a la proteína. Proteínas GTP-activación (BPA) son la senal "off" , ya que eliminar un fosfato para desactivar la proteína. Disociación Guaninanucleótido inhibidor de proteínas (GDIs) secuestra la proteína inactiva en el campo.1,12,20-23 citoplasmático. La disminución de los niveles de proteína Rho o disminución de la actividad de otros Tegrin dan la señalización de moleculas.24

Referencias: 1.

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