Extraccion De Adn De Mosquito Y Sangre
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EXTRACCION DE ADN EN SANGRE Y EN MOSQUITO Y ELECTROFORESIS Edin Arroyo, Leonardo Chamorro, José Martínez, Libardo caraballo Universidad de Sucre. Facultad de Educación y Ciencias. Departamento de Biología. Programa de Biología. Laboratorio de parasitología molecular.
RESUMEN El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas. Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales con el fin de extraer material genético de muestras de sangre y de mosquito. Este método consiste en la utilización de altas concentraciones de sales acetato de amonio para precipitar proteínas y posteriormente precipitar ADN con alcohol absoluto, para comprobar los resultados de la extracción se realizo un electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el gel de agarosa. Este método resulta ser viable para la extracción de ADN en ambas muestras. Palabras claves: extracción de ADN,
electroforesis, sangre, , mosquito,
acetato de amonio, gel de agarosa.
INTRODUCCION El
ácido
desoxirribonucleico,
frecuentemente ADN
o
información genética usada en el
abreviado
DNA,
DeoxyriboNucleic
del Acid,
como inglés
es
una
macromolécula que forma parte de todas
las
células.
Contiene
la
desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su transmisión hereditaria. La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que
los
iones
salinos
son
atraídos hacia las cargas negativas
de le adicionó 500 µL de acetato de
del ADN, permitiendo su disolución
potasio 8M se incubo durante 30
y posterior extracción de la célula.
minutos en hielo y posteriormente
Se empieza por lisar (romper) las
se centrifugo a 13000 rpm durante
células mediante un detergente o un
15 minutos. Sele adiciona 100 µL
buffer
su
de etanol y se incubo a temperatura
una
ambiente por 10 minutos. Se vuelve
disolución tampón en la que se
a centrifugar por 15 minutos y el
disuelve el ADN. En ese momento,
precipitado se lavo con etanol al
el tampón contiene ADN y todo un
70%
surtido de restos moleculares: ARN,
temperatura
carbohidratos,
otras
resuspende en 20 µL de buffer TE.
sustancias en menor proporción.
Extracción de ADN del mosquito.
Las proteínas asociadas al ADN, de
El
gran longitud, se habrán fraccionado
triturado en 50ml de tampón de lisis.
en
Esta solución se incubo por 1hr a
de
contenido
lisis,
vaciándose
molecular
cadenas
proteínas
más
en
y
pequeñas
y
dos
veces.
seca
a
y
se
ambiente
ejemplar
de
mosquito
65°C.
buffer de lisis. Sólo queda, por
acetato de potasio 8M y se incubo
tanto, extraer el ADN de
por 30min en hielo, posteriormente
esa mezcla
se centrifugo a 13000 rpm durante
para lo cual se utiliza etanol frio.
adicionaron
fue
separadas de él por acción del
tampón y detergente,
Se
Se
14µl
de
15min. Y se incubo a temperatura ambiente
MATERIALES Y METODO
por
10min
en
etanol
absoluto. Se volvió a centrifugar a
Extracción de ADN en sangre Para la extracción de ADN se tomo una muestra de sangre (250 µL) a la cual se le adiciono 250 µL de buffer
13000rpm y el precipitado se lavo dos veces con etanol al 70%. Se seco a temperatura ambiente y se resuspendio en 20µl de buffer TE
de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm pH 8,25; SDS 0,05 %).A esta solución de le adiciono proteínas K a una concentración
de
10mg/ml.
Se
incubó a 65 °C por una hora y luego
Se lavó con 500µL de etanol al 70%, se centrifugó a 12000 rpm por 10
min
y
se
descarto
el
sobrenadante. El precipitado se dejó secar a temperatura ambiente y por
último se re suspende con 100 µL
concentraciones de sales. Se utilizo
de agua.
buffer de lisis, cuya función es romper
ELECTROFORESIS Después de realizar la extracción de ADN, tanto del vector como de la muestra de sangre se procedió a realizar la electroforesis, la cual se realizo en gel de agarosa 1%. Las muestras de DNA tanto de sangre como de mosquito se disolvieron en un buffer de carga (Green) en una proporción
8:2µl respectivamente.
Posterior a esto se hizo la siembra en los posos y se procedió a realizar el corrido.
la
nuclear,
membrana permitiendo
celular
y
esto
la
liberación del ADN. Dicho buffer, para la extracción de ADN de sangre, contenía Proteinasa K, es una
proteasa que degrada las
proteínas de membrana y facilita su lisis,
liberando
el
ADN.
Químicamente la proteinasa K actúa a nivel de los péptidos en los grupos
carboxílicos
alifáticos
y
aminoácidos aromáticos propios en los lípidos de membrana. Este proceso de lisis de membrana fue complementado con el baño de
RESULTADOS Fig.1 Corrido de las muestras de ADN en el gel de agarosa.
María que a 65 0c activa de forma eficiente a la proteinasa K. La remoción
de
contaminantes
se
proteína
y
realiza
por
centrifugación adicionando alcohol, obteniendo compuesto membrana, protoplasma
un
sobrenadante
por
restos
organelas y
de
celulares,
restos
de
hemoglobina, esto para el caso del ADN extraído de sangre, debido a que la extracción de ADN de ANALISIS DE RESULTADO
mosquito no se utilizo la proteinasa
En la práctica realizada se obtuvo
K.
DNA de sangre y de mosquito
Después de la ruptura celular y la
mediante
eliminación del pellet de restos
el
método
de
altas
celulares, se añade una sal para
disminuir
la
solubilidad
de
las
separando
las
proteínas
con
proteínas por incremento de la
solventes orgánicos y precipitando
fuerza iónica del solvente, lo que se
el DNA de la fase acuosa con etanol
conoce
absoluto.
como
precipitación
por
salado.
Después de la adición
La muestra es lavada y precipitada
de
cantidad
se
con alcohol al 70% del cual el 40%
establece una competencia entre
es alcohol y el 30 % es agua. El
los grupos cargados y polares de la
alcohol se encarga de precipitar el
proteína y los iones de la sal (en
ADN, pues este, es soluble en agua
mayor número) por las moléculas de
(y, por tanto, invisible a nuestros
agua que disminuye la capa de
ojos, pues cada molécula está
solvatación alrededor de la molécula
rodeada de agua y nuestra vista no
proteica, sus grupos hidrofóbicos
percibe moléculas individuales de
superficiales
cierta
se
ADN) pero insoluble en alcohol, lo
establecimiento
de
cual origina que en presencia de
interacciones intermoleculares, la
éste se aglutine o "se precipite". Al
agregación
aglutinarse, el ADN forma partículas
el y
exponen
sal,
y
favorece
se
de
por
tanto,
la
precipitación. Cuando se centrifuga
macroscópicas y se hace visible.
se obtiene un precipitado blanco. El
Finalmente el ADN es resuspendido
pH puede variar la solubilidad de las
en buffer TE, el cual es una solución
proteínas ya que los grupos pueden
amortiguadora del pH comúnmente
cargarse o descargarse haciendo la
empleada en biología molecular,
superficie más o menos polar. A pH
especialmente para procedimientos
isoeléctrico
repulsiones
que buscan proteger al DNA o RNA.
intermoleculares son mínimas ya
La capacidad amortiguadora del
que la carga neta es cero. Las
buffer depende del Tris, mientras
características del anión y del catión
que el EDTA es el responsable de
también son importantes. Las sales
proteger a los ácidos nucleicos
más efectivas son las que presentan
inactivando
aniones polivalentes mientras que
RNAsas.
los cationes son menos importantes,
inactivación
no
quelante
obstante
las
se
prefieren
los
monovalentes. Con el sobrenadante se
procede
de
igual
forma,
a El
de
las EDTA
DNAsas logra
actuando cationes
o
esta como
divalentes
como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales
son
indispensables
para
el
http://www.escolares.net/des
funcionamiento de estas enzimas.
cripcion.php?ide=942
Dicha muestra de ADN se utilizo para realiza la electroforesis en gel de agarosa, la cual demostró que el proceso de extracción de ADN se dio de forma correcta e incluso se dieron resultados en la muestras de ADN mal tratadas. Tal como se puede observar en la imagen.
de lisis del material celular, la cual degrada los péptidos de membrana
plasmática
y
nuclear,
facilitando
la
liberación de ADN. ADN
se
precipita
en
alcohol, pues es insoluble en este, y se torna visible en la interfaz alcohol-H2O. El
corrido
depende
de
electroforético una
buena
práctica de extracción de ADN. BIBLIOGRAFIA
LETELIER Ignacio. Grupos sanguíneos. [En línea]. Terra Networks, Disponibilidad:
G. Salazar. La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR [En línea]. Microbial S. Girona España. Disponibilidad: http://www.microbialcs/news/Newslet _Microbial
La proteinasa K es un buffer
El
Gustavo A. Saldaña, Efraín
systems.com/web/uploads/do
CONCLUSIONES
S.A. Chile.
RESUMEN El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas. Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales con el fin de extraer material genético de muestras de sangre y de mosquito. Este método consiste en la utilización de altas concentraciones de sales acetato de amonio para precipitar proteínas y posteriormente precipitar ADN con alcohol absoluto, para comprobar los resultados de la extracción se realizo un electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el gel de agarosa. Este método resulta ser viable para la extracción de ADN en ambas muestras. Palabras claves: extracción de ADN,
electroforesis, sangre, , mosquito,
acetato de amonio, gel de agarosa.
INTRODUCCION El
ácido
desoxirribonucleico,
frecuentemente ADN
o
información genética usada en el
abreviado
DNA,
DeoxyriboNucleic
del Acid,
como inglés
es
una
macromolécula que forma parte de todas
las
células.
Contiene
la
desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su transmisión hereditaria. La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que
los
iones
salinos
son
atraídos hacia las cargas negativas
de le adicionó 500 µL de acetato de
del ADN, permitiendo su disolución
potasio 8M se incubo durante 30
y posterior extracción de la célula.
minutos en hielo y posteriormente
Se empieza por lisar (romper) las
se centrifugo a 13000 rpm durante
células mediante un detergente o un
15 minutos. Sele adiciona 100 µL
buffer
su
de etanol y se incubo a temperatura
una
ambiente por 10 minutos. Se vuelve
disolución tampón en la que se
a centrifugar por 15 minutos y el
disuelve el ADN. En ese momento,
precipitado se lavo con etanol al
el tampón contiene ADN y todo un
70%
surtido de restos moleculares: ARN,
temperatura
carbohidratos,
otras
resuspende en 20 µL de buffer TE.
sustancias en menor proporción.
Extracción de ADN del mosquito.
Las proteínas asociadas al ADN, de
El
gran longitud, se habrán fraccionado
triturado en 50ml de tampón de lisis.
en
Esta solución se incubo por 1hr a
de
contenido
lisis,
vaciándose
molecular
cadenas
proteínas
más
en
y
pequeñas
y
dos
veces.
seca
a
y
se
ambiente
ejemplar
de
mosquito
65°C.
buffer de lisis. Sólo queda, por
acetato de potasio 8M y se incubo
tanto, extraer el ADN de
por 30min en hielo, posteriormente
esa mezcla
se centrifugo a 13000 rpm durante
para lo cual se utiliza etanol frio.
adicionaron
fue
separadas de él por acción del
tampón y detergente,
Se
Se
14µl
de
15min. Y se incubo a temperatura ambiente
MATERIALES Y METODO
por
10min
en
etanol
absoluto. Se volvió a centrifugar a
Extracción de ADN en sangre Para la extracción de ADN se tomo una muestra de sangre (250 µL) a la cual se le adiciono 250 µL de buffer
13000rpm y el precipitado se lavo dos veces con etanol al 70%. Se seco a temperatura ambiente y se resuspendio en 20µl de buffer TE
de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2 M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm pH 8,25; SDS 0,05 %).A esta solución de le adiciono proteínas K a una concentración
de
10mg/ml.
Se
incubó a 65 °C por una hora y luego
Se lavó con 500µL de etanol al 70%, se centrifugó a 12000 rpm por 10
min
y
se
descarto
el
sobrenadante. El precipitado se dejó secar a temperatura ambiente y por
último se re suspende con 100 µL
concentraciones de sales. Se utilizo
de agua.
buffer de lisis, cuya función es romper
ELECTROFORESIS Después de realizar la extracción de ADN, tanto del vector como de la muestra de sangre se procedió a realizar la electroforesis, la cual se realizo en gel de agarosa 1%. Las muestras de DNA tanto de sangre como de mosquito se disolvieron en un buffer de carga (Green) en una proporción
8:2µl respectivamente.
Posterior a esto se hizo la siembra en los posos y se procedió a realizar el corrido.
la
nuclear,
membrana permitiendo
celular
y
esto
la
liberación del ADN. Dicho buffer, para la extracción de ADN de sangre, contenía Proteinasa K, es una
proteasa que degrada las
proteínas de membrana y facilita su lisis,
liberando
el
ADN.
Químicamente la proteinasa K actúa a nivel de los péptidos en los grupos
carboxílicos
alifáticos
y
aminoácidos aromáticos propios en los lípidos de membrana. Este proceso de lisis de membrana fue complementado con el baño de
RESULTADOS Fig.1 Corrido de las muestras de ADN en el gel de agarosa.
María que a 65 0c activa de forma eficiente a la proteinasa K. La remoción
de
contaminantes
se
proteína
y
realiza
por
centrifugación adicionando alcohol, obteniendo compuesto membrana, protoplasma
un
sobrenadante
por
restos
organelas y
de
celulares,
restos
de
hemoglobina, esto para el caso del ADN extraído de sangre, debido a que la extracción de ADN de ANALISIS DE RESULTADO
mosquito no se utilizo la proteinasa
En la práctica realizada se obtuvo
K.
DNA de sangre y de mosquito
Después de la ruptura celular y la
mediante
eliminación del pellet de restos
el
método
de
altas
celulares, se añade una sal para
disminuir
la
solubilidad
de
las
separando
las
proteínas
con
proteínas por incremento de la
solventes orgánicos y precipitando
fuerza iónica del solvente, lo que se
el DNA de la fase acuosa con etanol
conoce
absoluto.
como
precipitación
por
salado.
Después de la adición
La muestra es lavada y precipitada
de
cantidad
se
con alcohol al 70% del cual el 40%
establece una competencia entre
es alcohol y el 30 % es agua. El
los grupos cargados y polares de la
alcohol se encarga de precipitar el
proteína y los iones de la sal (en
ADN, pues este, es soluble en agua
mayor número) por las moléculas de
(y, por tanto, invisible a nuestros
agua que disminuye la capa de
ojos, pues cada molécula está
solvatación alrededor de la molécula
rodeada de agua y nuestra vista no
proteica, sus grupos hidrofóbicos
percibe moléculas individuales de
superficiales
cierta
se
ADN) pero insoluble en alcohol, lo
establecimiento
de
cual origina que en presencia de
interacciones intermoleculares, la
éste se aglutine o "se precipite". Al
agregación
aglutinarse, el ADN forma partículas
el y
exponen
sal,
y
favorece
se
de
por
tanto,
la
precipitación. Cuando se centrifuga
macroscópicas y se hace visible.
se obtiene un precipitado blanco. El
Finalmente el ADN es resuspendido
pH puede variar la solubilidad de las
en buffer TE, el cual es una solución
proteínas ya que los grupos pueden
amortiguadora del pH comúnmente
cargarse o descargarse haciendo la
empleada en biología molecular,
superficie más o menos polar. A pH
especialmente para procedimientos
isoeléctrico
repulsiones
que buscan proteger al DNA o RNA.
intermoleculares son mínimas ya
La capacidad amortiguadora del
que la carga neta es cero. Las
buffer depende del Tris, mientras
características del anión y del catión
que el EDTA es el responsable de
también son importantes. Las sales
proteger a los ácidos nucleicos
más efectivas son las que presentan
inactivando
aniones polivalentes mientras que
RNAsas.
los cationes son menos importantes,
inactivación
no
quelante
obstante
las
se
prefieren
los
monovalentes. Con el sobrenadante se
procede
de
igual
forma,
a El
de
las EDTA
DNAsas logra
actuando cationes
o
esta como
divalentes
como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales
son
indispensables
para
el
http://www.escolares.net/des
funcionamiento de estas enzimas.
cripcion.php?ide=942
Dicha muestra de ADN se utilizo para realiza la electroforesis en gel de agarosa, la cual demostró que el proceso de extracción de ADN se dio de forma correcta e incluso se dieron resultados en la muestras de ADN mal tratadas. Tal como se puede observar en la imagen.
de lisis del material celular, la cual degrada los péptidos de membrana
plasmática
y
nuclear,
facilitando
la
liberación de ADN. ADN
se
precipita
en
alcohol, pues es insoluble en este, y se torna visible en la interfaz alcohol-H2O. El
corrido
depende
de
electroforético una
buena
práctica de extracción de ADN. BIBLIOGRAFIA
LETELIER Ignacio. Grupos sanguíneos. [En línea]. Terra Networks, Disponibilidad:
G. Salazar. La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR [En línea]. Microbial S. Girona España. Disponibilidad: http://www.microbialcs/news/Newslet _Microbial
La proteinasa K es un buffer
El
Gustavo A. Saldaña, Efraín
systems.com/web/uploads/do
CONCLUSIONES
S.A. Chile.
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