Extaccion De Adn Vegetal.docx

I.

INTRODUCCIÓN

La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos, aquí se trabajará específicamente con la extracción de ADN vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. En plantas y hongos la pared celular es la primera barrera para la extracción, es necesario degradarla empleando métodos físicos o químicos. Los métodos físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración. Para bacterias y células desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.

II.

OBJETIVOS Objetivo General  Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN. Objetivos Específicos  Identificar la composición de los diferentes reactivos usados durante la práctica, los cuales tienen funciones especiales en la extracción del ADN vegetal.  Reconocer el ADN extraído luego del procedimiento aplicado.

III.

MARCO TEÓRICO

AISLAMIENTO DEL ADN El primer paso para desarrollar experimentos con marcadores moleculares es la extracción del material genético de plantas que, por sus características fenotípicas, poseen caracteres agronómicos de interés. Para la extracción del ADN vegetal es necesario tener en cuenta tres factores: 1. El tipo de planta y de tejido que se va a emplear como fuente. Por ejemplo, los tejidos jóvenes contienen más ADN que los tejidos viejos. Además, es necesario considerar la composición bioquímica de los tejidos. Por ejemplo, el método de extracción del material genético proveniente de tejidos ricos en compuestos fenólicos es diferente al método empleado con tejidos ricos en carbohidratos o aceites. 2. El tipo de ADN que se va a extraer. Las plantas poseen tres tipos de ADN: el nuclear, el mitocondrial y el cloroplástico. Reciben estos nombres dependiendo del tipo de organelo celular en el que el ADN se encuentre. Los distintos tipos de ADN tienen características bioquímicas semejantes. Sin embargo, el tipo de información biológica que codifican es completamente diferente. 3. El tipo de análisis a realizar (RFLP, RAPD, AFLP, secuenciación, etc). Con base en la cantidad y la calidad del ADN se pueden desarrollar diversas técnicas de análisis, algunas de las cuales serán explicadas con mayor detalle en próximos artículos. El objetivo principal en un experimento de extracción de ADN es obtener una preparación de buena calidad y en gran cantidad. La calidad se refiere a la posibilidad de almacenar el ADN por tiempo indefinido, manteniendo su estructura y propiedades y es la calidad del ADN el factor responsable de la reproduciblidad en experimentos posteriores. La cantidad, por su parte, es un concepto relativo que depende, entre otros, del número y estado de las células propias del tejido a estudiar. Por lo tanto, como regla general, un buen método de extracción debe mantener la

integridad física y bioquímica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y concentración (Rocha, 2002) En plantas existen múltiples protocolos para extraer y purificar el ADN. Sin embargo, todos ellos incluyen cuatro pasos indispensables: 1. Ruptura de tejidos y paredes celulares. Este paso consiste en pulverizar el material vegetal a bajas temperaturas, generalmente empleando nitrógeno líquido o hielo seco. (Rocha, 2002) También existe la pulverización en seco, un proceso en el cual los tejidos se deshidratan por secado en un horno o con silicagel. Sin embargo, este procedimiento no es de aplicación general, por ejemplo, el tratamiento de secado no permite recuperar ADN de buena calidad. Para degradar paredes celulares se pueden utilizar, además, enzimas tipo celulasas. 2. Ruptura de membranas. Una vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas celulares para liberar el ADN. Esto puede ser llevado a cabo químicamente con detergentes (SDS, Triton o detergentes comerciales). También se emplean métodos físicos, como aquellos basados en ultrasonido. 3. Inhibición de enzimas que destruyen al ADN. Como un mecanismo de defensa natural, las células contienen enzimas que destruyen al ADN (ADNasas). Estas enzimas deben ser inactivadas para garantizar la calidad de las preparaciones de ADN. La inhibición puede realizarse mediante métodos físicos, tales como desnaturalización por calor (a temperaturas de 65 C) o con métodos químicos. Estos últimos incluyen tratamiento con solventes orgánicos (fenol y cloroformo), con antioxidantes (Ditiothreitol y βmercaptoetanol), con agentes quelantes (EDTA, EGTA) que capturan los iones magnesio necesarios para la funcionalidad de las ADNasas, o con agentes caotrópicos que actúan removiendo el agua estructural de las proteínas (Rocha, 2002). Por lo general se utilizan mezclas de varios de estos reactivos para asegurar la inhibición de tales enzimas. 4. Extracción de contaminantes. El objetivo de extraer ADN es obtener preparaciones enriquecidas en esta molécula. Sin embargo, el ADN está asociado con proteínas (histonas) e inmerso en un medio que contiene estructuras de composición química diversa. Además, los reactivos empleados en los procesos iniciales de purificación se convierten en agentes contaminantes. TAMPÓN QUÍMICO Las soluciones tampón, denominadas también soluciones buffer, son aquellas que ante la adición de un ácido o base son capaces de reaccionar oponiendo la parte de componente básica o ácida para mantener fijo el pH. (www.scienceinschool.org ,2006) Un tampón o buffer es una o varias sustancias químicas que afectan a la concentración de los iones de hidrógeno (o hidronios) en el agua. Siendo que pH no significa otra cosa que potencial de hidrogeniones (o peso de hidrógeno), un buffer (o "amortiguador") lo que hace es regular el pH. Cuando un buffer es añadido al agua, el primer cambio que se produce es que el pH del agua se vuelve constante. De esta manera, ácidos o bases (álcalis = bases) adicionales no podrán tener efecto alguno sobre el agua, ya que esta siempre se estabilizará de inmediato. Composición de la solución tampón o buffers Los buffers consisten en sales hidrolíticamente activas que se disuelven en el agua. Los iones de estas sales se combinan con ácidos y álcalis. Estas sales hidrolíticamente activas son los productos que resultan de la reacción entre los ácidos débiles y los álcalis fuertes como el carbonato de calcio (a partir del ácido carbónico e hidróxido de calcio) o entre ácidos fuertes y álcalis débiles como el cloruro de amonio (a partir del ácido clorhídrico e hidróxido de amonio).

Un ácido buffer reacciona cuando un ácido débil o base débil se combina con su correspondiente sal hidrolítica en una solución de agua, se forma un sistema amortiguador denominado buffer. No siempre un sistema buffer es apropiado, porque los iones de algunas sales hidrolíticas pueden, por ejemplo, dañar a los organismos que entran en contacto con él. Por otra parte, cada sistema buffer tiene su propio rango efectivo de pH, algunos de los cuales no son adecuados para acuarios. Cálculo de pH de soluciones tampón Mediante el desarrollo del balance de masa y balance de carga para una solución reguladora típica se llega a una ecuación cúbica donde la incógnita es la concentración de iones hidronio u oxhidrilo. Frecuentemente se utiliza la ecuación de Henderson-Hasselbalch para el cálculo de pH en soluciones reguladoras. Sin embargo, debe aclararse que esta ecuación no es aplicable en todos los casos, ya que para su deducción deben realizarse una serie de suposiciones. Esta ecuación suele proporcionar resultados incorrectos cuando las concentraciones del ácido y su base conjugada (o de la base y su ácido conjugado) es baja. Ecuación de Henderson-Hasselbalch:

Donde pKa = -logKa [sal]=concentración de la sal [ácido]=concentración de iones hidrógeno Cuando se trata del pH de una solución amortiguadora o tampón químico de una sal con su base correspondiente se calcula el pOH de la misma forma solo que:

El pH luego se calcula restando el pOH a 14:

JABÓN LIQUIDO El Jabón liquido en la extracción de DNA tiene como función destruir las membranas celulares del tejido que se está, utilizando, ya que el jabón líquido disuelve las grasa, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (recordar que las membranas están formadas de lípidos específicamente de fosfolípidos). Al romperse las membranas celulares se permite la salida de DNA al exterior. (Alvarez, 2016)

SAL (NaCl)

Debido a su estructura química la sal actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que se separen más fácil del DNA. También ayuda a desintegrar la membrana plasmática. (Alvarez, 2016)

ALCOHOL INDUSTRIAL (96%) Se usa alcohol para que el DNA precipite en la interface entre el alcohol y el agua permitiéndonos ver claramente el DNA. Además, el alcohol permite que el DNA se separe de otros componentes y baje a la solución acuosa permitiendo ver mucho más clara fibras de ácido desoxirribonucleico. (Alvarez, 2016)

IV.

MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS 

Microscopio



Aceite de inmersión



Licuadora.



Alcohol Industrial (96%)



Agitador Magnético



Agua destilada. (H2O)



Balanza Analítica



Bicarbonato Sódico (NaHCO3)



Mortero



Sal (NaCl)



Gradilla.



Jabón Liquido



Tubos de ensayo



Tomate



Pipeta



Espinaca



Pipetrometro



Cebolla



Vasos de Precipitación



Coladera



Bisturí



Placas Portaobjetos



Gotero

V.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN TAMPÓN 1. Pesar cada uno de los reactivos  1,5gr

NaCl

 5gr

NaHCO3

 120ml

H2O destilada

 5ml

Jabón Liquido

2. Se coloca en un matraz todos los reactivos y se homogeniza utilizando un agitador magnético

PREPARACIÓN DE LOS VEGETALES PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN 1. Triturar los vegetales en la licuadora y filtrar el zumo obtenido, en el caso de espinaca se utilizó un mortero para la extracción del zumo. 2. Se utiliza un colador para eliminar afrecho y solo utilizar el zumo de los vegetales. 3. Tomar 10 ml del zumo del vegetal más 20 ml de la solución tampón mezclamos y luego homogenizamos. 4. Tomamos 5 ml de esta solución y 10 ml de alcohol colocamos en un tubo de ensayo y lo agitamos. EXTRACCIÓN DEL ADN 1. Tomamos una gota del líquido que contiene el ADN y colocamos en el porta objetos 2. Agregamos una gota de aceite de inmersión en el porta objetos y llevamos al microscopio. 3. Centramos la muestra y observamos el ADN obtenido.

VI.

RESULTADOS

ESPINACA En la espinaca el zumo mesclado con la solución tampón tomo una coloración característica del vegetal verde, mezclada con el alcohol se pudo observar de se separó en 3 faces donde la fase del medio es la que se tomó para observar el DNA, ya que el alcohol ayuda a observar mejor el DNA.

CEBOLLA El Zumo de cebolla al mezclarse con la solución tampón tomo una coloración verdosa, tomado la coloración de la solución tampón. En esta reacción pudimos observar claramente la separación del agua, el alcohol y el de ácido desoxirribonucleico

TOMATE En el caso del tomate al reaccionar con el alcohol se produjo una ruptura las membranas celulares provocando una separación de DNA.

VII.

CONCLUSIONES

 El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están escritas las instrucciones que deben seguir las células para construir un organismo y mantenerlo vivo. Todas las células que forman un individuo contienen una copia idéntica de ADN. Su extracción es la base del conocimiento de este y su posible modificación.  Las soluciones buffer empleadas están compuestas por un grupo de reactivos que cumplen funciones específicas para permitir la obtención de la materia vegetal.  El ADN es la huella genética de cada ser vivo, y su extracción, caracterización e identificación es fundamental en múltiples procedimientos, entre ellos la identificación del ADN humano en aplicaciones, médicas, diagnóstico de enfermedades, conocimiento del genoma humano, pruebas de paternidad, investigación criminalística, caracterización de nuevas especies botánicas entre otras.

VIII.

RECOMENDACIONES  Utilizar los instrumentos con la mayor precaución posible para evitar cualquier inconveniente puesto que se está manipulando objetos corto punzantes.  Seguir las indicaciones del profesor guía

IX.

BIBLIOGRAFIA

 MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring 2006.http://www.scienceinschool.org.  GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA fromanything living. En http://learn.genetics.utah.edu  Extracción de ADN. Disponible en:http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/ pagwebciencias/pagweb/la_ciencia_a_tu_alcance_II/quimica/Experiencias_quimica_ext raccion_de_adn.html http://www.monografias.com/trabajos82/solucion-tampon/solucion-tampon.shtml#ixzz4zUfGzgMU  Rocha, P. (2002). Citar un sitio web - Cite This For Me. [online] Geocities.ws. Available at: http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf  Alvarez, M. (2016). Informe laboratorio extraccion de adn. [online] Scribd. Available at: https://es.pdfcoke.com/document/316503565/Informe-laboratorio-extraccion-de-adn [Accessed 27 Nov. 2017].

X.

ANEXOS