Exposicion Adn Recombinante.docx

TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE DIAPOSITIVA 2 Historia: ver diapositiva DIAPOSITIVA 3 La tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar, secuenciar y manipular genes derivados de cualquier tipo de célula. Esta tecnología permite: La creación de nuevas combinaciones de segmentos de ADN que no se encuentran juntas de manera natural Aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. Esta tecnología es útil para: Realizar investigaciones en el estudio de la estructura molecular y su función biológica En la terapia genética se emplea para sustituir o añadir, una copia normal de la región defectuosa del ADN para poder solucionar y restablecer la función alterada En medicina para la producción de proteínas de utilidad medica como la insulina, hormona del crecimiento En la Industria para la creación de animales transgénicos, aumentar la producción, calidad, para la mejora cultivos, creación de insecticidas naturales DIAPOSITIVA 4 La molécula de ADN recombinante es una molécula artificial que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN de diferentes orígenes. Es una molécula formada mediante métodos de laboratorio Para la obtención del ADN recombinante se emplea la técnica de Clonación molecular. Esta técnica consiste en insertar un fragmento de ADN, en un vector que es capaz de replicarse de manera independiente en una célula huésped Para la obtención del ADN recombinante, se requiere elementos esenciales como: enzimas endonucleasas o de restricción, enzima ADN Ligasa y vectores A continuación veamos cada uno de estos elementos, detalladamente: DIAPOSITIVA 5 1 -ENZIMAS ENDONUCLEOSAS O DE RESTRICCIÓN Son enzimas que cortan el ADN sí reconocen una secuencia específica característica de los nucleótidos dentro de la molécula de ADN de entre 4 y 8 pares de bases. El sitio donde cortan el ADN se llama diana de restricción.

Estas enzimas actúan como tijeras moleculares cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfato sin dañar las bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina, timina) Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias Observamos en el cuadro ejemplos de algunas enzimas de restricción, su procedencia y los sitios específicos que reconoce y corta en el ADN: ENZIMA EcoRI HpaI MboI HaeIII TaqI

MICROORGANISMO PROCEDENCIA Escherichia coli Haemophilus parainfluenzae Moraxella bovis Haemophilus aegyptius Thermus aquaticus

SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO GAATTC GTTAAC GATC GGCC TCGA

Estas enzimas de restricción al reconocer la secuencia en el ADN pueden hacer diferentes tipos de corte: Corte de tipo asimétrico Se presenta cuando las enzimas de restricción, cortan la secuencia del ADN en un extremo de manera escalonada y produce extremos llamados cohesivos o complementarios de una sola hebra que pueden unirse por apareamiento complementario de bases (se ensambla como si fuera un rompecabezas) Corte de tipo simétrico: Se presenta cuando las enzimas de restricción, cortan la cadena de ADN de manera semejante dejando los extremos iguales, esto se llama corte con extremos romos. Este tipo de corte es más difícil de unirse porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de ADN en su posición. Veamos algunos ejemplos: DIAPOSITIVA 6 La enzima EcoRi reconoce la secuencia GAATTC Al introducir la enzima EcoRI, esta corta las bases nitrogenadas por el grupo fosfato que une las bases nitrogenadas realizando un corte de tipo asimétrico La enzima Smat reconoce la secuencia CCCGGG Al introducir la enzima Smat, esta corta las bases nitrogenadas por el grupo fosfato realizando un corte simétrico

DIAPOSITIVA 7 Otro elemento para la generación del ADN recombinante es la ADN LIGASA Es una enzima que repara roturas en las hebras del ADN. Es la encargada de unir los extremos de las cadenas de fragmentos de ADN produciendo ADN recombinante DIAPOSITIVA 8 Los vectores son el siguiente elemento para la generación del ADN recombinante Se definen como agentes que transfieren información genética, por algún medio, de un organismo a otro. Son utilizados para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora. Existen varios tipos de vectores, los básicos son los cosmidos, bacteriófagos, PAC, BAC, YAC y plásmidos. Se caracterizan por: NOMBRE DELVECTOR

TAMAÑO DEL FRAG

ORGANISMO

MENTO DE ADN

DONDE SE

QUE SE LE PUEDE

REPLICA

INSERTAR EN KB

DIAPOSITIVA 15

KB: kilobases - mil pares de bases nitrogenadas

DIAPOSITIVA 9 Ahora veamos el proceso de generación del ADN recombinante 1. Supongamos que tenemos dos fragmentos de ADN Un fragmento de un gen que tiene dos lados rodeados por la secuencia de los nucleótidos del ADN GAATTC Otro fragmento de ADN que es un plásmido (que nos sirve de vector) que contiene un sitio con la misma secuencia GAATTC

DIAPOSITIVA 10 2. Como los dos fragmentos contienen la secuencia GAATTC Utilizamos la enzima EcoRI que actúa cortando la doble cadena de ADN del fragmento del GEN, en sus dos lados, y nos produce un fragmento del gen con extremos cohesivos o complementarios EcoRi también actúa cortando la doble cadena de ADN del fragmento del plasmido y nos produce un fragmento del plásmido con extremos cohesivos o complementarios Estos cortes los hace EcoRi a través del esqueleto de fosfato sin dañar las bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina, timina).

DIAPOSITIVA 11 3. Tomamos el fragmento del gen y lo insertamos en el fragmento del plásmido abierto. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por apareamiento complementario de las bases Tiamina (T) y Adenina (A)

DIAPOSITIVA 12 4. Finalmente se utiliza la enzima ADN ligasa que une los fragmentos y se convierten en un solo fragmento de ADN. El gen ya se ha insertado en el plásmido y tenemos una molécula de ADN RECOMBINANTE que para este caso es un Plásmido recombinante

DIAPOSITIVA 13 El plásmido recombinante se coloca en un organismo que pueda sacar copias, para este caso usamos la bacteria E. COLI y aplicamos calor. Lo que ocurre es que algunas bacterias absorben el plásmido y otras no. Todas las bacterias se colocan en una placa que contiene nutrientes y antibióticos, para cultivarlas y que se reproduzcan. Las bacterias que absorbieron el plásmido sobreviven porque este vector tiene un gen de resistencia a los antibióticos. Las bacterias que no absorbieron el plásmido se mueren. Finalmente tenemos muchas copias del gen en las bacterias que sobreviven y que podrán ser utilizados en diversos campos y con diferentes fines