Exercici 1 Fqa

Prova 1

Data límit d’entrega: 29 de març de 2007

Nom i cognoms:________________________________________________________________

Descriu (en un document d’una a tres pàgines de llarg) una aplicació de l’anàlisi química en el camp de la Bioquímica o d’altres ciències relacionades (Biofísica, Biologia Molecular, Genètica, ...). L’exemple pot ser d’altres assignatures o bé cercat a la bibliografia. En la descripció has d’indicar: a) el tipus d’anàlisi química segons: i)

la qüestió formulada (quantitativa, qualitativa, estructural?),

ii) el contingut d’anàlit a la mostra, iii) la quantitat de mostra de què es disposa, i iv) la tècnica analítica emprada (volumetria, cromatografia, electroforesi, absorció molecular, fluorescència molecular ...). b) cadascuna de les etapes de l’anàlisi. En concret, si s’escau, descriviu: i)

l’obtenció de la mostra,

ii) el tractament previ (dissolució en cas de mostres sòlides, dilució en cas de mostres líquides, ... ) de la mostra abans de l’etapa de mesura, iii) els possibles canvis en la forma química de l’anàlit abans de mesurar la propietat d’interès, iv) la eliminació d’interferències (si fos necessària), v) quina propietat analítica (pH, absorbància, fluorescència, potencial elèctric, ...) es mesura, i vi) com es calculen els resultats i si es fa algun tipus de tractament estadístic. c) si s’escau, els equilibris químics que puguin estar relacionats amb qualsevol de les etapes de l’anàlisi. Per exemple: i)

dissolució de la mostra. Aquesta pot ser amb àcids, bases o dilució amb dissolucions reguladores apropiades.

ii) canvis en la forma química de l’anàlit abans de l’etapa de mesura. Per exemple, oxidació o reducció, complexació amb agents complexants apropiats o interaccions amb compostos del tipus bromur d’etidi (dyes), etc.

1

Prova 1

Data límit d’entrega: 29 de març de 2007

A.- Tipus d’anàlisi química La qüestió formulada per respondre a aquesta prova és la determinació de l’infecció d’una persona amb el virus de la immunodeficiència humana (VIH). Per determinar la presència o no d’aquest virus en l’organisme el que es fa és una anàlisi qualitatiu de la presència d’anticossos contra la proteïna p24 (24 kDa) de la càpsida fets per el pacient contra aquest la variant més estesa arreu del món d’aquest retrovirus, el VIH-1. Així doncs, l’analit, en aquest cas es troba pel que fa al contingut en la categoria de traces ja que es tracta de detectar una única proteïna (anticòs contra p24) dins del conjunt de totes les proteïnes que hi ha a la sang, incloses la resta de les altres immunoglobulines. En tractar-se d’una mostra biològica com és la sang en podem obtenir tanta com necessitem però cal destacar que amb un volum molt petit ja és més que suficient, tractant-se d’un microanàlisi (0,1 - 0,01 g). Les tècniques emprades per dur a terme tal determinació són varies però la que s’empra de forma principal i en la qual em centraré en aquesta prova és el test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), tan mateix, per confirmar els resultats positius o també anomenats reactius també es realitza sempre un Western Blot. Tan mateix, també existeixen tècniques alternatives com la PCR (Polymerase Chain Reaction) que es basen en l’ampliació del tot el DNA de la mostra per tal de fer més evident la presencia del DNA del virus en la mostra en el cas que hi sigui. B.- Protocol Per obtenir la mostra el que s’ha de fer és una punció venosa al pacient per tal d’extreure-li una certa quantitat de sang. En primer lloc, el que cal fer abans de tot per preparar la mostra és una centrifugació tal que sedimenti tots els eritròcits i ens permeti quedar-nos només amb el plasma sanguini que és allà on es troben realment les proteïnes de la sang. Per tal de realitzar bé el test es recomana barrejar la mostra amb una dissolució de al 10% de BSA (Albúmina de sèrum boví), 10x PBS (Buffer de fosfat Salí) i Tween 20 (Polisorbat 20). Llavors es fa una dissolució 1:10 en una solució al 10% de Tritó X-100, procurant agitar-la bé amb un vortex per tal d’obtenir un lisat de totes les restes cel·lulars que puguin quedar en la mostra.

2

Prova 1

Data límit d’entrega: 29 de març de 2007

Incubar durant una hora a 37 ºC. Rentar la placa amb solució tampó. Fer dos series de dissolucions de les mostres estandarditzades de l’antigen de p24. Pipetejar 100 μl de les mostres de lisat i de les dissolucions estandarditzades i dipositar-les en cadascun dels pous de la placa. Segellar la placa i incubar-la a 37 ºC durant dos hores o bé a 4 ºC durant tota la nit. Rentar la placa amb la solució tampó. Diluir 8 μl d’anticòs primari (conill anti-p24) en 10,4 ml de dissolvent de l’anticòs primari. Afegir 100 μl de preparació de l’anticòs primari a cadascun dels pous de la placa. Segellar la placa i incubar-la durant una hora a 37 ºC. Rentar la placa amb la solució tampó. Diluir 40 μl de anticòs secundari (cabra anti-conill Ig-Peroxidasa marcada) en 12 ml de dissolvent de l’anticòs secundari. Afegir 100 μl de la dissolució de anticòs secundari a cada pou de la placa. Segellar la placa i incubar a 37 ºC durant una hora. Rentar la placa amb dissolució tampó. Pipetejar 100 μl de substrat de l’enzim unit a l’anticòs secundari i afegir-los a cada pou. Segellar la placa i incubar durant 30 minuts a temperatura ambient. Afegir 100 μl de solució aturant de la reacció de l’enzim, aquest consisteix bàsicament en una dissolució 4N de H2SO4. Llegir la placa a 450 nm i 650 nm com a referència. C.La mostra sempre es dissol en solucions amortidores de pH pròxim a 7, de força iònica molt controlada i de composició complexa de sals ja que es tracta de sals no tòxiques com el PBS. En aquest protocol no cal fer canvis en el analit ja que qualsevol canvi en l’estructura de la proteïna alteraria l’epítop de l’antigen reconegut per l’anticòs o els dominis d’interacció de les cadenes llargues de l’anticòs. Per tant, cal mantenir la mostra sempre en unes condicions que siguin el mínim de desnaturalitzants, és a dir, amb pH, temperatura, força iònica ... similars a les fisiològiques. Protocol extret de: http://ubik.microbiol.washington.edu/protocols/bl3/p24elisa.htm

3