Erhan's Taxol Project-2007

PACLITAXEL (TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ

Dr. Erhan

Süleymanoğlu

Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hipodrom, 06330-Ankara

ANKARA 2007

97

İÇİNDEKİLER Proje Özet Bilgi Formu…………………………………………………………………………………….1 Proje ile ilgili Genel Hususlar……………………………………………………………………………3 Motivasyon ve Ankara’da Bulunan Araştırma Olanakları…………………………………….4 1. Giriş……………………………………………………………………………………………………..7 1.1. Kanser……………………………………………………………………………………….…….7 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6.

Kanserin Tedavi Şemaları……………………………………………………………………………8 Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri…………………………………………………………..8 Kemoterapinin Prensipleri…………………………………………………………………………..9 Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri…………………………….19 Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü………………………………………………22 Gen Tedavisi ve Gen Nakli………………………………………………………………………….24 DNA Kompaktizasyonu ve Nanoparçacık Oluşumunu Meydana Getiren Bileşenler………………………………………………………………………..33 1.3. Taxol® (Paclitaxel)…………………………………………………….……………………………….43 1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®‘un Rolü…………………….43 1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı……………………………………………..…..46 1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması……………………………………………………………………….54 1.3.5. Projemin Bilimsel Dayanağı………………………………………………………………………..58 1.3.6. Literatür Özeti…………………………………………………………………………………………...60 2. Gereç ve Yöntem..………………………………………………………………………………………….61 2.1. Hücre Membranın Yapısı…………………………………………………………………………………61 2.1.1. Biyomembranların İçeriği……………………………………………………………………………..61 2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri………………………………………………….66 2.2.1. Lipid Çift Katman…………………………………………………………………………………………66 2.2.2. Membranın Fizikokmyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler…………………………….67 2.2.3. Lipid Fazlarını Etkileyen Faktörler ve Biyosistemlerdeki Önemi……………………….70 2.2.4. İlâçların Biyomembran Akışkanlığı Üzerine Etkisi…………………………………………..71 2.2.5. Biyomembran Akışkanlığının Anlamı……………………………………………………………..73 2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında Kullanılan Başlıca Yöntemler……………………………………………………………………………..80 2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler……………………………………………………………………………………81 2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler……………………………………………………………………………..81 2.3.1.2. Difference Spectroscopy………………………………………………………………………………84 2.3.1.3. Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi………………………………………84 2.3.1.4. Raman Spektroskopisi………………………………………………………………………………..85 2.4. Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi…………………………………………………………….85 2.4.1. Yüzeysel Gerilimin Wilhelmy Plate Yöntemiyle Ölçülmesi…………………………………87 2.4.2. Lipid Tek Katmanların Özelliklerinin İzoterm Yöntemiyle İncelenmesi……………..88 2.4.3. Sub-fazda Madde-Lipid Etkileşmelerinin İncelenmesi ve Lipid Moleküllerinin İşgal Etileri Alanın Ölçülmesi……………………………………………..88 2.4.4. Tek Katmanda Yer Alan Maddeler Arasındaki Etkileşmelerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………….89 2.4.5. Tek Katmanlarda Maddelerin Karışım Oluşturma Özelliklerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………………90 2.4.6. Tek Katmanlarda Bulunan Moleküllerin Yapısal Değişikliklerinin İncelenmesi……………………………………………………………………………..91 2.4.7. Tek Katmanın Sabitlilik ve Deformasyon Özelliklerinin Hesaplanması……………….92 2.4.8. İzoterm Şekillerinin Analizi ve Yorumlanması…………………………………………………92 2.4.9. Projemdeki Deneysel Tasarım………………………………………………………………………..93 2.4.10. Projemde Geliştirilen Yeni Deneysel Protokol………………………………………………..93 2.4.10.1. Kimyasallar………………………………………………………………………………………………93

98

2.4.10.2. Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması………………………………………..94 2.4.10.3. Yüzey Basınç-alan (π-A) İzotermler…………………………………………………………….97 2.4.10.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri…………………………………………………….95 2.4.10.5. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi……………………………………..95 3. Bulgular……………………………………………………………………………………………………………..97 3.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………..98 3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri……………………………………………………112 3.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri………………………………………………………..119 4. Tartışma…………………………………………………………………………………………………………..163 4.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………163 4.2. DSC Ölçümleri……………………………………………………………………………………………….173 4.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri……………………………………………………….175 4.3.1. Bu Projede Yapılan Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümlerinin Daha Önce Başka Bir Cihazla Yaptığım Ölçümlerle Kıyaslanması…………………………177 4.4. Taxol®-Fosfolipid Membran Arasında Oluşan Yapı……………………………………………186 4.5. Biyoteknolojik Boyut……………………………………………………………………………………….187 4.6. Hücresel ve Moleküler Biyolojik Boyut……………………………………………………………..192 4.7. Projemde Geliştirilen Tasarımın Diğer Analitik Uygulamalardaki Yeri………………..202 4.7.1. İlâç Ligandlarıın Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom Kromatografisinin Geliştirilmesi………………………………………….202 4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak Çalışmalar……………………..207 4.7.3. Öncü Hipotez………………………………………………………………………………………………209 4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim…………………………………………….213 5. Sonuç……………………………………………………………………………………………………………….216 Eklerα…………………………………………………………………………………………………………………217

α

Birçok Ek belge niteliğinde olduğundan bunlara sayfa numarası verilmemiştir.

99

PROJE ÖZET BİLGİ FORMU Proje Kodu: 02/2005-15 Proje Başlığı: PACLITAXEL

(TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ

MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ

Proje Yürütücüsü ve Yardımcı Araştırmacılar: Dr. Erhan

Süleymanoğlu

Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Gazi Üniversitesi,

Eczacılık

Fakültesi, Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hipodrom, 06330-Ankara

Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi: Gazi Üniversitesi,

Bilimsel

Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığı

Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri: Ekim-2005-Ekim-2007 Türkçe Özet: Bu çalışmada, kemoterapide yoğun olarak kullanılan Taxol® (Paclitaxel) ile farklı zincir yapılarına ve elektrostatik özelliklerine sahip fosfolipidler arasında oluşan moleküler etkileşmeler Langmuir-Blodgett tek katman, FTIR ve DSC ölçümleriyle incelenmiştir. Sınır yüzeylerde oluşturulan lipid tek katman ve lipid veziküllerinde (lipozom) yer alan lipid çift katmanlar model hücre zarları olarak uygulanmıştır. Neticeler, Taxol® konsantrasyonuna, pH, T°C, tampon sistemine, hidrofobik ve elektrostatik ortama bağlı olarak açıklanmıştır. İlâç ile farklı fosfolipid molekülleri arasındaki etkileşmelerinin sonucu olarak meydana gelen “self-assembly” agregatlarının sekonder yapısal değişiklikleri FTIR spektroskopisi ile incelenmiştir. Elde edilen veriler, karbonil, fosfat, kolin ve CH2 gruplar seviyesinde değerlendirilmiştir. Tek katmanda meydana gelen ilâç-fosfolipid etkileşmeleri ara yüzeydeki lipidlerin moleküler alanlarına bağımlılık göstermektedir. Taxol®’un, fosfatidilkolin türü zwitteriyonik lipidler ile termodinamik olarak sabit yapılar oluşturduğu DSC ölçümleri ile ortaya çıkarılmıştır. Tek katmanda oluşan söz konusu yapıları Brewster Angle (BAM), atomik kuvvet (AFM), floresan ve Raman mikroskopi yöntemleriyle de görüntülemeyi ümit ediyoruz. Bu farmasötik nanoformülasyonlarının in vivo

100

ortamda hücre zarı akışkanlığı üzerindeki muhtemel etki mekanizması ile ilgili yeni bir hipotez de sunulmuştur. Bu çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Daire Başkanlığı tarafından İngilizce Özet: Abstract: Introduction: The current study reports our last results of recent project on the role of biomembranes in cancer therapeutics. Aim: The objective is to emphasize their relevant physicochemical features in depicting molecular mechanisms of action of antineoplastic agents with further implications in drug design. Methods: Langmuir-Blodgett monolayers were used to simulate lipid surface of cell membranes of both normal and cancer cells trying to approach surface forces governing molecular interactions between various phospholipids and Paclitaxel (Taxol®)a widely used anticancer drug. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy was applied for following subsequent changes in lipids after drug recognition trying to relate this to its fluidizing effect. This was further studied by Differential Scanning Calorimetric (DSC) measurements, which showed further thermodynamic characteristics of drug-lipid interaction. Results and Discussion: Biophysical analysis showed that miscible drug-lipid complexes form at air/water interface, followed by instability of the monolayer due to their interaction. Spectroscopic and thermodynaic measurements showed the phase separation, the extend of liquid-condensed phases, as well as microdomain formation in monolayers. We are also trying to apply Atomic Force Microscopy (AFM), BrewsterAngle Microscopy (BAM) and Raman Microscopy to extend our previously proposed model of the role of phospholipid specificity of Taxol® and its cellular effects. Relevant physicochemical reasoning and models will be presented in more detail.

Acknowledgements: This work was supported by Gazi University Research Fund (Project No: 02/2005-15). Anahtar Kelimeler: Paclitaxel (Taxol®), Model ve Biyomembranlar, Tümör Hücre Zarı Akışkanlığı, Langmuir-Blodgett Tekkatman, İlâç-fosfolipid etkileşmeleri. Projeden Kaynaklanan Yayınlar: 2

makale ve 4 poster sunumunun

yapılması plânlanmıştır. Tüm bunlar hazırlanma aşamasındadır.

Bilim Dalı: İnterdisipliner Doçentlik B. Dalı Kodu: Yok

G. Ü. Akademik Yükseltilme ve Atanma Ölçütlerine göre puan durumum: 835

101

Proje ile ilgili genel hususlar. İlâçlarla organizma arasındaki oluşan karmaşık tepkimeler ve yolaklar hücresel ve moleküler düzeyde yapılan incelemelerinin önemini artırmıştır. Hücre ile ilâçlar arasında ilk temas noktası biyolojik lipid zarlardır. Bu bağlamda, çeşitli ilâçhücre etkileşmelerindeki lipid zarların rolü küçümsenemez ve bunlarla ilgili elde edilen veriler son derece önemlidir. Bu verilere dayanarak çeşitli ilâçların etki mekanizmalarının daha iyi anlaşılması sağlanmaktadır.

Günümüzde kullanılan

birçok farmasötik formülasyon amfifilik veya katamfifiliktir ve bu özellikler sayesinde biyolojik zarlarla tepkimelere girmektedirler. Çeşitli antibiyotiklererin, anti-enflamatuarların ve anestetiklerin model ve biyolojik membranlar üzerinde etkileri uzun yıllar önce araştırmacıların dikkatini çekmiş ve ayrıntılı olarak farklı düzeneklerde incelenmiştir. Bu araştırmalar sayesinde, örneğin anestetiklerin etki mekanizması ile ilgili, halâ geçerliliğini yitirmemiş lipid teoriler ortaya atılmıştır1 ve birçok farmakodinamik modeller bu teorilerine dayanmaktadır. Söz konusu modeller farklı ilâçların etki mekanizmalarına da uyarlanmaya çalıştırmıştır. Diğer yandan, normal hücre ile kanser hücrenin akışkanlığında önemli farklılıklar ortaya çıkarılmıştır ve bu buluşlar anti-kanser ilâçların membran üzerinden çalışan bileşenler olarak algılanması gerektiği konusunu da gündeme getirmiştir. Sunduğum bu projede de, kemoterapilerde yoğun olarak kullanılan Taxol (Paclitaxel) ile kanser hücreyi2 modelleyen çeşitli membran modelleri arasında oluşan etkileşmeler ele alınmıştır. Projemin iki boyutu vurgulanmıştır. Bunlardan ilki biyoteknolojik boyut olup, çeşitli lipidlere dayalı kontrollü salınım sistemlerdeki Taxol-fosfolipid komplekslerinin oluşumu üzerine durmaktadır. Günümüzde kullanılan birçok çok halkalı (heterosiklik) farmasötik formülasyonların hidrofobik özelliklerinden dolayı çözünürlülük sorunu ortaya çıkmıştır ve bunların biyolojik Bu öncü teoriler için Bk.: Trudell JR. A unitary theory of anesthesia based on lateral phase separations in nerve membranes. Anesthesiology. 1977 Jan;46(1):5-10. Seelig A, Allegrini PR, Seelig J. Partitioning of local anesthetics into membranes: surface charge effects monitored by the phospholipid head-group.Biochim Biophys Acta. 1988 Apr 7;939(2):267-76. Suezaki Y, Tatara T, Kaminoh Y, Kamaya H, Ueda I. A solid-solution theory of anesthetic interaction with lipid membranes: temperature span of the main phase transition. Biochim Biophys Acta. 1990 Nov 2;1029(1):143-8; Jibu M. Theory of cell membrane organizers and pressure reversal of anesthesia. Med Hypotheses. 2001, Jan;56(1):26-32. 2 Kanser hücre yüzeyini (cancer cell surface) olarak ifade edilmesi çok daha doğru olacaktır. 1

102

sıvılarda uygulama etkinliğini olumsuz etkilemektedir. Bu yüzden, çözünürlülük sorununu bazı kontrollü salınım sistemleri ile çözmeye çalışılmaktadır. Ancak, bunun için ilâç-lipid kompleks oluşumunun ön incelemesi gerekmektedir ve bu önemli konu projemde de ele alınıp değerlendirilmiştir. Bu tür fizikokimyasal verilere dayanarak daha sonraki ilâç geliştirme aşamalarında yeni, tedavi potansiyeli ve özellikleri iyileştirilmiş anti-kanser formülasyonlarının geliştirilmesini mümkün kılmaktadır. Projemin ikinci boyutu ise bu anti-neoplastik ajanın hücre seviyesindeki etki mekanizması ile ilgilenmekte ve böylece daha fundamental moleküler biyolojik vurguları içermektedir. Örneğin, günümüzde geçerli olan depolimerizasyona karşı hücre mikrotübüllerin stabilizasyonunu sağladığı mekanizması3, Taxol‘un tüm moleküler düzeyde gösterdiği etkileri açıklamak için yeterli değildir. Örneğin, bir membran proteini olan ve kemoterapiye direnç mekanizmalarının ortaya çıkmasında sorunlu olan P-glikoprotein (P-gp) tam olarak nasıl çalıştığını ve etki ettiğini anlayabilmek için, çeşitli anti-neoplastik ilâçların bu gibi ortamda nasıl davrandıkları konusunun önemini artırmaktadır. Başka bir deyişle, moleküler düzeyde herhangi bir anti-kanser terapinin geliştirilmesi için bu ilâçlarla kanser hücre membranları arasında oluşan etkileşmelerinin ortaya çıkarılmasını gerektirmektedir. Bu bağlamda, Taxol ile fosfolipidler arasındaki moleküler bağlar, güçler ve etkileşmeler vurgulanmıştır. Bu olayların daha iyi anlaşılması amacıyla ilk önce bu projemin kesin raporunda geniş bir giriş bölümüne yer verilmiştir. Söz konusu bu bölüm, projemi inceleyecek olanlara yukarıda bahsedilen bu 2 ayrı boyutu da daha iyi algılayabilmelerini sağlayacaktır. Motivasyon ve Ankara’da bulunan araştırma olanakları. Sunduğum projede, özellikle nanoteknolojik boyut vurgulanmıştır. Bunun için de çok sağlam dayanaklarım ve ciddi sebeplerim vardı. Her şeyden önce, arzu ettiğim cihazların yerine Ankara’da mevcut olan imkânları ve üniversitemizin çok kısıtlı proje bütçesini göz önünde bulundurarak proje konusunu kararlaştırdım. Bu bağlamda, Fakültemizde çok yetersiz bir altyapı ortamında ve tek başıma yürütebileceğim bir projeyi tasarladım4. Sonuç olarak, bu proje sayesinde nanoteknolojinin temellerini

Taxol‘un etki mekanizmasına aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak yer verilmiştir. Fakültemizde göreve başlar başlamaz daha 04 Şubat 2004 tarihinde yapılan bir Fakülte toplantısında yönetim tarafından benden ve diğer 2 uzman arkadaşımızdan tek başımıza proje çalışması çıkarmamız istenmiştir. Bu toplantıda ayrıca Üniversitemizin herhangi bir uluslararası boyutu olmadığı ve ulusal sıralamada bile yeri 3 4

103

oluşturan “self-assembly” olarak meydana getirilen biyomakromolekül komplekslerin araştırıldığı ve fizikte, kimyada, malzeme biliminde, tıpta ve biyonanoteknolojide uygulama potansiyeli olan orijinal bir cihaz Fakültemize alınmıştır. Bunun için de ulusal

yükseköğretim

stratejileri

(Bk.:

http://www.yok.gov.tr/duyuru/strateji_gorus.htm) ve üniversitemizin strateji plan geliştirme programı (http://www.strateji.gazi.edu.tr/) esas alınmıştır. Projemdeki bu vurgu uluslararası proje destek programlarına katılmamız bakımından da önemlidir, çünkü Avrupa Birliği’nin gerek 6cı, gerekse 7ci çerçeve programlarında öncelikli konu başlıklarına önem verileceği ayrıca vurgulanmaktadır (Bk.: www.fp7.org.tr). Söz konusu başlıklar arasında genom bilimler ve nanoteknolojiler başı çekmektedir ( Bk.: cordis.europa.eu/fp7/home_en.html;http://www.innovation.public.lu/servlet/front). Ancak bu proje destek programlarına Türkiye’den çok az sayıda proje gönderilmiştir. Bu arada, ülkemizde de ulusal nanoteknoloji stratejileri geliştirilmiştir5. Bu tür nanoteknoloji çalışmaları da en ileri düzeyde Ankara’da yapılmaktadır. Bunun için de gereken altyapıyı ve AR-GE olanakları kurulmuştur. Örneğin, O. D. T. Ü.’inde birkaç seneden bu yana Nanoteknoloji Merkezi faaliyet göstermektedir. Ayrıca, aynı üniversite Avrupa Birliği kaynaklarından 1.5 milyon EU’luk subvansiyon sayesinde Merkez Laboratuvaru kurmuştur (Bk.: www.centrallab.metu.edu.tr). Bu Merkez Laboratuvarın Ocak-2006 tarihinde kurulmuş olup, asıl amacı üniversitelere ve sanayi kuruluşlarına bilimsel destek ve yürütülmekte olan projelerde öçlüm olanakları sağlamaktır. Avrupa Birliğinden akreditasyon alan tek kuruluş O. D. T. Ü. Merkez Laboratuvarıdır. Bu projemin ön ölçüm kısmını oluşturan FTIR ve DSC ölçümlerini bu laboratuvarda yaptım. Bunun dışında, Bilkent Üniversitesinde Devlet Plânlama Teşkilâtından alınan 25 Milyon Dolarlık proje ile büyük bir alana yayılmış Ulusal Nanoteknoloji Merkezi (Bk.: www.nano.bilkent.edu.tr) kurulmuştur ve bunun da 2 yıla kadar tamamlanması beklenilmektedir. nanoteknolojik

Hacettepe projenin

(www.biyomedtek.com).

Üniversitesi

yürütüldüğü Yakın

bir

Beytepe

kampüsünde

BİYOMEDTEK tarihte

de,

Merkezi Teknopark

de

birçok

kurulmuştur açılacaktır

(www.teknopark.hacettepe.edu.tr). Buna paralel olarak, Ankara Üniversitesi 5 sene önce Devlet Plânlama Teşkilâtından almış olduğu 8 Milyon Dolarlık proje desteği ile istenilen düzeyde olmadığı (bunun için bk.: Ek-1 ve Ek-2) ve Fakültemizde cihazların son derece demode ve eski olduğu gerekçe gösterilerek tarafımdan orijinal proje çıkarmam rica edilmiştir. 5 Bk.: Ek-3.

104

Biyoteknoloji Enstitüsü kurmuştur. Daha sonra, bu enstitüye bağlı Merkez Laboratuarı da kurulmuştur (Bk.: http://www.biotek.ankara.edu.tr/). Görüldüğü gibi, Ankara’da bulunan diğer üniversitelerde bu tür büyük yatırımlar yapılırken üniversitemizde bu ölçekte henüz daha herhangi bir girişim olmamıştır. Ancak, son yıllarda üniversitemizde de büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Şöyle ki, Yarıiletken Araştırma Merkezine bağlı bir Nano-Club faaliyete başlamıştır. Ancak, bu birimin biyonanoteknolojiye hitap etmemektedir, daha ziyade mühendislik bilimleriyle ilgilenmektedir. Ancak, bunun dışında, yakında çok önemli olan Ulusal Nanotıp Konsorsiyumu üniversitemizde kurulmuştur (Yarıntılı bilgi için Bk: Ek-4) ki, bu çok isabetli bir gelişmedir. Üniversitemizin6 Teknoparkı da tamamlandığında uluslararası düzeyde nanoteknolojik araştırmaların yapılabileceği ümit edilmektedir. Ancak, bu tür merkezleri diğer araştırma merkezlerle yarışabilir düzeyde tutabilmek

için

büyük

ölçekli,

sürekli ve

uzun vadeli

projeler

çıkarmak

gerekmektedir. Projemi de bu amaçla sundum. Şimdiye kadar Fakültemizde herhangi bir nanoteknoloji başlıklı proje çıkarılmadığı gibi laboratuvar donanımı da son derece yetersizdir. Projemi de bu iki hususu göz önünde bulundurarak yazdım. Bu doğrultuda, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje teklifi sunulmuştur. Tüm zorluklara rağmen, projemi tamamlamış bulunmaktayım. Ancak, bu aşamadan sonra bunun devamı da gelmelidir. Bu yüzden daha şimdiden ulusal ve uluslararası proje destekleme kuruşlarına çok daha kapsamlı bir projemi daha sunmak üzereyim (Bk.: Ek-16).

6

Üniversitemizin büyük çabaları ve girişimleri sayesinde ayrıca Ulusal Kızılötesi ve Sinhrotron Araştırma Merkezi de kurulma aşamasındadır.

105

1. Giriş. 1.1.

Kanser7.

Kanser terimi ile, bu projemin kesin raporunun kapsamına ve amacına uygun olarak hücresel büyümedeki düzenleme mekanizmalarında meydana gelen önemli hasarlar gösteren birçok hastalık kastedilmektedir. Bu konu son derece hızlı geliştiğinden ve çok geniş olduğundan, kanser ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için aşağıdaki dipnotta vermiş olduğum geniş ve güncel kaynakçaya başvurulmalıdır. Tarihsel olarak, kanser araştırmaları bir hayli deskriptiv olmuştur. Başka bir deyişle, birçok araştırmacı normal hücrelerle onkogenik hücreler arasında gözledikleri farklılıkları kataloglaştırmışlardır. Uzun yıllar boyunca hastalığın etkileri nedenlerinden çok daha iyi incelenmiştir. Son yıllarda, birkaç kanser türü üzerinde moleküler düzeyde yapılan araştırmalar sayesinde metastaz oluşum mekanizmaları, tümörlerin bağışıklık sisteminden tanınmaları ve yok edilmeleri gibi çok önemli olan konular bağlamında, tümör hücrelerinin bazı özelliklerinin anlaşılmasını mümkün kılmıştır. Tümör

hücreleri

intraselüler

(hücre

içi)

haberleşme

(intracellular

communication) mekanizmalarında birtakım hasarları içerdiklerinden, bunların patolojik davranışlarındaki plazma membranının8 da muhtemel rol oynayabileceği tahmin edilmektedir (Petty, H. R., 1993). Gerçekten de, projemde anti-neoplastik ilâçların biyoteknolojik uygulamaları dışında, tümör hücre membran akışkanlığı Bu bölümle ilgili daha ayrıntılı bilgiler için özellikle bk.: 1. Advances in Molecular Oncology (Advances in Experimental Medicine and Biology) (Advances in Experimental Medicine and Biology), by Fabrizio d'Adda di Fagagna (Editor), Susanna Chiocca (Editor), Fraser McBlane (Editor), Ugo Cavallaro (Editor); Springer; 1 edition (July 12, 2007). 2. Targeted Molecular Imaging in Oncology, by E. Edmund Kim and David J. Yang (Editors), Springer; 1 edition (January 15, 2001). 3. Principles of Molecular Oncology, by Miguel H. Bronchud, MaryAnn Foote, Giuseppe Giaccone, Olufunmilayo I. Olopade, Paul Workman (Editors), Humana Press; 3rd ed. edition (November 30, 2007). 4. The Molecular Biology of Cancer, by Michael Khan, Stella Pelengaris (Editors), WileyBlackwell; 1 edition (February 28, 2006). 5. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics,by Lauren Pecorino, Oxford University Press, USA; 1 edition (May 21, 2005). 6. F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York. 7. The Biology of Cancer, by Robert A. Weinberg, Garland Science; 1 edition (June 9, 2006). 8 Projemin de hücresel boyutu söz konusu model normal ve tümör plazma membran (zar) akışkanlığı üzerinde odaklanmaktadır. Bunun için özgün bir de öncü hipotez geliştirilmiştir. Daha ayrıntılı bilgiler için bu proje kesin raporumun yorumlar bölümünde yer almaktadır. 7

106

üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Onkogenler ve kansere yol açan genlerin ürünleri ligandlar, reseptörler ve sitozolik sinyalleşme aygıtlar gibi normal büyümeyi sağlayan transmembran sinyal iletim elemanlarının farklı şekillerinden ibarettir. Bu gen ürünleri, sinyal iletiminin şu ana kadar geliştirilmiş en iyi, ancak henüz daha yetersiz olan modelini teşkil etmektedir. Bazı tümör hücrelerin membran taşıyıcıları bunları kemoterapötik ilâçlara karşı korumaktadır. Adherence-promoting membran proteinlerinin yetersiz ekspresyonu metastaza yol açmaktadır (Petty, H. R., 1993).

Tümör antijenlerinin intraselüler aktarımları ve bunu takiben plazma

membranlardaki ekspresyonları immün sistem trafından indüklenen destrüksyonu ortaya çıkarmaktadır (Petty, H. R., 1993; Cereijido M, et al., 2007; Chidgey M, Dawson C., 2007; Ma DW., 2007; Song RX., 2007; Baritaki S. et al., 2007)9. Bu konu, projemin yorum bölümünde ölçümlerden elde edilen neticeler doğrultusunda tekrar ele alınmıştır. 1.2.

Kanserin Tedavi Şemaları.

1.2.1. Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri Büyüme mekanizmalarının da kontrolden çıkmasını takiben muhtemel olarak tek hücreden veya birkaç hücreden ortaya çıkan malign tümör genel olarak heterojen tümör popülasyonundan ibarettir. Bu hücreler daha sonra komşu dokulara göç ederek bunların da malign tarnsformasyonuna neden olup, kendi vaskülatürünü geliştirip lenfatik ve hematolojik dağılım göstermek suretiyle metastazlara neden olmaktadır. Metastaz olan hastalarda kanserin bir sistemik hastalık olarak ele alınması gerektiği ve cerrahi veya radyoterapi gibi konvansyonel yaklaşımların yetersiz olacağı açıktır. Bu bağlamda, günümüzde kanser hastaların bakımı cerrahi, radyoterapi ve sistemik tedavilerini de içeren multidisipliner bir yaklaşımı gerektirir (Sliifer S ve Stoter G. , 2005).

Bk. özellikle: Chapter 9: Membranes in Cancer, In: Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes-Structure and Function, Plenum Pres, New York and London, 1993, pp. 353-377; Cereijido M, Contreras RG, Flores-Benítez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz A, Shoshani L. New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med Res. 2007 Jul;38(5):465-78; Chidgey M, Dawson C. Desmosomes: a role in cancer? Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1783-7; Ma DW. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007, Jun;32(3):341-50; Baritaki S, Apostolakis S, Kanellou P, Dimanche-Boitrel MT, Spandidos DA, Bonavida B. Reversal of tumor resistance to apoptotic stimuli by alteration of membrane fluidity: therapeutic implications. Adv Cancer Res. 2007;98:149-90 ve Song RX. Membrane-initiated steroid signaling action of estrogen and breast cancer. Semin Reprod Med. 2007 May;25(3):187-97. 9

107

Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer S ve Stoter G., 2005)10. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi, farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı toksisitelerinin de önemi artmıştır. 1.2.2.

Kemoterapinin Prensipleri.

Kemoterapötik ilâçların önemli bir özelliği hızlı bölünen hücrelere hasar vererek hücre ölümüne yol açmalarıdır. Hücre hasarı farklı etki mekanizmalarına sahip birkaç tür sitotoksik ilâçlar tarafından meydana getirilir (Bk.: Tablo-1 ve Şekil 1.1)11.

10

Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514. 11 Projem güncel olan ve çok yoğun olarak kullanılan Taxol® ile ilgilidir. Ancak kemoterapilerde kullanılan birçok antikanser ilâcı daha mevcuttur. Tüm bunlarla ilgili okuyuculara daha ayrıntılı bilgi vermek amacıyla bu kesin raporumun sonunda Ek-14 verilmiştir.

108

Tablo-1: Bazı sitotoksik ilâçlar.

(Kaynak: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

109

Şekil 1.1. Bazı popüler anti-kanser ilâçların etki mekanizmaları (Bk.: www.chemotherapy.com; Ayrıca bk.: Danimarka Kraliyet Kanser Araştırmaları Enstitüsü- www.cancer.dk)12.

12

Kemoterapinin hücresel boyutu ile ilgili aşağıdaki kaynaklara başvurulmalıdır: 1. Gossage L, Madhusudan S., Cancer pharmacogenomics: role of DNA repair genetic polymorphisms in individualizing cancer therapy. Mol Diagn Ther. 2007;11(6):361-80. 2. Mandal S, Varma K, Jain S., Cutaneous manifestations in non-Hodgkin's lymphoma. Acta Cytol. 2007 Nov-Dec;51(6):853-9. 3. Hamm C, Verma S, Petrella T, Bak K, Charette M; On behalf of the Melanoma Disease Site Group of Cancer Care Ontario’s Program in Evidence-based Care. Biochemotherapy for the treatment of metastatic malignant melanoma: A systematic review. Cancer Treat Rev. 2007. 4. Cordes N, Park CC., β1 integrin as a molecular therapeutic target. Int J Radiat Biol. 2007;83(11):753-760. 5. Nicolson GL, Conklin KA. Reversing mitochondrial dysfunction, fatigue and the adverse effects of chemotherapy of metastatic disease by molecular replacement therapy. Clin Exp Metastasis. 2007 Dec 5. 6. Korbelik J, Cardeno M, Matisic JP, Carraro AC, MacAulay C., Cytology microarrays. Cell Oncol. 2007;29(5):435-42. 7. Cellular Oncology, Mol Diagn Ther. ve Cancer dergileri son derece faydalı bilgiler içermektedir. 8. Vattemi E, Claudio PP. Tumor suppressor genes as cancer therapeutics. Drug News Perspect. 2007 Oct;20(8):511-20. 9. Xi Y, Edwards JR, Ju J. Investigation of miRNA Biology by Bioinformatic Tools and Impact of miRNAs in Colorectal Cancer-Regulatory Relationship of c-Myc and p53 with miRNAs. Cancer Inform. 2007;3:245-253. 10. Hoskin DW, Ramamoorthy A., Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 22. 11. Cuzick J, Cafferty FH, Edwards R, Møller H, Duffy SW. Surrogate endpoints for cancer screening trials: general principles and an illustration using the UK Flexible Sigmoidoscopy Screening Trial. J Med Screen. 2007;14(4):178-85. 12. Singh VK, Jia Z. Targeting synuclein-gamma to counteract drug resistance in cancer. Expert Opin Ther Targets. 2008 Jan;12(1):59-68.

110

Söz konusu sitotoksil ajanların bu hücre hasarını hangi boyutta ve şiddette meydana getirdikleri ise genel olarak hücresel ve farmakolojik özelliklere bağlıdır. Sitotoksik tedaviye karşı bazı tümörlerin duyarlılığını etkileyen faktörler arasında şunlar sıralanabilir: -

Hücre döngüsü zamanı ve “doubling time”.

-

Büyüme fraksiyonu

-

Sitotoksik ilâçlara karşı duyarlılık

-

Tümör heterojenliği.

Bir ilâcın anti-tümör etkinliğini tayin eden farmakolojik özellikler ise şunlardır: -

İlâç konsantrasyonu

-

İlâca maruziyet zamanı.

Başlangıçta, kemoterapinin tümör hücrelerini nasıl etkilediği konusunda lösemi L1210 deneysel sıçan (murine) modeli kullanılarak önemli veriler elde edilmiştir (Skipper H. E., 1979). Bu modele göre, bir tümör eksponensiyel olarak sabit bir “doubling time” ile ilerler ve yarı logaritmik kağıt üzerine büyüme hızı çizildiğinde Şekil 1.2-(A)’daki eğriyi oluşturur.

13. Johansson Swartling F. Identifying candidate genes involved in brain tumor formation. Ups J Med Sci. 2008;113(1):32-71. 14. Cheng HY, Obrietan K. Revealing a Role of MicroRNAs in the Regulation of the Biological Clock. Cell Cycle. 2007 Oct 1;6(24). 15. Lo AS, Zhu Q, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) and their therapeutic potential. Handb Exp Pharmacol. 2008;(181):343-73. 16. Namiki M, Ueno S, Kitagawa Y, Konaka H, Mizokami A, Koh E, Fukagai T. Hormonal therapy. Int J Clin Oncol. 2007 Dec;12(6):427-32. 17. Keeble JA, Gilmore AP. Apoptosis commitment--translating survival signals into decisions on mitochondria. Cell Res. 2007 Dec;17(12):976-84. 18. Tejpar S. The use of molecular markers in the diagnosis and treatment of colorectal cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2007;21(6):1071-87. 19. McGrogan BT, Gilmartin B, Carney DN, McCann A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 12. 20. Jacob K, Sollier C, Jabado N. Circulating tumor cells: detection, molecular profiling and future prospects. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):741-56. 21. Kischel P, Waltregny D, Castronovo V. Identification of accessible human cancer biomarkers using ex vivo chemical proteomic strategies. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):727-39.

111

Şekil 1.2. (A): Yarı logaritmik kağıt üzerine çizilmiş eksponensiyel tümör büyüme kinetiği. (B): Bu şekilde büyüyen bir tümörün antineoplastik ilâçla muamelesi. Ok işaretleri ilâcın uygulanma sıklığını göstermektedir (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

Şekil 1.2.’de, tümörlerin beli bir yüzdeliğinin öldürüldüğünü göstermektedir ve bu olay “fractional cell killing” olarak adlandırılır. Bu şekilde, ilâç konsantrasyonunun yükseltilmesi öldürülen tümörlerin yüzdeliğini de etkilemektedir. Bu modele göre, öldürülen

hücrelerin

oranı

tümör

hücrelerin

toplam

sayısına

bağımlılık

göstermektedir. Bu modele göre, ilâç uygulaması yeterli miktarda ve sıklıkta yapıldığı takdirde, bir tümörü tamamen yok etmek mümkündür. Ancak, daha sonra, bu model, hastalar için pek uygun olmadığı ortaya çıkmıştır (Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). Sitostatik ilâçların genelde hızla bölünen hücreler fraksiyonuna karşı çok etkili olduklarından, tümör hücrelerinin önemli bir bölümü etkilenmeyecektir. Prensip olarak, tümör hücre büyüme faktörlerinin uygulanması

112

tümör hücre bölünmesini de artıracaktır ki, bu olaya “recruitment” veya “priming of tumor cells” adı verilmektedir. L1210 modeli ile katı tümörler arasındaki ikinci önemli fark ise büyüme fraksyonu ile “doubling time” arasındaki ilişki sabit olmadığı ve tümör büyüklüğüne göre farklılaştığı gözleminden ileri gelmektedir. İlk başta, bir tümör L1210 modelinde olduğu gibi eksponensiyel büyüme hızı gösterir.

Ancak,

daha

sonra,

tümörün

büyüklüğü

artığında

henüz

daha

açıklanamayan nedenlerden dolayı büyüme hızı durur. Büyüme hızı ile zaman arasındaki bu tür ilişki, Gompertz tipi olarak da adlandırırılan sigmoidal eğri ile ifade edilmektedir (Şekil 1.3-A). Büyüme hızı ile tümör büyülüğü arasındaki bu ilişki kemoterapi

şemalarının

geliştirilmesinde

önemli

bir

motivasyon

sebebini

oluşturmuştur.

Şekil 1.3. (A): Sigmoidal tümör büyüme hızı. (B) Sigmoidal büyüme hızına sahip bir tümörün belli bir ilâç dozuyla uyarlanması. Kemoterapiden kaynaklanan tümör büyüklüğündeki azalma, büyüme fraksyonu artırmakta ve geriye kalan tümörlerin büyüme hızındaki artış meydana gelmektedir (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). Kemoterapinin etkinliğini etkileyen başka bir faktör de tümör hücrelerinin konsantrasyonudur (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic 113

Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). İlâçlara karşı direncin meydana gelmesi birkaç mekanizmayla açıklanmaktadır. Tümör hücrelerinde P-glikoprotein ve multidrug-related protein (MRP) gibi ilâç pompalarının ekspresyonu kemoterapiye karşı direncin gelişmesindeki başlıca nedenidir. Diğer direnç mekanizmaları tümör hücrelerince alınan ilâç miktarındaki düşüş, ilâç detoksifikasyonu veya tümör hücrelerinin kemoterapiden kaynaklanan DNA hasarını onarım kapasitesini artırmaları sayesinde meydana gelmektedir (Bk.: Tablo-2). Tablo-2. Hücresel İlâç Direncinin ve etkilenen Sitotoksik İlâçların Etki Mekanizmaları (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49 ).

Ancak, şimdiye kadar sıralanan mekanizmalardan, en önemlisi apoptoza13 yol açan hücresel yolaklardaki patolojilerdir. Son yıllarda kemoterapiden kaynaklanan programlanmış hücre ölümünü14 indükleyen mekanizmalar hakkında önemli bilgiler 13

Programlanmış hücre ölümü. Programlanmış hücre ölümü kavramı 1989li yıllarda Almanya’da Heidelberg Üniversitesinde Catastrophy Theory’nin bir matematiksel modeline dayanmaktadır. İlk önce normal hücre döngüsünde scenescence doğrultusunda ilerleyen hücre bölünme olaylarını açıklamak için ele alınmıştır. Daha sonra İskoçya’da Glasgow Üniversitesinde Dr. Renato Baserga’nın ve diğer birçok araştırmacının geliştirdiği kanser hücre kültürü düzenekleri sayesinde bu hücresel olay kanser gibi patolojik olaykara da aktarılmıştır. Bu konuda yığınlarca yayın bulunmaktadır. Ancak bu kesin raporun amacı için şunlara başvurulması tavsiye edilebilir: 14

114

elde edilmiştir. Kemoterapiden kaynaklanan ilk olay çoğu kez tümör hücresinin DNA hasarıdır (Gossage, L. ve Madhusudan, S., 2007), ancak mikrotübüller gibi diğer hücresel makromoleküller de hasarın hedefi olabilmektedir (McGrogan et al., 2007). Tümör

hücresi

tarafından

bu

hasar

tespit

edildiğinde,

ancak

hasarın

oranılmadığında, kaspazlar, Bcl-2 grubu proteinleri veya p53 onkogenlerin önemli rol oynadığı birkaç yolak aktive edilir (Vattemi, E. ve Claudio, PP., 2007 ). Bu olaylarda mitokondrinin de rol oynadığı ortaya çıkarılmıştır (Nicolson, GL ve Conklin, KA., 2007; Xi, Y. Ve Edwards, JR, 2007; Keeble, JA ve Gilmor, AP, 2007). DNA’yı parçalayan endonükleazların aktivasyonundan sonra (Gossage, L. ve Madhusudan, S., 2007), hücrede kromatin kondenzasyonu ve hücresel fragmentasyon gibi olaylar meydana gelmektedir°. Bu projemin de temelini oluşturan kemoterapi ile bağlantılı olarak gelişen apoptoza özgü hücresel membran bleb15 oluşumları son yıllarda araştırmacılarının 1. Eberle J, Kurbanov BM, Hossini AM, Trefzer U, Fecker LF. Overcoming apoptosis deficiency of melanomaHope for new therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 2007 Dec 1. 2. Kooistra K, Zhang YH, Noteborn MH. Viral elements sense tumorigenic processes: approaching selective cancer therapy. Mini Rev Med Chem. 2007 Nov;7(11):1155-65. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi ile ilgilidir. 3. Ohnishi T. The role of the p53 molecule in cancer therapies with radiation and/or hyperthermia. J Cancer Res Ther. 2005 Jul-Sep;1(3):147-50. 4. McConkey DJ. Therapy-induced apoptosis in primary tumors. Adv Exp Med Biol. 2007;608:31-51. 5. Seynhaeve AL, Eggermont AM, ten Hagen TL. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 2008 Jan 1;13:3034-45. 6. Klampfer L. The role of signal transducers and activators of transcription in colon cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2888-99. 7. Bertazza L, Mocellin S. Tumor necrosis factor (TNF) biology and cell death. Front Biosci. 2008 Jan. 1;13:2736-43. 8. Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, Shoshan MC, Linder S. Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an "off-target" effect? Mini Rev Med Chem. 2007 Oct;7(10):1035-9. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ile ilgilidir. 9. Van Brocklyn JR. Sphingolipid signaling pathways as potential therapeutic targets in gliomas. Mini Rev Med Chem. 2007 Oct;7(10):984-90. Bu derleme özellikle projeminin de temelini oluşturduğu kanserde fosfolipidlerin rolüüzerine odaklanmaktadır. Projemde yoğun olarak ben de glikosfingolipidleri uyguladım. Bunun için Bk.: bu proje metninin Neticeler bölümünü. 10. Moran E, Nencioni A. The role of proteasome in malignant diseases. J BUON. 2007 Sep;12 Suppl 1:S95-9. °

Bu konu ile ilgili bk.: Sjakste N, Sjakste T. Possible involvement of DNA strand breaks in regulation of cell differentiation. Eur J Histochem. 2007 Apr-Jun;51(2):81-94.; Evenson DP, Kasperson K, Wixon RL. Analysis of sperm DNA fragmentation using flow cytometry and other techniques. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;65:93113; Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007;35(4):495-516; Yoshida A, Pommier Y, Ueda T. Endonuclease activation and chromosomal DNA fragmentation during apoptosis in leukemia cells. Int J Hematol. 2006 Jul;84(1):31-7; Hewitson TD, Bisucci T, Darby IA. Histochemical localization of apoptosis with in situ labeling of fragmented DNA. Methods Mol Biol. 2006;326:227-34. 15 Apoptoza bağlı olarak gelişen membran bleb’lerle ilgili bk.: 1. Larsen AK, Lametsch R, Elce JS, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA, Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem J. 2007 Dec 12.

115

dikkatini çekmektedir. Önümüzdeki yıllarda da apoptotik membran bleb oluşumları moleküler onkolojik araştırmalarının önemli bir bölümünü teşkil edeceği açıktır. Tümörlerin kemosensitivesini (kemoterapiye karşı duyarlılığını) etkileyen diğer faktör ise genomik instabilitedirϒ. Muhtemelen bir tümörün tek bir hücreden ortaya çıktığı bilinse de, bir tümörün genomik instabiliteden kaynaklanan sebeplerden dolayı, birkaç hücre döngüsünden sonra, çok heterojen bir tümör hücre popülasyonunu oluşturduğu ortaya çıkmıştır. Bu gibi çeşitli hücrelerden oluşan popülasyonuna kemoterapi uygulandığında, duyarlı olan tümör hücreleri apoptoza zorlanacaklardır, daha az duyarlı hücreler ise büyüme hızını devam ettireceklerdir. Kemoterapi birkaç kez tekrar edildiğinde, tedavi etkinliği sıfırlanacak, çünkü tümör popülasyonu tamamen ilâca-dirençli hücrelerden oluşacaktır. Bu gerçek de çok iyi çalışan matematiksel modellerle kanıtlanmıştır (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

2. Tournaviti S, Hannemann S, Terjung S, Kitzing TM, Stegmayer C, Ritzerfeld J, Walther P, Grosse R, Nickel W, Fackler OT. SH4-domain-induced plasma membrane dynamization promotes bleb-associated cell motility. J Cell Sci. 2007 Nov 1;120(Pt 21):3820-9. 3. Özellikle bk.: Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. Life and Times of a Cellular Bleb. Biophys J. 2007 Oct 5. 4. Schultz H, Hume J, Zhang de S, Gioannini TL, Weiss JP. A novel role for the bactericidal/permeability increasing protein in interactions of gram-negative bacterial outer membrane blebs with dendritic cells. J Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2477-84. 5. Sheetz MP, Sable JE, Döbereiner HG. Continuous membrane-cytoskeleton adhesion requires continuous accommodation to lipid and cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006;35:41734. 6. Nusbaum P, Lainé C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing and vesicle release, CD43 and CD16 downregulation and phosphatidylserine externalization. Biochem Soc Trans. 2004 Jun;32(Pt3):477-9. 7. Martínez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Plasma membrane remodelling and cell stimulation. Med Sci (Paris). 2004 Feb;20(2):189-95. 8. Hamill OP, McBride DW Jr. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patchclamp recording. Annu Rev Physiol. 1997;59:621-31. 9. Uchiyama Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Arch Histol Cytol. 1995 Jun;58(2):12737. 10. Verkleij AJ, Post JA. Physico-chemical properties and organization of lipids in membranes: their possible role in myocardial injury. Basic Res Cardiol. 1987;82 Suppl 1:85-91. 11. ϒ Bu konu ile ilgili olarak daha ayrıntılı bilgi için bk.: Calcagnile O, Gisselsson D. Telomere dysfunction and telomerase activation in cancer--a pathological paradox? Cytogenet Genome Res. 2007;118(2-4):270-6; Wang Y. Chromosome instability in yeast and its implications to the study of human cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2091-102; Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2075-90; Gasparini P, Sozzi G, Pierotti MA. The role of chromosomal alterations in human cancer development. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):320-31; Oberdoerffer P, Sinclair DA. The role of nuclear architecture in genomic instability and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Sep;8(9):692-702. Venkitaraman AR. Chromosomal instability in cancer: causality and interdependence. Cell Cycle. 2007 Aug;6(19):2341-3. 2007 Jul 18.

116

Kemosensitivite, anti-tümör aktivitesinin prognostik gösterge olduğundan, bu aktiviteyi önceden belirlemek amacıyla birçok yönteminin geliştirilmesi günümüzde büyük bir önem taşımaktadır. Bu konuda sitopatolojik, moleküler genetik ve moleküler onkolojik, mikroskopik vs. moleküler tıp konularına giren yığınlarca yöntem mevcuttur16. Tümörlerin kemosensitivitesini etkileyen diğer önemli faktörler arasında farmakolojik özellikler başı çekmektedir. Bunlar arasında, göğüs ve prostat 16

Ancak, projem bunlarla ilgilenmemektedir. Sunduğum proje, biyoteknolojik boyutu

dışında, daha fundamental hücresel etki mekanizmalarının modellemesi üzerine odaklanmaktadır. Böyle bir yaklaşımın çok daha rasyonel olduğu açıktır. Bunun da sebepleri şunlardır. Her şeyden önce yukarıda adı geçen moleküler yöntemleri Fakültemizde uygulayabilmek için uzun vadeli proje desteğine, özellikle buradaki araştırmacı statümün özerkliğine ve en önemlisi uluslararası ortaklarımın katılımlarına ve katkılarına ihtiyaç vardır. Ülkemizde her ne kadar da moleküler genetik yöntemlerinin gerçekleştirilmesi için gereken birtakım cihazlar alınmışsa da, bunların çoğu çalıştırılamamaktadır. TÜBİTAK çalıştaylarında bu gerçekler defalarca dile getirilmiştir. Fakültemizdeki durum da pek farklı değildir. Fakültemizde maddî olanaksızlardan dolayı bu olmasa da, diğer üniversitelerde bu yüzden yurt dışından çok büyük paralar ödenerek pratik seminerlerde bu yöntemleri göstermek amacıyla firma temsilcileri getirilmektedir. Bu konuda eğitilmiş ve bu konularda bağımsız olarak proje yürütebilecek akademisyenlerin sayısı da bir hayli yetersizdir. Avrupa Birliği destekli FP7 çerçeveye veya TÜBİTAK proje destekleme birimlerine gönderilen moleküler genetik konulu proje sayısına bakacak olursak bu gerçek de ortaya çıkacaktır. En önemli engel ise, bu yöntemlerin dayanağı olan tümör hücre kültürü düzenekleri ise Fakültemizde mevcut olmamasıdır. Mevcut olsaydı bile, son birkaç sene yaşanan bitmek tükenmek bilmeyen elektrik kesintileri ve özel hücre kültürünün gerektirdiği basınçlı kapılarla donatılmış aseptik ortamın bulunduğu laboratuvarlarının olmaması yüzünden bunları çalıştırmak zaten imkânsızdır. Bunların Fakültemizde kurulabilmesi için şu anda tam olarak nasıl olacağı kestirilemeyen uzun vadeli parasal ve teknik desteğe ihtiyaç vardır. Fakültemizde hücre kültürü düzeneğini kurulması için, sadece bir düzeneğin kurulması yeterli değil, bir de söz konusu hücrenin hangi hücre döngüsü evresinde bulunduğunu tespit etmek için henüz daha ne flow sitometre (akım sitometresi), ne fluorescently activated cell sorter (FACS), ne de başka güvenilir bir cihaz vardır. Bu bağlamda, bu yöntem ve yaklaşımlarının seçiminde büyük zorlukların yaşanacağı aşikârdır, çünkü bu yaklaşımların birçoğu biopsiden alınan ve buradan üretilen tümör hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır. Ayıca da, Fakültemizdeki sıfatım gereği şu anda bu projeyi bu tür uluslararası boyuta hedeflendirmeyi mümkün kılmıyor. Bu bağlamda, tarafıma sadece yazılı olarak görev verildiği ve projeme müdahale edilmeyeceği sözü yazılı olarak verildiği takdirde bu proje konusunu da moleküler genetik boyutunda gerçekleştirmeyi uygun görüyorum. Çünkü bu konuda yurt dışında ihtisas yaptım. Yurt dışından tarafıma doktora bursu verilirken de mezun olduktan sonra Türkiye’de bu yeni teknolojiyi ancak oturttuğum kaydıyla verilmiştir.

117

kanser vakalarda olduğu gibi endokrin terapilerin rolünü vurgulamak gerekir. Bunun dışında,

immünoterapi,

adjuvant

systemic

treatment

(kemoradyoterapi

ve

kemoimmünoterapi, kemoterapi ile paralel hipertermi) vs. terapi programları uygulanmaktadır. Bu çok önemli konulara bu kesin raporumun bu giriş bölümünü daha fazla uzatmamak amacıyla burada yer verilmemiştir. Ancak, bu konularla ilgili daha ayrıntılı bilgi www.chemotherapy.com sitesinden ve ilgili güncel kitaplardan edinilebilir (Bk. örneğin: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). 1.2.3. Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri. Son yıllarda sistemik kanser tedavileri17 sitotoksik kemoterapinin kullanımına dayandırılmıştır. Bu tedavilerin prensiplerine bir önceki bölümde yer verilmiştir. Seçiciliğin (selectivity) olmadığından, kemoterapi sadece kanser hücrelerini değil, normal hücreleri ve dokuları da öldürüp, geniş spektrumlu yan etkilere yol açmaktadır. Biyolojik ve moleküler araştırmalar hücre çekirdeğinin dışında bulunan ve karsinojenezde ve kanser oluşumlarında çok önemli rol oynayan birçok olayı ortaya

Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bk.: 1. Sharma SV, Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes Dev. 2007 Dec 15;21(24):3214-31. 2. Bianco R, Damiano V, Gelardi T, Daniele G, Ciardiello F, Tortora G. Rational combination of targeted therapies as a strategy to overcome the mechanisms of resistance to inhibitors of EGFR signaling. Curr Pharm Des. 2007;13(33):3358-67. 3. Hideshima T, Anderson KC. Preclinical studies of novel targeted therapies. Hematol Oncol Clin North Am. 2007 Dec;21(6):1071-91. 4. Rojo F, Dalmases A, Corominas JM, Albanell J. Pharmacodynamics: biological activity of targeted therapies in clinical trials. Clin Transl Oncol. 2007 Oct;9(10):634-44. 5. Bhatti M, Yahioglu G, Milgrom LR, Garcia-Maya M, Chester KA, Deonarain MP. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. Int J Cancer. 2007 Oct 31. 6. Voltz E, Gronemeyer H. A new era of cancer therapy: Cancer cell targeted therapies are coming of age. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(1):1-8. 7. Goldenberg DM. "Targeted therapy with monoclonal antibodies: the new generation of pharmaceuticals". Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006;1:nil21-2. 8. Garman KS, Nevins JR, Potti A. Genomic strategies for personalized cancer therapy. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R226-32. 9. Dittmer DP, Krown SE. Targeted therapy for Kaposi's sarcoma and Kaposi's sarcomaassociated herpesvirus. Curr Opin Oncol. 2007 Sep;19(5):452-7. 10. Korfel A, Thiel E. Targeted therapy and blood-brain barrier. Recent Results Cancer Res. 2007;176:123-33. 11. Kalyn R. Overview of targeted therapies in Oncology. J Oncol Pharm Pract. 2007 Dec;13(4):199-205. 17

118

çıkarmıştır.

Bu

olaylar

hücre sitoplazmasında,

hücre membranında18

veya

ekstraselüler ortamda meydana gelmektedir. Şu ana kadar gösterildiği üzere, bu olayların normal fizyolojik şartlar altında fazla görülmemeleri veya aktivitelerinin çok düşük düzeylerde olmasına karşın, kanserde önemli rol oynadıkları tespit edilmiş, bu olayları spesifik olarak baskılayan ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ise bir sonraki anti-kanser ilâç jenerasyonun (neslinin) tasarımlarında büyük önem kazanacaktır (Bk.: Şekil 1.4).

Şekil 1.4. Hedeflendirilmiş Tedavilerinin genel gösterimi (Bk.: Ferry A. I. M. Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of Systemic Molecular Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51). Eğer moleküler hedeflendirilmiş terapiler seçici ve spesifik olarak bu kansere özgü olaylara müdahale edebilseydi ve böylece spesifik olmayan sitotoksik

18

Söz konusu projemin hücresel boyutu da membranlarla ilgilidir, ancak apoptozdan çok antineoplastik ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Bu konuda da ilgili öncü hipotez ve model sunulmuştur. Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Yorum bölümüne başvurulmalıdır.

119

kemoterapilerin yan etkiler engellenebilseydi, anti-kanser tedavilerinin çok daha başarılı yapılabileceği açıktır. Bu konu çok geniş olduğundan buna bu kesin raporumda daha fazla yer verilmeyecektir. Ancak bu çok önemli konu ile ilgili son derece güncel bilgiler için Bk.: Ferry A. I. M. Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of Systemic Molecular Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51. Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer S ve Stoter G., 2005)19. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi, farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı toksisitelerinin de önemi artmıştır. Sitotoksik terapiden farklı olarak, kansere özgü olayların işlevsel ve yapısal özelliklerinin ortaya çıkarılması, bu olayları spesifik olarak baskılayan ajanların rasyonel olarak geliştirilmesiyle sonuçlandırılacak hedefe-bağlı (a target-based approach) bir yaklaşımı mümkün kılmaktadır. Şimdiye kadar ortaya çıkarılan hedefler arasında varlıkları sayesine kontrolden çıkan hücre bölünmesine (proliferasyona) yol açan genelde proteinler veya işlevi hasar gören reseptörler veya sinyal proteinleri başı çekmektedir. Moleküler hedeflendirilmiş tedaviler kanser hücreye özgü bir hedef ile buna bağlı olarak ve rasyonel olarak tasarlanan ilâçlar arasında spesifik tepkimenin ortaya çıkmasına

19

Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514.

120

bağlıdır ve bu şekilde normal hücreleri görmeyip, sadece kanser hücrelerini seçici olarak etkilemeleri amacıyla gündeme getirilmiştir20. Moleküler

hedeflendirilmiş

tedaviler

RNA

ve

DNA

replikasyonu

etkilemediğinden, aküt hücre ölümü olmamaktadır, ancak hücrelerin kontrol dışı proliferativ aktiviteleri baskılanmaktadır ve bunlar “quiescence”21 denilen duruma geçmektedir. Bu hedefe-bağlı kavram seçici olmayan ve tersinir olmayan DNA hasarının meydana geldiği ve aküt hücre ölümünün gerçekleştiği normal ve kanser hücrelerinin eşit olarak etkilendiği (Bk.: bir önceki bölüm) konvansiyonel sitotoksik anti-kanser yaklaşımından tamamen farklıdır.

1.2.4. Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü

İnsan gen tedavisi, birçok otoimmün ve kalıtsal hastalıkların ve kanser patolojilerinin tedavisinde şimdiye kadar uygulanan konvansyonel yaklaşımlar dışında bu hastalıkların tedavilerinde yeni bir umut olarak ortaya çıkmıştır (GREGORIADIS, 1993; MOLDAWER, 1999; KIRBY, 1999, STONE, et. al., 2000; FLOTTE, 2001; TEMPLETON, 2003; EL-ANEED, 2004; KOBAYASHİ, et. al., 2005; MEIDAN, 2006; PELISEK, et. al. 2006) . Gen tedavisi, son yıllarda moleküler biyoloji ve biyoteknolojideki gelişmeler sayesinde mümkün olmuştur. Olağanüstü öneme sahip ve uluslararası boyutta olan insan genomun gen dizilişinin ortaya çıkarılması projesi (Human Genome Sequencing Project) bu yeni tedavi yöntemini, birçok hastalığın moleküler düzeyde incelenmesini gerçekleştirerek bu doğrultuda yeni veriler ortaya çıkararak desteklemektedir. Bu gibi çok değerli genetik bilgilerin elde edilmesiyle, gen tedavisinin yakın gelecekte moleküler tıp alanında önemli yöntemlerden birini oluşturacağı inanılmaktadır. Gen tedavisinin amacı hastalığa neden olan genetik bozukluklarının tedavi edilmesidir (TEMPLETON, 2003).

20 Bk.: Chapter 3. Ferry , A. L. M,, Eskens and Jaap Verweij, Principles and examples of systemic molecular targeted therapies, In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, 2005). 21 Apoptoz olaylarının önemli bir bölümünü teşkil eden “scenescence” olayı doğrultusunda ortaya çıkmaktadır.

121

DNA dizilişindeki nokta mutasyonları teorik olarak tedavisi mümkün olan birçok hastalığa neden olmaktadır. Genomlarda, nokta mutasyonlarını ortadan kaldırmak için çok sayıda yaklaşım uygulanmaktadır. Bunlardan hibrid (veya chimeric)

RNA-DNA oligonükleotid veya söz konusu DNA dizilişinin kesilmesi

(deletion of DNA sequences) her ne kadar gelecek vaat eden yöntemler olarak sunulmuşsa da frekans olarak meydana gelme olasılıkları çok düşük olduğundan, henüz daha uygulamaları söz konusu değildir. Sonuç olarak, gen tedavisinin amacı genetik düzenlemelerinin gerçekleştirilmesi olduğundan ve bu da klinik ortamlarda yapılması bir hayli zor olduğundan, günümüzde gen tedavi yaklaşımların birçoğu işlevsel genlerin ortama katılmasına dayanmaktadır. Bu yaklaşımda, terapötik genler farmasötik bileşenler olarak tasarlanırlar ve ortama verilirler. Söz konusu genlerin hedeflendirildikleri hücre içi bölgeye ulaşma yollarındaki olağanüstü sitoplazmik engellerin bulunduğundan, in vivo ortamda, yeni ve kontrolü mümkün olan özellikler taşıyan, güvenilir ve tekrarlanabilir gen tedavi deneysel protokollerin geliştirilmesi gerekmektedir. Gen yer değişimi tedavinin (Gene Replacement Therapy) dışında, in vivo gen naklindeki başarı, antijenik proteinin optimal imün cevaba neden olacak şeklinde naklinin gerçekleştirildiği, DNA aşıların geliştirilmesini de mümkün yapacaktır GREGORIADIS, 1993; KIRBY,1999; TEMPLETON 2003; KOBAYASHI, et. al., 2005). Gen, ilk önce haberci RNA (mRNA)’ya nükleuste transkribe olmakta, daha sonra ribozomlarda peptide translasyonu gerçekleştirilmektedir; bu peptid daha sonra katlanma ve glikozilasyon aracılıyla multimerik şekillere dönüşüp işlevsel protein olarak gen ekspresyonuna katılmaktadır. Sadece DNA nükleotid dizilişindeki kodları

bulunan

genlerin

tedavi

işlevlerini

gerçekliştirmeden

önce

transkripsyonlarına ihtiyaç duyulur. Ancak, bunlar dışında genelde gen tedavi olaylarında

yer

alan

tüm

diğer

durumlarda,

kodlanan

genlerin

transgen

ekspresyununun (rekombinant gen ifadesi) gerçekleşmesi gerekmektedir. Böylece, nakledilen genin ulaştırılması hedeflenen nükleusa ulaşıncaya kadar herhangi bir işlevsel biyolojik önemi yoktur. Enjekte edildiği bölgeden nükleusa ulaşıncaya kadar tedavi amacıyla sentezlenen ve istenilen nükleotidleri içeren yeni kodlayan DNA, birkaç biyolojik engelle karşılaşır ki bunlar çoğu kez başarılı gen naklini engellemektedir (Şekil 1.5). Bu engelleri geçmek için, etkili DNA taşıyıcıların tasarlanması için çok sayıda yaklaşım uygulanmaktadır.

122

1.2.5. Gen Tedavisi ve Gen Nakli Günümüzde, gen nakli viral ve viral olmayan sistemlerle gerçekleştirilmektedir (DE LAPORTE, et. al.,2006) (Şekil 1.5-1.8). Taşıyıcılar genel olarak polimerler, lipidler veya polisakkaridler22 içerip hücresel nükleazlar tarafından muhtemel degrdasyonu engelleyecek ve daha küçük boyutlu ve daha az miktarda negativ yük taşıyan ve böylece hücreler tarafından alımı kolaylaştırılmış olan ve intraselüler haberleşmeyi gerçekleştirebilecek şekilde olmalıdır. Bu doğrultuda, taşıyıcıya ekstraselüler ve intraselüler engelleri aşmak için uygun fonksiyonel gruplar da eklenebilir. Bunlar, taşıyıcının serum bileşenleriyle tepkimeye girmesini engeller ve hücre veya doku türüne özgü bağlanmayı kolylaştıran gruplardır. Söz konusu gruplar DNA’nın çekirdeğe girmesini endozomlardan kaçışı veya çekirdeğin porlarından geçişi sağlayarak da kolaylaştırmaktadır. Belirli patojenin veya tümörün antijenini kodlayan DNA vektörleri önleyici veya terapötik kullanım imkânı sağlayarak bu patolojilere

karşı

DNA

aşısı

geliştirilmesinde

önemli

rol

oynayabilirler

(GREGORIADIS, 1993; KIRBY, 1999). Ex vivo gen tedavisi hastadan söz konusu hücrelerin ayrıştırılmasını ve bunları daha sonra in vitro olarak terapötik gen ile değişime uğratılmasını kapsamaktadır (TEMPLETON, 2003; KOBAYASHI, et. al. 2005). Bu şekilde manipüle edilen edilen hücreler daha sonra tekrar hastaya nakledilmektedir (Şekil 1.6). Diğer yandan, in vivo gen tedavisi (Şekil 1.5 ve 1.6), direkt olarak önceden tasarlanmış genin hastanın dokularına nakledilmesinden ibarettir. Her iki yöntemde de, henüz daha başarılmış olmayan ilgili nükleotid dizilişinin istenilen ekspresyonunu gerçekleştirecek spesifik hedef hücrelere yeterli miktarda aktiv ve işlevsel DNA’nın nakli konusu çözümünü beklemektedir. Günümüzde, ilgili hedef hücrelere DNA transferi için birkaç yöntem geliştirilmiştir. Bunlar fiziksel ve kimyasal (sentetik) yöntemler adı altında iki ayrı gruba ayrılmakta.

22

Ancak çözünürlükleri çok düşük olduğundan, polisakkaridlerin gen taşıyıcı tasarımlarında kullanımları çok kısıtlıdır.

123

Şekil 1.5. Viral ve viral olmayan gen nakli tasarımları. Kaynak: http://homepages.strath.ac.uk/.../ BGT/BGT12/BGT12.html

Şekil 1.6. Doğrudan ve hücresel gen nakli tasarımları. Kaynak: http:// http://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter11.asp

124

Şekil 1.7. Viral gen taşıyıcı tasarımlarının genel şeması. Yeni gen adenovirüs vektörüne enjekte edilmekte ve bu modifiye edilen DNA’nın daha sonra ilgili insan hücresine hedeflendirilmesi için kullanılmaktadır. Tedavinin başarılı olması durumda, bu şekilde nakledilen genin ürünü olan işlevsel proteinin sentezi gerçekleşecektir.

125

Şekil 1.8. Çeşitli lipozomal veya polimere dayalı gen taşıyıcılarının hücre içi (intraselüler) yolu. Burada (a–c) ile gösterilmiş yol, daha sonra böylece tasarlanan gen taşıyıcının yapı-aktivite özelliklerini de değişterebilen DNA ile komplex oluşturma yoludur. (d) Taşıyıcı kesitinden gözüken DNA. (e) Taşıyıcılar endositoz ile hücre içine alınmakta ve daha sonra engel olarka işlev yapan endosomları aşarak nükleusa girme özelliklerine sahip olmalılar. Bunu takiben tüm kompleks disosiye olup nuklus içindeki transkripsiyona katılırlar. Kaynak: Laura De Laporte, Jennifer Cruz Rea, Lonnie D. Shea, Design of modular non-viral gene therapy vectors, Biomaterials, 27 (2006) 947–954.

126

Şekil 1.9: İntravasküler (sol) veya doku (sağ) enjeksyonundan sonra plazmid DNA’nın in vivo akıbeti. Uygulandıktan sonra, plazmid DNA makrofajlar gibi tek hücreli, olan mononükleer fagositlerin de aralarında bulunduğu çeşitli hücreler tarafından alınmaktadır. Ayrıca, plazmid DNA plazma proteinleri ve ekstraselüler matriks bileşenleri ile de etkileşmelere girmektedir. Bazı durumlarda, plazmid DNA’nın ulaşması gereken hedef hücreyi tanıması içinintravasküler yol (extravasation) veya doku enjeksyonu (difüzyon)’un gerçekleştirilmesi gerekemektedir. Gen nakli için kullanılan araç ve nakil protokolüne bağlı olarak, DNA’nın hücrelerce alınması endositotik yol ile (kalın oklar) ve/veya endositotik olmayan yol (kesintili oklar) ile gerçekleşir. Endositozun gerçekleştiği durumlarda, bu plazmid DNA enzimatik olarak parçalanacağınan, bu endositozu engellemek gerekmektedir. Sadece nükleusa ulaşan plazmid DNA’nın terapötik protein sentezleme şansı vardır (KOBAYASHI, et. al., 2005).

127

Şekil 1.10: Polipleksler ve Lipoplekslerin transfeksyon esnasında hücresel farklı akıbetlerinin özeti. Lipopleksler ve polipleksler, kırmızı renkli ( lipid veya polimeri gösteren) ve yeşil (plazmid DNA’yı gösteren) disk veya elips olarak gösterilmiştir. (1) Serumun yokluğunda her iki vektör türünün de hücreye bağlanmaları birçok elektrostatik etkileşmelere dayanır. Serum varlığında, vektörlere bağlanan proteinler kendilerine özgü hücre yüzeyinde bulunan reseptörlerce tanınmaktadır (bu moleküler tanınma olayı gösterilmemiştir). (2) Bazı lipozomların katmanıyla plazma membran arasında füzyon meydana gelebilir, ancak bu DNA’nın hücre içi geçmesiyle her zaman sonuçlanmayabilir. (3) Poliplekslerin veya lipoplekslerin hücre içi geçiş mekanizması olarak en genel yolun endositozis üzerinden gerçekleştirildiği bilinmektedir. (4) Polipleks veya lipoplekslerde enkapsüle olarak bulunan terapötik DNA plazma membranının yakınında bulunan endozomlardan çok erken salınıma uğramaktadır ve bu olay neticesinde hedeflendirildikleri çekirdekten (nükleustan) çok uzakta kalmaları yüzünden intraselüler nükleazlar tarafından degradasyona uğratılmaktadır. 5) Endozomların sitoplazmik taşınımları rekombinant ve transfektant nükleik asitlerin perinükleer bölgeye söz konusu DNA’nın daha başarılı bir şekilde çekirdeğe ulaştırılmasında önemli rol oynamaktadır. Genel olarak buradaki amaç DNA’nın nükleusa ulaşmadan önce söz konusu endozomlardan kaçışı sağlanmasından ibarettir. Bu kaçışı polipleks ve lipopleks gen taşıyıcı tasarımları farklı yollar takip ederek meydana getirmektedir. Lipoplekslerde, örneğin bu füzyon gibi (6) ve (6V ) lipid taşınımı ve membran destabilizasyonu sayesinde gerçekleştirilmektedeir. Polipleks tasarınmları ise (en azından polietilenimin (PEI) gibi amin içeren polikatyonlarda veya dendrimerlerde) tamamen hidrofilik olduklarından (8) endozomların osmotik boşaltımı sayesinde

128

bunu gerçekleştirmektedir. Vektörle DNA’nın birbirinden ayrılmasıyla sonuçlanan lipopleks disosyasyonu (7) endozomlardan kaçış prosedürü esnasında veya (7V ) sitoplazmada salınıma uğratılan lipoplekslerin Endoplazmik Retikulum gibi sitoplazmik membran ağı ile füzyonu sonrası meydana gelmektedir. (9) Poliplekslerin sitoplazmada disosyasyonları henüz daha bilinmeyen başka bir mekanizmaya gerçekleşir. (10) Endozomlardan kaçışı başaramayan lipopleksler ve polipleksler lizozomlarca dagrade edilmektedir. Lipoplesklerden veya poliplekslerden ayrılan transfektant DNA hücre döngüsünün mitozis evresi esnasında nükleer membranın degradasyonunun olduğu zamanda nükleusa ulaşabilir (şemada gösterilmemiştir). Bu pasiv nükleer lokalizasyon olayı hücre döngüsünün aktivitesine ve sitoplazmada plazmidin aktiv kalma süresine bağlıdır. (11) Aktiv, enerji harcanarak gerçekleşen nükleusa geçiş mekanizması da mevcuttur. Bu da nükleusa geçişi kodlayan, transkripsyon faktörleri veya DNA-protein kompleksleri gibi makromoleküler bileşenlerin plazmidte bulunan genleri sayesinde meydana gelmektedir. Ayrıca lipozomlarla dolu endozomların membranları direkt olarak nükleus membranı ile füzyon yapabilmektedir (şemada gösterilmemiştir). Kaynak: Abdelatif Elouahabi and Jean-Marie Ruysschaert Formation and Intracellular Trafficking of Lipoplexes and Polyplexes, Mol. Therapy, Vol. 11, No. 3, March 2005, 336-347.

Şekil 1.11. Lipozom-DNA veya lipozom-plazmid DNA ile hedef hücre arasında oluşan elektrostatik etkileşmelerinin şeması. Kaynak: : www.ph.nagasaki-u.ac.jp/.../ doc/photo/main3e.htm

129

Fiziksel gen nakli yöntemlerinden elektroporasyon uygulanmaktadır (MOHR, et. al., 2002, TEMPLETON, 2003). Ancak bu yaklaşımda kullanılan elektrik alanlarının DNA’yı parçalayabileceklerinden bu yöntem çok problematiktir. Diğer bir yaklaşım ise Particle-mediated Gene Transfer (PMGT) yöntemidir ve burada “genegun” olarak bilinen yöntem kullanılmaktadır. Her iki yöntemde de yüksek frekanslı elektrik akımlarının kullanıldığı son derece ustalık gerektiren yaklaşımlardır. Son yıllarda fiziksel yöntemler arasında direkt DNA enjeksyonu yöntemi de yerini almıştır. Ancak bu yaklaşım daha başlangıc aşamısndadır. Bu problemler yüzünden, günümüzde kimyasal (sentetik) gen taşıyıcı tasarımları tercih edilmektedir (TEMPLETON, 2003; KOBAYASHI, et. al., 2005). Hayvan hücresini hedef alarak tasarlanan böyle bir gen nakli genelde şu yolu takip etmektedir. Küçük DNA içeren nanoparçacıkların oluşumu; bu parçacıkların hücreler tarafından alınması; parçacıkların hücre membranından geçip sitoplazmaya girmeleri; DNA’nın çekirdeğe girmesi ve son olarak nakledilen genlerin çekirdekte gerçekleşen gen ekspresyonu23 (Bkz.: Şekil 1.5-1.11). Gen nakli görüldüğü gibi etkili DNA veya oligonükleotidlerin hücre zarı üzerinden geçişine bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Bu olay son derece etkisizdir ve temelini oluşturan mekanizmalar henüz daha açıklanamamıştır. Ancak, virüsler evrim boyunca enfekte ettikleri çeşitli hücrelerle beraberce (simbiyotik) bir yaşam sürdürdüklerinden nanopartiküler yapılarından dolayı ve viral zarının yapısında bulunan proteinlerce gerçekleştirilen hücre membranı üzerinden geçişi son derece etkili bir şekilde meydana getirebilirler (STRAYER, 1999; ROBBINS, 1998; WALTHER, et. al., 2000; SILMAN, 2000; WILSON,et. al., 2002; RITTER, et. al., 2002; PASSİNİ, et. al., 2004; YOUNG, et. al., 2006; ZHANG, et. al., 2006). Bu bakımdan, gen nakli için retrovirüsler, adenovirüsler, adeno-associated virüsler (AAV) gibi birçok virüs türü gen nakli için birçok araştırmacı tarafından klinik uygulamaya

konulmuştur

(Şekil

1.7).

Gen

naklini

çok

etkili

bir

şekilde

23

Son iki şemada gösterilen DNA genelde plazmid DNA, oligonükleotid, poliribonükleotid veya diğer model DNA’lardan biridir. Bu nükleik asit türleri arasında her ne kadar moleküler ağırlık ve konformasyon bakımından farklılıklar bulunsa da diğer bileşenlerle kompleks oluşumundaki fizikokimyasal etkenler genelde aynıdır. Bu şemalar, bu yüzden herhangi bir nükleik asit (bunlara antisense ribonukleotid tedavisi veya small interference RNA (siRNA)’ya dayalı tedavilerde olduğu gibi, RNA da dahil olmak üzere) için geçerlidir.

130

başarabildiklerine karşın, viral partiküller bağışıklık sistemini tetiklemekte ve antikor ve diğer önemli proteinlerin sentezlenmesine neden olmaktadırlar (KAPLITT, et. al., 1997; BUELER, 1999; HOLT, et. al., 1999; KOOTSTRA, et. al., 2003; FALKNER, et. al., 2004; HENDRIE, et. al., 2005; HENDRIKS; et. al., 2004). Bu bağlamda, istenilmeyen proteinlerin sentezlenmesi, klinik uygulamalarında ölümle sonuçlanan birçok yan etkilere neden olmuşlardır. Bu yüzden, birçok üniversite ve araştırma merkezi viral olmayan gen taşıyıcıların sentezlenmesine yönelmişlerdir. Viral olmayan gen taşıyıcılarının geliştirilmesi fizyolojik iyonik ve pH ortamında negativ yüklü DNA fisfat grupları ile birkaç positiv yüklü gruplar veya polimerik zincirler arasında

oluşan

elektrostatik

etkileşmelere

ve

makromoleküllerin

yapısal

özelliklerine bağlı olarak hidrofobik etkileşmelere dayanmaktadır. DNA paketlenmesi veya kondanzasyonu olarak da bilinen bu olay yoğun olarak araştırılmaktadır. Birçok DNA kondanzasyon olayında, doğal poliamin putresin (H2N(CH2)4NH2), spermidin (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2)

ve

spermin’in

(H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2)

türevleri olan bazı katyonik moleküller ile gerçekleştirilmektedir. Genel olarak, nükleik asit kondanzasyonu morfolojik olarak özgün DNA nanoparçacıkların oluşmasıyla ortaya çıkarılır. Bu dynamic light scattering (DLS) yöntemi dişinda, elektron ve floresan mikroskopik ve son yıllarda atomik kuvvet mikroskopik incelemeleriyle teyit edilmiştir. Ancak, bu küçük katyonik molekülleriyle DNA arasında oluşan bileşenler çoğu zaman sabit değildir ve serum gibi fizyolojik iyonik ortamlarda

bu

gibi

kompleks

oluşumları

disosiasyonla

sonuçlanmaktadır

(TEMPLETON, 2003; KOBAYASI, et. al., 2005). Bu yüzden, gen taşıyıcıları olarak, daha yüksek valanslı poliaminler ve spermidin ve sperminin türevleri sentezlenmiştir. Bu gibi sentetik polikatyonlar DNA’yı nanopartiküllere dönüştürüp hücre içi geçişi kolaylaştırmaktadır. Katyonik poliaminler ve polimerler büyük hacimli DNA moleküllerini işlev düzenleyici gen bölgesini de içerecek şeklinde daha küçük boyutlu parçacıklara dönüştürebilmektedirler. Sonuç olarak, viral olmayan sentetik taşıyıcı tasarımlarından birtanesi DNA’yı elektrostatik etkileşmeler sayesinde kondanze eden ve böylece hücre içi geçişini kolaylaştıran polikatyonik polimerlerin kullanımına dayanmaktadır (JULIANO, 1991; DRITSCHILO, et. al., 1992; ROMANCZUK, et. al., 1999; GEBHART, et. al., 2001; ANWER, et. al., 2003; JANG, et. al. 2004). Bir diğer yaklaşım ise H-bağlar ile DNA’ya bağlanabilen ancak nükleik asit kondanzasyonu ile sonuçlanmayan, nötr amfifilik polimerleri kullanmakta (GEBHART, et. al., 2001; ANWER, et. al., 2003). Günümüzde, viral sistemlere nazaran, her iki yöntemin de

131

dezavantajı çok düşük transfeksyon oranlarının olmasıdır (JANG, et. al. 2004). Yukarıda adı geçen sentetik polimer yapılardan başka, üç ayrı polimer türü kullanılmaktadır: çeşitli poliamin türevleri, poliamidler ve polivinil türü polimerler. Bu polimerlerin transfeksyon kabiliyetleri bir birinden çok farklıdır. Ayrıca, yapıları itibariyle sentezlenmeleri kolay olmakla birlikte, kullanılmakta olan sentetik polimerler doğal bileşenler olmadıklarından, elektrostatik ve hidrofobik özelliklerinin kontrolü bir hayli güç olup, bağışıklık sistemini aktive etmektedirler. Viral olmayan taşıyıcılar ayrıca işlevsel organik grupları da içerebilirler ki bu hücre türüne özgü hedeflendirmeyi

(cell-specific

targeting)

ve

nükleer

localizasyonu

da

kolylaştırmaktadır. Bu tür yaklaşımlarda en önemli husus, DNA’yı enzimatik degradasyondan koruyacak şekilde toksik olmayan ve biyolojik olarak yok edilebilinen (biyodegradable) gen taşıyıcılarının tasarlanmasıdır. Ayrıca, bu taşıyıcılar membran reseptörlerce meydana getirilen hücresel alımı kolaylaştırıp, DNA’nın endozomal salınımını da gerçekleştirebilmektedirler (KOBAYASHI, et. al., 2005).

1.2.6. DNA Kompaktizasyonu ve Nanoparçacık Oluşumunu Meydana Getiren Bileşenler Poliaminler. Poliaminlerden spermidin ve spermin ve bunların sentetik türevleri DNA kompaktizasyonunu meydana getiren moleküller arasında en etkili olanlar arasında gösterilmektedir (Şekil 1.12). Poliamin ve analoglarının DNA kondazasyon ve kompaktizasyon reaksyonlarının >89%’nda bunu yük nötralizasyonu olarak meydana getirmektedir. Diğer yaklaşımlarda, katyonik poliaminlerden olan cobalt heksamin3+ kullanılmaktadır. EtBr displacement assay kullanarak poliamin homologlarının DNA’ya farklı afinite gösterdikleri ortaya çıkarılmıştır. Tetravalent poliaminlerin DNA’yı hücre içi geçiş olayında çok etkili olmamalarına rağmen, heksaminler gibi daha

yüksek

valanslı

poliaminler

bu

geçişi

daha

başarılı

bir

şekilde

gerçekleştirmektedirler.

132

Şekil 1.12: Doğal poliamin olan sperminin (3−4-3) ve çeşitli türevlerinin kimyasal yapıları. Poliamin türevleri primer ve sekonder amino gruplarını birleştiren metilen gruplarının sayısını gösteren numalandırma sistemi ile kısaltılarak gösterilmiştir (SANTHAKUMARAN et. al., 2005).

Nötr Lipidler Nötr lipidler (Şekil 1.13) genelde önemli yardımcı bileşen rolü üstlendikleri katyonik lipid formülasyonlarının bir parçasıdır. Bu bileşiklerde sıkça kullanılan üç nötr lipid dioleil fosphatidiletanolamin (DOPE), kolesterol ve dioleoil fosfatidil kolin’dir (DOPC). Birçok durumda, DOPE ile katyonik lipid’in 1:1 oranında kullanılması en etkili transfeksyon neticelerini vermiştir (PITARD, 2002; ZHANGA, et. al. 2004). DOPE lipid katmanlarını destabilize ettiği ve endozomal degradasyonda rol oynadığı bilinmektedir. Katyonik lipid-DNA kompleksleri hücreye endozomal yolu takip ederek girmektedir ve DOPE’nin işlevi endozomal membranı destabilize etmekten ibarettir. Kolesterol gibi nötr lipidlerin kullanımı sayesinde, in vivo transfeksyon düzeyleri yükseltilebilmiştir. Diğer lipozomlara kıyasla, kolesterol içeren lipozomların uygulandığında birçok organda gen ekspresyon profilleri yükseltilmiştir. İnsan hepatoma hücrelerinden biri olan, HepG2 ile yapılan deneylerde, DOPE içeren lipozomlar ve galaktozil türevleri ile konjüge edilmiş kolesterol içeren lipozomlar daha düşük toksisite ve daha yüksek transfeksyon etkinliğine sahip oldukarı görülmüştür (PITARD, 2002; ZHANGA, et. al. 2004; SANTHAKUMARAN et. al., 2005).

133

Transfeksyon etkinliğindeki bu artış karaciğerin parenhimal hücrelerine spesifik asyaloglikoprotein reseptörlerine karşı yüksek afiniteleriyle açıklanmaktadır (SANTHAKUMARAN et. al., 2005). Bazı araştırmacılar, kolesterolün in vivo uygulandığında katyonik lipopoliamin pcTG90 ile nötr lipid olarak konjüge edilmiş DOPE’ye

nazaran,

DOPE’nin

türevi

olan,

kısmen

florine

edilmiş

gliserofosfoetanolamin (F-PE) in vitro ve in vivo gen nakil potansiyeli göstermiştir. Bu, d-florine edimliş T lipoplekslerin in vivo uygulamalar için DOPE’nin etkin bir alternatifi olduğunu göstermektedir.

Şekil 1.13. Nötr lipidlerden gen taşıyıcı tasarımlarında bazı sıkça kullanılan örnekler: dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), cholesterol and dioleoyl phosphatidyl choline (DOPC); A partially fluorinatedglycerophosphoethanolamine (F-PE),. Katyonik Lipidler Gen tedavisinin klinik öncesi araştırmalarda DNA naklini başarılı bir şekilde gerçekleştiren moleküller arasında katyonik lipidler dikkati çekmektedir (AKHTAR, et. al., 1991; ZHANG, 2004; AZZAM, et. al., 2004; HART, 2005; IGARASHI, et. al., 2006). Bu moleküller hidrofobik ve polar grup olmak üzere 2 ayrı kısımdan oluşmaktadır. DNA transfeksyonu için çok sayıda sentetik katyonik lipid geliştirilmiştir (Şekil 1.14). Bunlar DNA transfeksyon ajanları adı altında ticari olarak piyasadan da edinilebilir. Bu moleküller lipidin pozitiv yüklü polar baş grubu ile DNA’nın negativ yük taşıyan fosfat grubu arasında elektrostatik etkileşmeye neden olup DNA nanoparçacıklarının oluşmasına neden olmaktadır. DNA nanoparçacıklarla

134

lipidler arasında bu şekilde oluşan kompleks sayesinde, DNA’nın hücresel engelleri daha kolay aştığı ve hücre kültürü ortamında enzimatik degradasyona daha dirençli olduğu tespit edilmiştir (ZHANGA, 2004). Bu nanopartiküllerin boyutları 50 ile 1000 nm arasında değişmektedir. DNA kompaktizasyonu çok etkili bir şekilde gerçekleştirmelerine rağmen, piyasada ticari ürün olarak bulunan birçok katyonik lipid toksiktir. Sıçan ve makaklarla yapılmış deneylerden elde edilmiş veriler yüksek dozlarda birkaç defa üst üste uygulandıklarında katyonik lipidlerin akciğer patolojilerine neden oldukları göstermektedir (AKHTAR, et. al., 1991; ZHANGA, 2004; AZZAM, et. al., 2004; HART, 2005; IGARASHI, et. al., 2006).

Şekil 1.14: Katyonik lipidlerden bazı örnekler: lipopoliamin RPR120535, dioctadesildiamonium bromid (DODAB), dioleoiltrimetilammonium propan (DOTAP), ve bisguanidinium tren kolesterol (BGTC), (N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-tri-methylammoniumchloride (DOTMA). (Bruno Pitard, Supramolecular Assemblies of DNA Delivery Systems, Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 27, Nos.1/6, November 2002; Shubiao Zhanga, Yingmei Xua, Bing Wanga, Weihong Qiaob, Dongliang Liub, Zongshi Lib, Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery, Journal of Controlled Release 100 (2004) 165–180). 135

Polivalent Katyonik Lipidler DOTAP ve DOTMA’nın gen naklindeki başarısını takiben, birçok başka lipid hazırlanmıştır.

Aralarında,

dioktadesilamidoglisilspermin

(DOGS

veya

ddtransfectamTT) gibi yapıların da örnek olarak gösterilebileceği, polivalent katyonik lipidler yoğun ilgi çekmişlerdir. Diğer popüler örnekler DOSPA, DPPES, (C8)2Gly Sper3+ ve (C18)2Sper3+’dir (Şekil 1.15). DOGS, DOTMA’dan DNA ile bağlanma mekanizması bakımından farklılık göstermektedir. DOGS’un baş grupları poliamin grubu aracılıyla DNA’nın minor groove ile etkileşmeye girmektedir. DOGS fazlalığında, DNA’nın paketlendiği, nucleozom benzeri yapı oluşmaktadır. Bundan farklı olarak, DOTMA sıvı çözeltide lipozomların meydana gelmesine neden olmaktadır. Bunlar kendiliğinden negativ yüklü DNA molekülleriyle agregatlar oluşturmaktadır (KOBAYASI, et. al., 2005).

Şekil 1.15: Polivalent Lipidler ve Kolesterol Türevi.

136

Polietilenimin Polietilenimin (PEI) farklı hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde oligonükleotidlerin ve plazmid DNA’nın hücre sitozolüne geçişinde etkili rol oynayan sentetik polimerler grubunun bir bölümünü teşkil etmektedir (Şekil 1.16). Lineer ve zincirli

şeklindeki

PEI

DNA’yı

nanoparçacıklara

dönüştürmektedir.

DNA

kondanzasyonunda ve transfeksyon etkinliğinde PEI’nin kullanılan şekli ve moleküler ağırlığı rol oynamaktadır. Fizyolojk pH’da PEI/DNA bileşiklerinin endozomal degradasyonu daha kolayca aşabildikleri gösterilmiştir. Ancak, bu nanopartiküllerin çok düşük olan çözünürlülüğü gen naklinde kullanımlarını kısıtlamıştır.

Şekil 1.16: Lineer, zincirli ve polietilen glikol ile konjuge edilmiş polietileniminler (SANTHAKUMARAN et. al., 2005). Dendrimerler Poliamidoamin (PAMAM) ve polipropilenimin (PPI) dendrimerleri (Şekil 1.17) DNA nanopartiküllerini etkili bir şekilde oluşturma ve DNA naklini kolaylaştırma kaabiliyetleri dikkati çekmiştir. Lineer ve zincirli polimerlerle kıyaslandıklarında dendrimerlerin monodispers olmaları ve kontrol edilebilen işlevsel yüzeye sahip

137

olmaları bu molekülleri gen taşıyıcı tasarımlarında kullanılmaları konusu gündeme getirilmiştir.

Şekil 1.17: Polipropilenimin dendrimerlerinin beş ayrı çeşidinin kimyasal yapıları. Dendrimerlerin artan karmaşıklığı G1-G5 numaralandırma sistemi ile gösterilmiştir (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005). Proteinler ve Polipeptidler Hücrede DNA nanoparçacıkların oluşumu DNA’nın histonlar ve protaminler gibi

katyonik

proteinler

veya

peptidler

ile

etkileşimi

neticesinde

gerçekleştirilmektedir (Şekil 1.18 ve 1.19). Spermde ve bazı virüslerde bulunan DNA nükleik asitin fosfodiester kısmıyla bağlanabilen Arginine (Arg) zengin bölgeler içeren protamin tarafından kondanze edilmektedir.

138

Şekil 1.18: (a) Protaminde amino asit dizilişinin şematik çizimi. (b) Argininin yan gruplarını ayıran alternativ bir yapının gösterimi. Bu şeliyle protaminin DNA ile etkileşmelere girdiği düşünülmektedir. (c) Protaminin bir diğer olası helikal yapısı. (Kaynak: F. P. OTTENSMEYER, R. F. WHITING, AND A. P. KORN, Threedimensional structure of herring sperm protamine Y-I with the aid of dark field electron microscopy, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72, No. 12, pp. 4953-4955, December 1975). Protamin aracılıyla gerçekleştirilen DNA kondanzasyonu arginin grupların DNA sarmalın her iki zincirini de kilitleyerek nükleik asiti transkripsyonel olarak aktiv olmayan konformasyona dönüştürmektedir. Bir katyonik polipeptid olan, polilizin (poly-L-lysine, PLL), DNA ile etkileşmelere girip nükleik asit nanoparçacıklarınınoluşumuna neden olan ek proton içeren amin gruplarını yapısında bulundurmaktadır (Şekil 1.20). Bu şekilde oluşturulan nanoparçacıkların büyüklüğü PLL yapısal özelliklerine (lineer veya zincirli) ve ortamın iyonik özelliklerine bağımlılık göstermektedir. DNA naklinde çok etkili

olmamasına

rağmen,

reseptörlere

bağlanma

kaabiliyeti

gen

taşıyıcı

potansiyelini artırmaktadır. Ayrıca, PLL-DNA kompleks oluşumu, DNA’yı hücresel ortamda enzimatik degradasyondan koruduğuna dait raporlar bulunmaktadır (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).

139

Şekil 1.19: Hering protaminin (protamine (clupeine) Y-I.) yapısı.

Şekil 1.20: Lineer ve zincirli poli-L-lizinin kimyasal yapıları (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005). Polimerler. Kitosan (Chitosan) doğal bir polimer olup glikozidik bağlarla birbirleriyle bağlanan D-glükozamin ve N-asetil-D-glükozamin moleküllerini içeren iki alt

140

biriminden oluşmaktadır (Şekil 1.21). Nispeten daha az toksiktir ve DNA nanopartikül oluşmasını takiben transfeksyon etkinliği oldukça yüksektir. Böylece, kitosan ve çeşitli türevleri gen nakli konusunda gelecek vaat eden bileşikler olarak görülmektedir.

Şekil 1.21: Kitosan (Chitosan)’ın kimyasal yapısı (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005). Poli(etilen glikol) (PEG) ve poli(etilen oksid) (PEO) gibi nötr polimerler de yüksek pI’de DNA kondanzasyonuna neden olmaktadır. Bu yük taşımayan ve esnek polimerler “excluded volume mechanism” adıyla bilinen mekanizma ile etki gösterirler. DNA kondanzasyonunun satbilitesini ve transfeksyon etkinliğini artırmak amacıyla, çoğu zaman PEG PEI, folat reseptörleri ve poli-L-lizin ile konjuge edeilir (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005). Sonuç olarak, üniversitelerde ve sanayii kuruluşlarının araştırma-geliştirme (AR-GE) merkezlerinde, DNA ile reaksyona giren ve DNA nanoparçacıkların oluşumuna neden olan çok sayıda sentetik veya doğal bileşenin viral olmayan gen taşıyıcıların tasarlanmasındaki kullanım olasılıkları yoğun olarak araştırılmaktadır.

141

1.3. Taxol® (Paclitaxel). 1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®’un Rolü Konvansiyonel ilâç geliştirmesi genelde deneysel hayvanların ve hücre kültürü düzeneklerinin kullanıldığı faz-1, faz-2 ve faz-3 olarak adlandırılan aşamaları içeren klinik öncesi araştırmaları takip etmektedir. Genel olarak da, faz-3 çok sayıda gönüllünün iştirak ettiği klinik deneylerinden ibarettir. Söz konusu aşamalı prosedür çoğu zaman komplementer veya alternativ tedavilerle sonuçlanmamaktadır. Buna ilâve olarak, etkili konsantrasyonları önceden ayarlanabilen total olarak sentezlenmiş bileşenler dışında, doğal bitkisel kökenli malzemeden izole edilen aktiv olan etken madde miktarları genelde çok düşüktür. Aynı şekilde, komplementer ve alternativ terapilerle sonuçlanabilecek klinik öncesi araştırmalar çok nadir olup, double-blind klinik araştırmalar da son derece nadir olarak uygulanmaktadır (Stohs, S.J., 2005). Bu tür komplementer ve alternativ terapilerin izlediği aşama ve gelişmelerden farklı olarak porsuk ağacından (Pacific Yew Tree, Taxus brevifolia, bk. Şekil No: 1.22) izole edilen ve günümüzde antikanser tedavierinde çok başarılı bir şekilde yoğun olarak kullanılan Taxol® (Paclitaxel24)’in buluşu ve geliştirilmesi olmuştur.

24

Jenerik ismi (Bk.: Stohs, S.J., 2005). Bu raporumda her iki (ticari ve jenerik) isim de kullanılmıştır.

142

Şekil 1.22.: Porsuk ağacının farklı türleri, Taxus brevifolia, Taxus baccata vs. (www.turkforum.net; www.conifers.co.nz; home.scarlet.be ve çok prestijli Max-Plank Enstitüsü-caliban.mpiz-koeln.mpg.de sitelerinden alınmıştır).

Taxol®‘un saflaştırılması, karakterizasyonu, klinik öncesi ve klinik araştırma süreçleri Food and Drug Administration (FDA)’nın konvansiyonel ilâç geliştirme ve piyasaya sunma stratejilierini takip etmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Harlan, Jr., W.R., 2001; Stohs, S.J., 2005)25. 1960’larda, National Cancer Institute (NCI) U. S. Department of Agriculture (USDA) tarafından rastgele bitkisel kökenli örneklerin toplandığı ve bunların antineoplastik aktivitelerinin tarandığı bir program başlatmıştır. Toplanan bitkiler arasında, Washington Eyaletinden getirilen T. brevifolia’nın gövdesinden kısımlar, yapraklar ve meyveler de bulunmaktaydı (Stohs, S.J., 2005). Bunlarla yapılan ilk taramalar çeşitli neoplastik hücrelere karşı potansiyel aktivite endeksi olarak da

Bk.: Harlan, Jr. W. R., New opportunities and proven approaches in complementary and altenative medicine research at the National Institutes of Health. J. Altern. Compl. Med., 7, S53, 2001; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: discovery to clinic (13th Bruce F. Caine Memorial Award Lecture), Cancer Res., 55, 753, 1995; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: from discovery to clinic. J. Ethopharmacol., 51, 239, 1995- Taxol® ‘un geliştirme tarihçesini ve klinik kullanımını özetleyen bir derlemedir. 25

143

kabul edilen, T. brevifolia ekstraktlarının 9KB hücrelere karşı yüksek bir sitotoksisiteye sahip olduğu saptanmıştır (Stohs, S.J., 2005)26. 1964 yılında, Research Triangle Institute, Research Triangle Park, N. C.,’da bulunan Wall’un laboratuvarı, National Cancer Institute tarafından gönderilen ilk T. brevifolia bitkisel malzemeleri incelemek üzere kabul etmiştir. Saflaştırma ve sitotoksisite prensipleri Walker WM katı tümör inhibisyonunu içeren biyoaktivite göstergeleri kullanarak yapılmıştır (Stohs, S.J., 2005). Kasım 1966’dan itibaren, Wall ve Wani (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995) bu bitkiden çok yüksek sitotoksik aktiviteye sahip bir fraksyon izole etmişlerdir. 2 yıllık bir saflaştırma sürecini takiben, standart etanol ekstraksyonu, H2O ile kloroform arasında oluşan etanol kısmının faz ayrımını sonucu counter current dağlımını içeren aktiv bileşen izole edilmiştir. Taxol ismi, söz konusu molekülün hidroksil grupları içerdiği (-ol) ve taxane çekirdeğinin bulunduğu yapıya dayanarak (Bk.: Şekil 1.26.), T. brevifolia’dan izole edilmiş bileşene verilen bir isimdir. Taxol®‘un yapısal analizi, ultraviyole (UV; morötesi), kızılötesi (IR) ve kütle spektrometresi ölçümleriyle yapılmıştır ve 1971 yılında (Wani et al., 1971) bu yapı ayrıntılı olarak aydınlatılmıştır27. Taxol®‘un (Paclitaxel’in) yapısı Şekil 1.26’da verilmiştir. 1960’lı yıllarda yapılan araştırmalarda Taxol®‘un L1210 ve 1534 türü lösemi hücrelere karşı aktivitesi bulunduğu gösterilmiştir. Taxol®‘un ayrıca birçok katı tümöre karşı aktiv olduğu gösterilmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Stohs, S.J., 2005). Taxol®‘un etki mekanizmasının aydınlatılması, bu sitotoksik ajanın klinik araştırmalarda kullanılmasında önem taşımıştır. İlk araştırmalar, bir mitotik inhibitör olarak etki ettiği ve böylece yeni ve daha başka örneği bulunmayan bir mekanizma söz konusu olduğunu kanıtlamıştır28. Taxol®‘un yapısı ve fizikokimyasal özellikleri Ek-7 verilmiştir. Daha ayrıntılı bilgi için Ek-7’e başvurulmalıdır. Bk.: Stohs, S.J., Taxol in CCncer Treatment and Chemoprevention. In: Phytopharmaceuticals in Cancer Chemoprevention, Debasis Bagchi and harry G. Preuss (Eds.), CRC Pres, Boca Raton, London, New York, Washington D. C., 2005, pp. 519-524. 27 Bk.: Wani, M.E., Taylor, H.L. Wall, M.E., Coggan, P. and Mc Phail, A.T., Plant antitumor agents VI: the isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971. 28 Bk.: Fuchs, D. A ve Johnson, R. K. Cytologic evidence that taxol, an antineoplastic from Taxus brevifolia, acts as a mitotic spindle poison, Cancer Treat. Rep., 62, 1219, 1978. 26

144

Ancak, daha sonraki araştırmalar söz konusu mekanizmanın mikrotübülleri stabilize

ettiğinden

ve

bunların

tekrar

tübüline

geri

depolimerizasyonunu

engellediğinden, yani kolisin, vinkristin, vinblastin ve podofilotoksin gibi diğer antimitotik ajanların etki mekanizmalarının aksine çok farklı bir yol takip ettiğini göstermiştir (Schiff, P. B., et al. 1979; Horwitz, S. B., 1992)29. Hayvanlar üzerinde deneyler 1982 yılında yapılmış olup, faz-1 klinik aşaması 1983-84, faz-2 ise 1983-86 yıllarında tamamlanmıştır (Wall, M. E. ve Wani, M. C., 1995; Stohs, S. J., 2005). ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) 1991 yılında yeni ilâç uygulama şemasını elde ettiğinden dolayı Cooperative Research and Development Award (CRADA) adlı ödülü Bristol-Myers Squibb şirketine vermiştir. Taxol® ilk olarak son derece yavaş büyüyen Taxus brevifolia’nın kabuğundan izole edilmiştir. Taxol® çok düşük miktarlarda bu ağacın kabuğunda bulunmaktadır ve bundan dolayı uzun süre klinik kullanımı sorun olmuştur. Bu sorun, başka taxus türlerinde, örneğin T. baccata’nın yapraklarında çok daha yüksek miktarlarda bulunan baccatin III veya 10-deacetylbaccatin III’ten Taxol®’un yarısentezini gerçekleştiren Bristol-Myers Squibb şirketince çözülmüştür (Bk.: Şekil 1.24). Taxol®’un total sentezi ile ilgili bk.: Ek-8. Taxol®’un total sentezi iki ayrı grup tarafından yapılmıştır. Yapısından da anlaşılacağı üzere (Şekil 1.26), çok sayıdaki asimetrik C-atomu total sentezi son derece güçleştirmektedir. Taxol®’un söz konusu total sentezi bu ilâcın pratik olarak stoklanması anlamına gelmemesine rağmen, o yıllarda Taxol®’un kimyası hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bunun dışında, Taxol®’un analoğu olan Taxotere™ (Docataxel) (Şekil 1.27) hazırlanmıştır, test edilmiştir ve her ikisinin de klinik olarak kullanılabilecekleri kararına varılmıştır (Stohs, S. J., 2005). 1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı. Rahim karsinom ve non-small-cell lung kanser vakalarında radyoterapi veya cerrahi müdahalelerin uygun görülmediği hastalarda cisplatin ile birlikte Taxol® ilk başvurulan çok etkili bir ilâçtır (Bk.: Şekil 1.25). Aynı şekilde, refraktor metastatik Bk.: Schiff, P. B., Fant, J. ve Horwitz, S. B., Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol, Nature, 22, 665, 1979: Horwitz, S. B., Mechanism of action of taxol, Trends Pharmacol. Sci., 13, 134, 1992.

29

145

rahim

karsinom

vakalarında

ve

kombinasyon

terapinin

başarısızlıkla

sonuçlandığında metastatik hastalık için veya adjuvant kemoterapi sonrası dönemler için bu ilâç birinci derecede önem kazanmıştır. Bunun dışında, AIDS’e bağlı Kaposi sarkomlarda ikinci derecede önemlidir (Stohs, S. J., 2005). Ayrıca, standard tedavi yöntemlerden şimdiye kadar üstünlüğü kanıtlanmış olsa bile, head and neck karsinomlarda Taxol®’un yine etkili bir şekilde kullanılmaktadır. 4-hidroksitamoxifen ile birlikte kullanıldığında, estrojen-reseptör-negativ barsak kanserine ve akciğer kanser hücre kültürlerinde etkili olduğu gösterilmiştir (Stohs, S. J., 2005). Bu kombinasyon, tek başına kullanıldığı zaman gösterdiği etkiden çok daha yüksek bir potansiyeli olduğu gösterilmiştir (Stohs, S. J., 2005). Taxol®’un çok sitotoksik olduğundan, bu ilâçla tedavi edilen hastalarda yan etkilerinin de görülmesi beklenmektedir. Tek başına Taxol® ile tedavi edilen katı tümörlü hastalaın 90%’nında nötropeni ve lökopeni gibi omur iliği baskılanmaları görülmüştür. Bu ilâçla tedavi edilen hastaların 75%’inde ise anemi görülmektedir. Sonuç olarak, Taxol®’un fizikokimyasal özelliklerini optimize etmek suretiyle bu yan etkileri azaltmak mümkün olacaktır. Bu amaçla, bu ilâçın çeşitli kontrollü salınım sistemleriyle denenmesi gerekmektedir. Projemde yer alan Taxol®-fosfolipid kompleks oluşumunun incelenmesi de bu hususu vurgulamaktadır. Bu tür lipide (lipozomal) bağlı formülasyonlarının geliştirebilmesi kuşkusuz Taxol® ‘un yan etkileri ve çözünürlülük problemleri çok daha azaltılmış olarak uygulama fırsatı yaratacaktır.

146

Şekil 1.23. Taxol’un popülaritesini gösteren bir şekil. Dünya üniversitelerin 80%’inde kullanılan Genel Kimya ders kitabının kapağında yer almaktadır (Bk.: General, Organic, and Biochemistry (Hardcover); by Katherine J Denniston, Joseph J Topping, Robert L Caret, McGraw-Hill Science/Engineering/Math; 4 edition (Mar 4 2003).

147

1.24. Bristol-Myers Squibb tarafından yayımlanan monografi (Kaynak: www.jatext.de/Print.php).

148

(Kaynak: www.brandinstitute.com/NEWS/MEDAD_11_04.HTM)

149

1.25. Üst kısım: Kuzey Amerika’da klinik kullanımda olan en popüler ilâçları gösteren bir kıyaslama tablosu. Alt kısım: Taxol® tedavisinin etkinliği (Kaynak: www.rmj.ru/articles_3834.htm)31. Bu şekil daha önce verilen Şekil 1.2 ve 1.3 ile kıyaslanmalıdır.

Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442. 30

150

15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279. 18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13. 31 Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442. 15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279.

151

Şekil: 1.26. Taxol®‘un kimyasal yapısı. Molekülün diterpen kısmı sarı renkle gösterilmiştir. Daha iyi renkli bir görünüm için bu proje raporumla birlikte sunduğun CD’ye bakınız. Bu diğer şekiller için de geçerlidir.

Şekil 2.27. Docataxel veya Taxotere™ (Kaynak: chimie.scola.acparis.fr/Sitedechimie/chi_org...).

18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13.

152

1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması. Taxol®’un hücresel mikrotübüllerdeki32 bağlanma bölgesi hücresel işlevi bilinmeyen bir farmakolojik hedeftir. Mikobakteri kaynaklı epotilonlar, deniz yosunu kaynaklı diskodermolidler ve yumuşak mercanlardan elde edilen elenterobinler ibi doğal bileşenler, mikrotübüllerdeki bağlanma bölgesine yerleşerek Taxol®’un sitotoksik etkilerine benzer etki göstermektedirler. Mikrotübülleri stabilize eden bileşenler adı verilen bu moleküller, mikrotübüllere bağlanarak dinamiklerini bloke etmekte ve böylece hücre bölünmesini sonlandırmaktadırlar (Bk.: Şekil 1.28-1.31). Taxol® ve türevleri yumurtalık kanseri, metastatik göğüs kanseri, head and neck kanseri ve böbrek kanseri tedavilerinde başvurulan başlıca ilâçtır (Bk. özellikle Şekil 1.25. Ayrıca bk.: Şekil 1.2 ve 1.3). GTP aracılıyla Taxol®’un mikrotübüllere bağlanma noktası olarak mikrotübül lumeninin (boşluğunun) β – tubulin altbirimi belirlenmiştir (Bk.: Şekil 1.31). Taxol®’un bağlanma kinetiğini ve ligandlara karşı afininitesini incelemek için en duyarlı yöntem olarak floresan işaretli taxoid Flutax-2’in kullanılması olmuştur (Şekil 1.32). Görüldüğü üzere, floresan mikroskopik inceleme taxoidlerin çözeltideki mikrotübüllere

doğrudan

bağlandığını

göstermektedir.

Cyclostreptin

hücre

mikrotübülleri stabilize eden ilk moleküldür ve bunlara kovalent olarak bağlanarak tersinir

olmayan

bir

etki

yapmaktadır.

Bu

ligandı

kullanarak,

Taxol®’un

mikrotübüllere bağlanma mekanizması ve ayrıca da biden fazla bağlanma noktası bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu kovalent bağlanma, P-glikoproteini eksprese eden hücre kültürlerinde bu ilâcı aktiv hale getirmektedir.

32

Hücre mikrotübülleri hakkında daha ayrıntılı bilgi için Moleküler Hücre Biyolojisi ders kitaplarına başvurulmalıdır.

153

Şekil. 1.28. Taxol®’un hücre bölünmesi üzerine etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

Şekil 1. 29. Taxol®’un mikrotübül dinamiği üzerindeki etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

154

Şekil 1. 30. Taxol®’un hücre mikrotübüller üzerinde ve programlanmış hücre ölümüne (apoptoza) yol açan çeşitli etkileri. (Kaynak: biologyofcells.blogspot.com/2007/12/microtubu...).

155

Şekil 1.31. Taxol®’un mikrotübül dimerlerine bağlanma şekli (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

156

Şekil 1.32. Mikrotübül stabilize edici moleküllerin hüceresl mekanizmaları. PtK2 hücrelri during 7 saat boyunca cyclostreptin yokluğunda (A) veya 5 µM (B) ve 10 µM paclitaxel (C) varlığında. Hücreler daha sonra yıkanıp, bu hücre kültüründe 16 saat boyunca bu şekilde bırakılmışlardır, kontrol (D), 5 µM cyclostreptin (E) ve 10 µM paclitaxel(F). (Kaynak: biologyofcells.blogspot.com/2007/12/microtubu...). 1.3.5. Projemin Bilimsel Dayanağı. Yukarıda ayrıntılı olarak verilen Taxol® etki mekanizması uyarınca, mikrotübüllerin iç yüzeyinde meydana gelen bu tür üç boyutlu bağlanma şekli, prensip olarak uzay geometrisi engelleri bakımından bağlanmayı çok zor bir hale getirmektedir. Bu yüzden Taxol®‘un bağlanma afinitesi, kinetiğini ve üç boyutlu şekilleri hakkında ek bilgilere ihtiyaç vardır. Çünkü bu tür bilgiler daha ileriki aşamalarda Taxol®‘un hem daha etkili farmasötik terapötik formülasyonlarının geliştirilmesini, hem de hücre seviyesindeki Taxol®‘un etki mekanizmasını çok daha iyi bir şekilde anlaşılmasını mümkün kılacaktır. Bu her iki nokta da projemde özellikle vurgulanmıştır. Bu bağlamda da, şu ana kadar teklif edilen etki mekanizmasına muhtemel alternativler sunulmalıdır. Tarihsel olarak da zaten, aynı mantık ve düşünce tarzı anestetiklerin etki mekanizmaları için de izlenmiştir. Örneğin, anestetiklerin33 etkileri sadece Meyer veya Overton yasalarına dayanarak Octanol-Water Partitioning sabitlerini hesaplayarak açıklanamamıştır. Çok daha

33

Aynı gerekçeler diğer ilâçlar için de geçerlidir.

157

sonraları bunların etki mekanizmalarına projemde de olduğu gibi lipid teorileri dahil edilmiştir34. Bu projemde de zaten Taxol®‘un bu etki mekanizmalarını aydınlatacak niteliği taşıyan ek bir öncü hipotez sunulmuştur. Çünkü söz konusu etki mekanizması, kullanılan tümör hücre kültürü türüne göre de farklılıklar göstermektedir. Projemde öncü hipotez olarak Taxol®‘un hücre zarının akışkanlığını düzenleyerek ve dolayısıyla da buradaki ilâç difüzyonlarını ve reseptörlerin dinamiğini kontrol ederek etki mekanizması teklif edilmiştir. Literatür taraması da gösteriyor ki35, şu ana kadar böyle bir bağlantı çalışılmamıştır. Bu bakımdan projemin orijinalliği tartışılamaz hale getirilmiştir. Bu hususları Bilimsel Araştırma Proje Birimine daha projemin ilk sunuş metninde açıkça ifade edilmiştir. Daha çok ayrıntı için bu proje teklifim incelenmelidir. Söz konusu hipotezim de normal hücrelerle tümör hücreleri arasındaki membran akışkanlığında gözlenen farklılıklarına dayanmaktadır36. Bu konuya ayrıca Yorum bölümünde de ayrıntılı olarak değenilmiştir. Multidrug Resistance (MDR) adı verilen antineoplastik ajanlara karşı gelişen direnç mekanizmalarının ortaya çıkması sonucu Taxol® ile gerçekleştirilen kemoterapilerde her zaman tatmin edici sonuçlar alınmamaktadır. Söz konusu MDR olayları P-glikoprotein (P-gp) gibi membran pompapalarının aşırı ekspresyonu sonucu meydana gelmektedir ve kemoterapötik ilâçları sitoplazmadan hücre dışına pompalayarak bunların intraselüler konsantrasyonunu ve böylece de kemoterapilerin etkinliğini düşürmektedir. P-gp de membran glikoproteini olduğundan Taxol® ile hücre zarları arasında oluşan moleküleretkileşmelerinin önemini vurgulamaktadır. Projemde de bu etkileşmeler çeşitli fosfolipid molekülleri kullanarak model hücre zarı yüzeyleri ile modellenmiştir. MDR hücre türlerini öldürebilen Taxol® ligandlarını bulmak için bu projemde elde edilen verilere dayanarak daha sonraki aşamalarda bu modelleri dirençli ve dirençsiz hücre kültürleri üzerinde denenebilir. Bu amaçla, bu projemde geliştirilen etkileşme modellerine dayanarak Taxol®’un bazı tümör hücre kültürlerinin hücre mikrotübülleri üzerinde, hücre bölünmesi ve hücre döngüleri üzerindeki etkileri incelenebilir. Ancak bu şekilde bu ligandların afinitelerinden yola 34

Bu konularla ilgili özellikle bk.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. J. K. Seydel and . Wiese (Eds.)., Methods and Principles in Medicinal Chemistry, Vol. 15, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany, 2002, 35 Bk.: Ek-5 ve Ek-6. 36 Bu çok önemli konu için bk.: Chapter 9: Membranes in Cancer. In: Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes. Structure and Function, Plenum Press, New York and London, 1993, pp. 353-374.

158

çıkarak araştırılan maddelerin Taxol® ve türevlerinin bağlanma noktasındaki sitotoksisitelerini ortaya çıkaracaktır ve böylece yüksek afiniteli bileşenlerinin tasarımını ve sentezini mümkün kılacaktır. Bu hususlar projemin moleküler hücresel boyutunu teşkil etmektedir. Bunun dışında projemin bir de daha pratik biyoteknolojik boyutu da vardır. Sunduğum projenin nanofarmasötik biyoteknolojik boyutu olarak, model hücre yüzeyi - Taxol® nanometrik bileşenlerin fizikokimyasal özelliklerinin yeni bir laboratuvar protokolü geliştirerek şu ana kadar çok az uygulanan Langmuir-Blodgett tek katman (lipid monolayer) düzeneği ile incelenmesi ile ilgilidir. Şimdiye kadar yayımlanan deneysel tasarımlardan farklıdır ve kanımca orijinal bir yaklaşımdır. Şu ana kadar yayımlanmış çalışmalarda, Taxol® - hücre membran lipid modellerini teşkil eden antineoplastik ajan veya bir başka model terapötik formülasyon ve katiyonik lipidlerle girdikleri tepkimeler neticesinde elde edilen bileşenlerin daha sonraki intraselüler penetrasyon deneyler esnasında hücre kültüründe terapötik bileşenlerin uygun bir şekilde taşınma kapasiteleri ile ilgili olarak, ön biyofiziksel ölçümlere ve bunu takip eden morfolojik karakterizasyonlardan ibarettir. Ancak, söz konusu katiyonik lipidler sitotoksik olduklarından, in vivo ortamda serum stabiliteleri son derece düşüktür. Sunduğum projede ise, orijinal bir alternativ olarak katiyonik

lipidler

yerine

zwitteriyonik

(nötr)

fosfolipidlerin

kullanılmasını

önermekteyim. Bunlar arasında aynı amaçla tasarlanan nükleik asitlere dayalı formülasyonlarının

fizikokimyasal

sabitlilikleri

ve

termodinamik

özellikleri

yayımlanmıştır. Ancak, aynı modelin daha küçük hacimli antineoplastik ajanlar ile de geçerli olup olmadığı henüz daha araştırılmamıştır. Ayrıca, sekonder yapıları ve bu dinamik yapılardaki meydana gelen değişikliklerin hücre içi geçiş yaparak hücre çekirdeğindeki DNA’ya bağlanma potansiyellerini nasıl etkilediği konusu henüz daha bilinmemektedir. 1.3.6. Literatür Özeti Taxol®’un etki mekanizmasıyla ve tedavi potansiyeli ile bir hayli fazla yayın bulunmaktadır. Bunların en güncel olanları Ek-5’te verilmiştir. Bunun dışında ilâç tedavilerine paralel olarak son yıllarda çok popüler olan gen aktarım yöntemleriyle kanser tedavi profilleri de Ek-6’da verilmiştir.

159

2. GEREÇ VE YÖNTEM Bu projemde Taxol® (Paclitaxel) ile model hücre yüzeyleri arasında oluşan moleküler

etkileşmelerin

simüle

edilmesini

mümkün

kılan

bir

düzeneğin

tasarlanması amaçlanmıştır. Söz konusu düzeneği anlayabilmek için yüzey kimya ve kolloid kimya kavramlarını çok iyi bilmek lâzım. Özellikle hücre membranın yapısı ve fizikokimyasal özellikleri ile yüzeysel aktivite kavramları çok önemlidir. Bu amaçla, bu proje raporumu inceleyecek olanlara yardımcı olmak amacıyla aşağıdaki bölümde ilk önce hücre membran yapısı ile ilgili güncel bilgiler verilmiştir. Daha sonra da projemde geliştirilen deneysel protokole ayrıntılı olarak yer verilmiştir. Bu protokole dayanarak, başka ilâçların da membran afiniteleri incelenebilir. 2.1. HÜCRE MEMBRAN YAPISI 2.1.1. Biyomembranların İçeriği Membranlar hücre işlevlerinin yerine getirilmesinde hayati bir rol oynar. Plazma membranı hücreyi çevrileyerek iç hacminde bulunan sitozol ile dış çevre arasındaki önemli farklılıklarını muhafaza eder. Hücre içi ortamda farklı bileşen, yapı ve işleve sahip birçok organel ve cisimcik bulunur. Organeller yerine getirdikleri işlevlerine göre farklı olarak isimlendirilirler ve böylece eukaryot hücrelerde endoplazmik retikulum, Golgi cismi, mitokondri, kloroplastlar ve membrana-bağlı organeller ayırt edilmektedir (Şekil 2.1).

160

Şekil 2.1. Hücre membranı (www.microscopy-uk.org.uk/.../membranes.html sitesinden alınmıştır). Membranlar her organelin iç hacmindeki içeriği ile sitozol arasında bulunan karakteristik farklılıkları muhafaza eder. Hücre membran yapısının kavramı Singer ve Nicholson tarafından (Şeki 2.2) teklif edilen ve sıvı-akışkan veya “fluid-mozaic” membran modeli olarak da adlandırılan lipid çift katman (lipid bilayer) yapıya dayanmaktadır. Günümüzde hücre membranı kavramı karbonhidratlar, pigmentler, antikorlar, reseptörler ve diğer proteinleri de içerecek şeklinde geliştirilmesine rağmen (Şekil 2.3), hala geçerliliğini koruyan fluid-mozaic membran modeline göre, hücre membranlarını oluşturan fosfolipidler amfipatik olup suya afinitesi yüksek olan (hidrofilik) ve sudan uzaklaştırılan (hidrofobik) kısımları içerir. 161

Şekil 2.2. Biyomembranların günümüzde geçerli olan Singer ve Nicholson modeli (www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).

162

Şekil 2.3. Biyolojik membranların yapısı (www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).

Şekil 2.4. Biyomembran yapısında yer alan fosfolipidlerden tipik bir görünüm (Bk.: www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm ve www.agen.ufl.edu/.../lect/lect_06/lect_06.). Bu makromoleküller birçok hayvan hücre membran hacminin yarısını oluşturup, geriye kalanı ise proteinlerden oluştuğu bilinmektedir. Fosfolipidlerin çift katmanlar (bilayers, Şekil 2.4) söz konusu lipidlerin bu amfipatik doğasından ve şekillerinden kaynaklanmaktadır. Böylece, lipid moleküllerin su tarafından çevrildiklerinde hidrofobik kısımlarının iç hacminde ve hidrofilik başlar da suya doğru yer alacak şekilde çeşitli agregatlar ve toplaşımlar (self-assemblies) meydana getirirler.

163

Hücre membranların lipid çift katmanları (Şekiller 2.2-2.4) fosfolipidler, kolesterol ve glikolipidler gibi üç ayrı çeşit membran lipid molekülü içermektedir. Hücre membranının iç ve dış tek katmanları (monolayers) lipid içeriği bakımından birbirinden farklıdır. Buna benzer farklı lipid karışımları eukaryotik hücrelerin çeşitli organel membranlarında da mevcuttur. Böyle bir asimetrik membran lipid çift katman modeli söz konusu lipidlerin iki boyutlu lipid molekülleri içinde yerleşmiş membran proteinlerin bulunduğu yapısal tasarımına dayanmaktadır. Böylece, bazı membran proteinleri işlevlerini yerine getirmek için spesifik baş gruplarına ihtiyaç duyar. Aynı şekilde, suyun proteinler için bir üç-boyutlu çözücü rölü oynar ki böylece birçok enzim bu çözeltilerde aktiviteleri için seçici olarak bir metal iyona gereksinim duyar. Biyolojik membranların temel yapısı lipid çift katmana dayanmasına rağmen, spesifik işlevlerin çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. Bu doğrultuda, membranda yer alan proteinlerin miktarı ve türü geniş sınırlar içinde değişmektedir. Sinir hücresi aksonlarda elektrik yalıtkanlığı görevi yapan proteinler membran kütlesinin 25%’den daha düşük bir miktarı oluştururken, mitokondrinin ve kloroplastlarda iç membranların enerji iletimi görevi üstlenen zarda ise ~75%’i proteindir. Genel olarak, plazma membranın içeriğinin 50% proteinlere düşer. Protein moleküllere kıyasla lipid molekülleri daha küçük olduklarından her zaman hücresel ortamlarda proteinlerden daha fazla oranda lipid molekülleri bulunur. Bu oranı genelde membranlarda her proteine karşılık olarak 50 lipid molekülün bulunduğu gerçeğiyle de açıklanır. Membran proteinleri birçok işlev görür. Plazma membranında dış uyarılara sensör cevabını gerçekleştiren proteinler bulunur. Bu şekilde bu protein sensörleri veya reseptörleri bilgi taşınımında da görev yapar. Diğer membran proteinleri zarlar arasındaki iyon gradyantlarını meydana getirir. Bu gradyantlar ATP sentezinde, önceden seçilmiş maddelerin transmembran taşınımında, veya kas ve sinir hücrelerinde elektrik sinyallerin iletiminde kullanılır. Değişik işlevlerine rağmen, tüm biyolojik membranlar genel bir yapıya sahiptir-her biri lipid ve protein moleküllerince oluşturulan ince film tabakasıdır (Şekiller 2.2-2.4).

164

Biyolojik membranların iki boyutlu akışkanlar olduğu kavramı membranın yapı-aktivite ilişkisinin ortaya çıkarılmasında büyük bir rol oynamıştır. Ancak, membranı sadece lipid denizinde serbestçe yüzen proteinlere dayanan model bir hayli basitleştirilmiş olduğu ortaya çıkmıştır. Birçok hücre meydana getireceği işlevin kolaylaştırılması doğrultusunda birçok lipid ve protein molekülü lipid çift katmanı üzerindeki belli bir yüzeyde yoğunlaştırır. Böylece membran domenler ve membran dinamiği kavramları geliştirilmiştir. Bu kavramlar, şimdiye kadar vurgulanan membran proteinlerin öneminin yanı sıra membran lipid türlerinin oluşturduğu domenlere (lipid rafts) dikkati çekmektedir. Örneğin, birçok lipid molekülü membran proteinlerden farklı olarak çift katmanı oluşturan iki ayrı tek katmanlar arasında yer değiştirmektedir. Membran proteinleri ise membran içinde lateral olarak hareket eder. Sonuç olarak, hem lipidlerin hem de proteinlerin bu hareketliliği membranın çok dinamik bir yapı olduğu ve hücre membran akışkanlığının biyolojik önemini ortaya koymuştur. Örneğin, çift katman viskozitesini laboratuvar deneylerinde suni olarak belli bir seviyenin üzerine çıkartarak tamamen ortadan kalktığı gözlenmiştir. Lipid çift katmanın akışkanlığı lipidlerin içeriğine ve ortam ısısına bağlıdır. Böylece, çift katmanın sıvı fazdan jel faza geçişini gösteren karakteristik freeze noktasında daha kısa hidrokarbon zincirlerinin veya çift bağ içerildiğinde bu nokta daha düşüktür. 2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri 2.2.1. Lipid Çift Katman Lipid-protein çift katman hidrofobik etkileşmeler sayesinde meydana gelen bir supramoleküler yapıdır. Bu etkileşmeler molekülleri imobilize etmek için yeterince güçlü olmadıklarından çift katman fizyolojik ortamda sıvı özellikleri gösteren, aynı zamanda da yapısal olarak kristal şekilleri alabilmektedir. Söz konusu sıvı kristal fazı tüm molekülleri kapsamamaktadır. Sıvı kristal fazını oluşturan moleküller genelde uzun zincirli olup moleküler ağırlıkları MW=200-500 Da’dan birkaç bin Da arasında değişmektedir. ESR spektroskopisini kullanarak ilk defa Hubbel ve McConnel37 çift katmanın üst ve alt kısmında bulunan lipid hidrokarbon zincirinin hareketliliğinin yüksekliğini gözlemişlerdir. Bu olay daha sonra Levine ve Seelig tarafından

2H-

ve

13C-NMR

spektroskopisi kullanarak teyit edilmiştir. Bu

37

Hubbel, W. L. and McConnel, H. M. (1971): Molecular Motion in Spin-Labelled Phospholipids and Membranes, J. Amer. Chem. Soc., 93: 314-326.

165

araştırmalar neticesinde yağ asitlerinin son kısmında bulunan metil gruplarının hareketli olduğunu ortaya çıkarılmıştır. 2.2.2. Membranın Fizikokimyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler Fosfolipidler, glikolipidler ve diğer basit amfifiller faz değişimi ısısı (phase transition temperature veya Tm) adı verilen bir ısı seviyesinde endotermik sıvı kristal↔katı (jel) faz değişimine uğrarlar (Şekiller 2.5-2.6 ve Tablo-4).

166

Şekil 2.5. (A) Fosfolipid faz değişim geçişleri (phase transitions) ve bunlara kolesterolün etkisni gösteren bir diferansiyel taramalı kalorimetrik (DSC) termogram; (B) Fosfolipid konfigürasyonlarının katı ve sıvı fazları.

Lipidlerin katı fazda düzenli, sıvı-kristal fazda ise nispeten düzensiz olduklarından, bu ısı noktasına ayrıca düzen-düzensizlik geçiş noktası (orderdisorder transition temperature) adı da verilmektedir. Her lipidin kendine özgü bir Tm değeri vardır (Bk. Tablo-2.1).

Şekil 2.6. Bir maddenin faz değişimleri.

167

Tablo-2.1. Biyomembranlarda Bulunan Bazı Fosfolipidlerin Faz Değişim Isıları.

168

Lipidlerin sıvı-kristal şekilleri Lα fazını oluştururlar. Katı fazı ise Lβ şekli olarak adlandırılır. Lβ şeklinde moleküller çift katman eksenine doğru hidrokarbon zincirlerin tam olarak uzunluğunu muhafaza edip all-trans konfigürasyonu ve quasi-heksagonal toplaşımlar oluşturur (Şekil 2.5-B). Lipidlerin faz değişim mekanizmaları çeşitli fizikokimyasal yöntemler kullanarak katı fazdaki çift tabakada ve lipid moleküllerin paketlemelerinde (elektron mikroskopla görüntülenen “grain borders” in freeze frakture replicas) düzensizliklerin ve defektlerin olduğunu ortaya çıkararak tespit edilir. Söz konusu defektlerin doğal entropinin (düzensizliğin) ifadesi olduğundan, meydana gelme olasılığı ısının yükselmesiyle artar. Faz değişimi noktasında, defektler lipidin ilk erime noktaları olarak kabul edilirler ve bunlar akışkan lipid moleküllerinde küçük domenler oluştururlar. Bu yüzden, faz değişimi noktasında hem akışkan hem de katı domenler aynı anda (eşzamanlı) meydana gelir. Bu ısının Tm değeri üzerine yükseltildiğinde geride kalan katı faz lipidleri hızlı bir şekilde eriyip akışkan faza geçerler. Faz değişimi noktasında üç ayrı faz aynı anda meydana gelmektedir: katı faz, sıvı-kristal faz ve interfacial lipid phase adı verilen ara faz. Interfacial lipid phase katı ve sıvı-kristal fazları arasında yer alır ve faz değişimin meydana gelmesinde en önemli rolü üstlenir. Bu üç fazda yer alan lipidler hidrokarbon zincirleri arasında eşzamanlı olmayan paketlenme olasılıkları yüzünden faz değişimi noktasında lipid çift tabakanın geçirgenliğinin artmasına neden olur. Faz değişim noktasının üzerinde bulunan lipidler sıvı-kristal fazında bulunur. 2.2.3.Lipid Fazlarını Etkileyen Faktörler ve Biyosistemlerdeki Önemi Lipid faz geçişleri ortaya çıkarıldıktan sonra bu konu ayrı bir bilim dalı olarakgelişmiştir. Söz konusu geçişler fizikte “lyotropic phase transitions” olarak adlandırılan teori ile açıklanmaktadır. Bu konuyla ilgili çok iyi matematiksel ifadeler de geliştirilmiştir. Burada bunlardan projemizin amacına uygun bir şekilde

169

ve sadece lipidlerde görünen olgulardan çok kısa bahsedilecektir38. Lipid fazlarını etkileyen faktörler kısaca şunlardır. Çift bağların varlığı, özellikle cis-çift bağlar, CH-zincirlerinin all-trans paketlemelerine engel olmaktadır ve Tm’i düşürmektedir. Çift bağların sayıları ve CH-zincirlerinin pozisyonları da ayrıca Tm’i etkilemektedir. Genel olarak, Tm hidrokarbon zincirin uzunluğuna bağlı olarak değişim gösterir. Diğer etmenler arasında fosfolipid baş grubunun yükü ve konformasyonu, hidrokarbon zincirinde yer alan C-atomlarının sayısı, iyonik ortam ve yüzeysel pH fosfolipid çift tabaka akışkanlığını etkileyen faktörlerdir. 2.2.4. İlâçların Biyomembran Akışkanlığı Üzerine Etkisi İlâç – hücre membranı etkileşmeleri uzun yıllardan beri araştırma gruplarının ilgisini çekmektedir. Bu ilginin başlıca nedenleri kısaca şöyle özetlenebilir. Biyolojik veya

farmakolojik

aktivitesi

olan

herhangi

bir

molekül

kendine

özgü

lipidçözünürlülüğüne göre hücrelerin hidrofobik bölgelerine yerleşip, ve buralarda etkili

konsantrasyonlarda

bulunuyorsa,

lipid

çift

katmanın

yapısında

deformasyonlara neden olacaktır. Bazı ilâçlar, sıvı ortamında çeşitli ligandlarla bağ yapacaklarından hiç bir zaman bu etkili konsantrasyonlara ulaşamayacaklardır. Söz konusu ilâçlar membranı çok daha düşük konsantrasyonlarda etkileyebilmektedir ve bu yüzden bu etkileri sadece in vitro olarak gözlenebilmektedir. Basit kimyasal yapılar olarak ilâçlar sıvı ortamında pek etkili olmadıklarından ve yeterli miktarlarda membrana bağlanmayınca zararlı etki gösteremeyeceklerinden büyük bir ihtimalle membranların parçalanmasına neden olabilmektedir. Bu ilâçların bazıları çok yüksek lipid çözünürlülüğüne sahiptir, ancak yüksek lipid çözünürlülüğü membran üzerine etki göstermek için yeterli olmayabilir. Bu olayda tek gereken şey söz konusu membranın daha düşük dozlarda bulunan ilâçların etkilenmemesidir. Bu konu ile ilgili elde edilen veriler ve bunlara dayanarak geliştirilen modeller anestetikler ve alkoller gibi ve bunlara benzerlik gösteren ilâçlara dayanmaktadır. Bu ilâçlarla ilgili uzun yıllardan beri lipid yapısı ve lipid faz değişimleri üzerine etkileri araştırılmıştır ve birçok veri elde edilmiştir. Bu

38

Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Fizikokimya ders kitaplarına başvurulmalıdır.

170

sınıfa giren ilâçlardan anestetikler etki mekanizmaları bilinen tek grup olmamakla birlikte en iyi bilinen bileşenlerdir. İlâç – hücre membranı etkileşmeleri ile ilgili olarak geliştirilen teoriler ve modeller

ilâçların

membran

lipidleriyle

veya

membran

proteinleriyle

gerçekleştiğine dair Overton dağılım kurallarına uygun olarak iki ana grupta toplanmaktadır. İlâçların membran lipidlerine mi yoksa membran proteinlerine mi etki ettikleri konusu uzun süredir bilimsel tartışma konusudur. Bu konu ile ilgili, herhangi bir hidrofobik fazda meydana gelen ve ölçülebilen fiziksel değişim ilgi çekicidir. Yüksek lipid çözünürlülüğüne sahip ilâçların membran lipidlerin ve proteinlerin her ikisinin de hidrofobik kısımlarıyla etkileşmeye girecekleri açıktır. Ancak, bu durumda bile hidrofobik etkileşmelerinin hücre işlevlerini nasıl bir şekilde ve hangi yönde etkilediklerini açıklamak son derece güçtür. Bu hususları açıklığa

kavuşturmak

için

ilâç-hücre

etkileşmeleriyle

ilgili

daha

fazla

araştırmalarının yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu beklenti araştırılmakta olan ilâcın hem hücre membran lipidleriyle hem de membran proteinleriyle etkileşmeye gireceği varsayımına dayanmaktadır. Ancak, bu durumda çok muhtemel olarak bazı lipidler ve proteinler diğerlerine kıyasla daha çok etkilenecektir. Bu yüzden, bunları tespit etmek ve söz konusu ilâcın bu moleküllere göre neden daha yüksek afinite ve seçicilik gösterdiğini ortaya çıkarmak en önemli hedefler arasındadır. Çünkü bunu başarılı bir şekilde ortaya çıkarmak ve her durumda çalışan bir model ve teoriyle destekleyerek, hem genel bir etki mekanizmasının keşfedilmesine, hem de daha etkili ilâç tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Bazı ilâçlar hücre üzerinde kendilerine özgü reseptörleri bulunsa bile hidrofobik etkileşmeye girebilmektedir. Örneğin, bazı benzodiazepinler ve nöroleptikler yüksek lipid çözünürlülüğüne sahip olup bölgeye özgü mekanizmaları doğrultusunda etki ederler. GABA veya dopamin gibi bazı ajanların doğal ligandlarının çok yüksek hidrofilisiteye sahip olduklarından mutlaka sıvı ortamda etkileşmeye girdikleri bilinmesine rağmen, gerçek etki bölgesi sıvı ortamı mı yoksa membranın mı olduğu henüz daha tam olarak bilinmemektedir. Lipofilik

ilâçların

membran

içi

konsantrasyonları

sıvı

ortamdaki

konsantrasyonlarından birkaç bin defa daha yüksektir ve bu gerçek afinite ligand

171

bağlanma deneylerinde her zaman göz önünde bulundurulmaktadır. Bu ilâçların bağlanma afiniteleriyle ilgili farmakokinetik denklemler ve matematik modeller ortaya konulmuş ve uygulanmakta olmasına rağmen bu konu hala yeterince çalışılmış değildir. 2.2.5. Biyomembran Akışkanlığının Anlamı Genel olarak, membran akışkanlığı membran bileşenlerinin çeşitli hareket biçimlerine verilen isimdir. Matematiksel olarak bazı varsayımlardan yola çıkarak 1/viskozite olarak da ifade edilir. Bu hareketler kısaca şunlardır: açil zincirlerinin fleksibilitesi ve esnekliği, membran ekseni istikametinde moleküllerin lateral difüzyonu, bir tek katmandan diğer tek katmana moleküllerin tersine difüzyonu ve lateral faz farklılaşmasıyla sonuçlanan faz değişimleri (phase transitions). Tüm bu olaylar anizotropik hareketler olup ve akışa mukavemet ve izotropik direnç gücü olarak bilinen viskozite ile ifade edilemez. Bu moleküler hareketlerin her biri çeşitli ilâçlar tarafından etkilenmektedir. Daha genel anlamda, bir hayli fazla farmasötik ajanı membranları daha akışkan veya daha düzensiz hale getirmektedir. Bu özellikle lipofilisitesi yüksek olan fenol halkaları içeren heterosiklik yapılarda görülmektedir. Biyomembranın daha akışkan veya daha düzensiz hale gelmesi kuşkusuz membran lipidlerin ve membran proteinlerin

işlevleri

üzerine

tersinir

olmayan

önemli

etkileri

meydana

getirmektedir.

172

Şekil 2.7. Langmuir-Blodgett düzeneklerden genel bir görünüm.

173

Şekil 2.8. DMPE (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-phosphoethanol- amine) fosfolipidin 20°C’deki izotermi. Air-water ara yüzeyinde DMPE monomolecular film (monolayer) olarak ortaya çıkan farklı fazlar gösterir. Görülen plato non-ordered liquid-expanded (LE) fazdan ordered liquidcondensed (LC) faza geçişten ibarettir. Hidrofilik silikon substratına yavaşça transferi esnasında DMPE tek katmanın kondanze olduğu noktada basınç değişimi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir.

174

Şekil 2.9. Langmuir-Blodgett tek katmanlardaki bir fosfolipidin uğradığı faz değişimleri. Tipik bir izoterm gösterilmiştir. Yüzey üzerindeki fosfolipid moleküllerin hareketliliği açıkça gözükmektedir.

Şekil 2.10. Langmuir-Blodgett tek katmanlarda Wihelmy plate ile ölçülen yüzey basınç yönteminin bir görünümü.

175

Şekil 2.11. Farklı Langmuir-Blodgett tek katman ve çok katman düzenekleri.

176

Tek katman ( Bk.: Şekiller 2.7-2.11)39, birtakım organik moleküllerin sıvı ara fazına uygulanmasıyla oluşturulur. Projemde uygulanan fosfolipidler genelde Şekil 2.10 ve Şekil 2.13 gösterildiği şekilde hidrofilik baş kısımları su fazına doğru, hidrofobik kuyruk kısımları ise gaz (hava) faza doğru yerleşir ve tek katman bu şekilde oluşturulur. Söz konusu moleküller su yüzeyine40 ilk olarak uygulandıklarında çok fazla serbestliğe sahip olarak yüksek bir hareketlilik gösterirler. Bu su üzerinde her moleküle düşen alan çok fazladır ve yüzey basınç düşüktür. Bu yüzey basınç genelde sensör sistemine bağlı Wilhelmy palte (Bk.: Şekil 2.10 ve Şekil 2.11) adı verilen düzenekle ölçülür. Yüzeysel basınç

hesaplamalarının

matematiksel

ifadeleri

www.kibron.com, www.ksvltd.com, www.nima.co.uk43,44.

için

özellikle

bk.:

Bu yüzeysel basınç birbirine

karşı hareket ettirilen 2 bariyer sayesinde yükseltilmektedir (Şekiller 2.7-2.11). Yüzey basıncın çok fazla yükselmeye başladığı bir noktaya varılır ki bu lipidin sıvı faza geçişini göstermektedir (Bk.: Şekil 2.8 ve Şekil 2.9). Bariyerlerin birbirine karşı istikamette daha ileri hareket ettirildiklerinde, katı fazın değişikliğe uğradığı, yüzey basıncın daha hızlı bir şekildeki artışından da gözlenmektedir (Şekil 2.8).

Bu bölümde, bu proje raporumu inceleyenlere kolaylık sağlanması amacıyla, fosfolipidlerle oluşturulan tek katmanlarla ilgili çok kısa ön bilgiler verilmiştir. Ancak, fosfolipid yüzey kimya ve kolloid teorileri matematiksel olarak da karmaşık olduğundan, bu konu ile ilgili çok daha ayrıntılı bilgilere ulaşmak için bk.: Ek-13. 40 Projemde elde edilen neticelerin tekrarlanabilirliğini test edilmesi bakımından suya ek olarak 2 ayrı tampon da denenmiştir. 41 Ayrıca Bk.: Ek-13. 42 Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece 39

uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir. 43 44

Ayrıca Bk.: Ek-13. Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece

uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir.

177

Şekil 2.12. Bir reseptörün Langmuir-Blodgett tek katman üzerinde imobilizasyonu. Langmuir-Blodgett tek katmanların farklı düzenekleri yukarıdaki şekillerde gösterilmiştir. Şekil 2.12 ise Langmuir-Blodgett tek katmanların farmakolojik ve biyolojik anlamı çok daha yüksek olan bir düzeneği-bir reseptörün oluşturulan fosfolipid tek katman üzerinde imobilizasyonunu göstermektedir. Bu şekilde imobilize edilen reseptörlerin bunlarla bağlanan ilâç ve diğer ligandlarının bağlanma kinetiğinin ölçülmesinde çok orijinal bir ölçüm imkânı vermektedir. Bu projemde bu boyut amaçlanmamıştır. Çünkü böyle bir düzeneğinin kurulması için ek cihazlara ihtiyaç vardır. Ancak fakültemizdeki bundan sonraki projelerim böyle bir düzeneğin kurulmasını kapsamaktadır. Bu hususlara ayrıntılı olarak Ek-16’da yer verilmiştir.

178

2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında Kullanılan Başlıca Yöntemler45 Günümüzde, biyomembran ve yapay membran modelleri araştırmalarında birçok

fizikokimyasal,

uygulanmaktadır.

moleküler

Bunlardan

biyolojik

fizikokimyasal

ve

biyokimyasal

yöntemler

çeşitli

yaklaşımlar spektroskopik

ölçümlerden ibarettir. Bunlar hem biyomembran, hem model membranlarla gerçekleştirilmektedir. Moleküler biyolojik yöntemler genelde biyomembranların ve membran kanal proteinlerinin cDNA dizilişini ortaya çıkararak voltage-gated iyon kanal ölçümleri veya tek kanal üzerinden geçişi takip eden patch-clamp tekniği gibi yöntemlerin de yardımıyla membran gözeneklerinden gerçekleşen çeşitli iyon geçişlerini hücre kültürleri üzerinde göstererek ortaya koyan yaklaşımlara dayanır. Biyokimyasal yaklaşımlar da buna benzer şekilde membran yapısında yer alan ve araştırılması istenilen makromoleküllerin saflaştırılıp tekrar yapay membran modeline rekonstitüe edilmesine dayanır. Böyle bir in vitro rekonstitüsyon yöntemi biyolojik sistemin in vitro ortamlarda da çalıştırıldığı takdirde incelenen biyosistemin gerçek etki mekanizmasını ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birçok reseptör-ligand bağlanma kinetiğinin ortaya çıkarılması, söz konusu reseptörlerin biyolojik hücreden saflaştırılıp yapay membranlara rekonstitüe edilip ligand bağlanma afinitelerini takibine dayanır. Yapay membran sistemleri genelde üç gruba ayrılır. Bunlardan biyomembranlara ilk yaklaşım olarak lipid monolayer (Langmuir-Blodgett film-bk.: Şekil 2.13-üst kısım) düzeneği geliştirilmiştir. Bu iki boyutlu membran yaklaşımı birçok biyolojik ve farmakolojik etkisi olan moleküllerin model hücre üzerinden intraselüler penetrasyon mekanizması incelenmektedir. Diğer bir iki boyutlu model sistemi ise Black Lipid Membrane (BLM) sistemidir. Bu düzenekte dikey Pt veya teflon plâkaları arasında bulunan boşlukta çift katman oluşturulmaktadır (Bk.: Şekil 2.13-orta kısım ve özellikle Şekil 2.14). Bu yöntem tarihsel olarak büyük önem taşımıştır. Örneğin, ilk membran elektrofizyolojik olayları bu yaklaşımla ortaya çıkarılmıştır. Ancak, bu yöntem çok karmaşık mikroskopik incelemelerini de gerektirdiğinden, son derece deneyimli personelin çalışmasına bağlıdır. Üçüncü yaklaşım ise lipid veziküllerin (lipozomların) kullanımına dayanır (Bk.: Şekil 2.13 alt

45

Bu bölümde projemi inceleyecek olanlara sadece çok kısa ön bilgilerin verilmesi amaçlanmıştır. Biyomembran düzenekleri ile daha ayrıntılı bilgi edinmek için Moleküler Hücre Biyolojisi, Hücre Fizyolojisi ve Biyofizik ders kitaplarına başvurulmalıdır.

179

kısım ve Şekil 2.15)46. Bu veziküller bir üç boyut kazandırdığından, yine üç boyutlu olan doğal hücreye diğer iki model membran sisteminden çok daha iyi bir yaklaşım teşkil etmektedir. Biyomembran incelemelerine geçmeden önce, araştırılmakta olan makromoleküllerin ilk önce saflaştırılmış şekillerinin fizikokimyasal özelliklerinin takip edilmesi gerekmektedir. Bu da çeşitli fizikokimyasal

ve biyofiziksel

yaklaşımlarının önemini vurgulamaktadır. Bunlara aşağıda kısaca değinilmiştir. 2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler 2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler Aşağıda adı geçen spektroskopik yöntemler biyomembran araştırmalarda membran bileşenlerinin yapı ve aktiviteleri ile ilgili bilgilerin elde edilmesinde çok önemli rol oynamıştır. Bu yöntemler hızlı ve invaziv veya destrüktiv değildir. Bu bakımdan bunların tümü fizyolojik ortamlara yaklaşan ve bu sistemleri simüle eden koşullarda uygulanabilmektedir. Ayrıca, bunlarla membranlarda meydana gelen çok hızlı tepkimelerin ve konformasyon değişikliklerinin kinetiğini de incelemek mümkündür.

46

Lipozomlarla ilgili çok ayrıntılı ve güncel bilgilere Ek-9’da yer verilmiştir.

180

Şekil 2.13. Kolloid ve yüzey kimyasal araştırmalarda bir hücre yüzeyini modellemek için kullanılan düzenekler. Sırasıyla Langmuir-Blodgett tek katman (monolayer), Black Lipid Films (BLMs) ve lipozom sistmleri gösterlmiştir.

181

Şekil 2.14. Biyomembran araştırmalarda bir hücre yüzeyini modellemek için kullanılan düzenekler. Çeşitli tek katmanlı ve çok katmanlı fosfolipid düzenekleri gösterilmiştir. Burada özellikle farklı BLM formasyonları vurgulanmıştır.

182

Şekil 2.15. Lipozomların genel yapısı. 2.3.1.2. Difference Spectroscopy Bazı durumlarda belli bir membran kromoforun ve çevresindeki moleküllerin absorbsyon spektrumunda meydana gelen spektral değişikliklerinin söz konusu olduğunda kromoforun tek başına gösterdiği konformasyon değişikliğinden ziyade, tüm toplam spektrumdaki değişikliklerin ölçülmesi daha uygundur. Bu işlem çift-ışınlı spektrofotometre ile yapılmaktadır. Bu yöntemle meydana gelen tepkimelerin kinetiğinin ölçülmesi elektron taşıyıcılarının indirgenme-oksitlenme olaylarına bağlı olduğu gibi, NMR, ESR ve termodinamik yöntemlerinden farklı olarak moleküllerin konformasyonu hakkında çok kısıtlı bilgiler vermektedir. Ancak, bu yöntemi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma afinitesi ve kinetiği hakkında çok önemli bilgiler edinebilinir. 2.3.1.3. Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi Bir titreşim spektroskopisi olan FTIR spektrometresi kompleks oluşumu esnasında tepkimeye giren biyomakromoleküllerin sekonder yapıları hakkında çok önemli bilgiler vermektedir. Tepkimeye giren fonksiyonel gruplar

183

hakkında çok önemli bilgiler de vermektedir. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Electron Spin Resonance (ESR) veya Floresans Spektroskopisi vb. gibi yöntemlerin aksine çok fazla örneğe gereksinim duyulmadığı bu ölçüm yöntemi ayrıca da çok hacimli etiket moleküllerinin de katılmasını gerektirmemektedir ve “scattering”’ten kaynaklanan artefaktlar da burada engellenmektedir. Ayrıca, FTIR spektrometresi katı ve sıvı fazda bulunan örneklerle çalışma fırsatı da sunmaktadır. 2.3.1.4. Raman Spektroskopisi Bir titreşim spektroskopik yaklaşımı olarak bu spektroskopik yöntem moleküllerin iradyasyonunu takiben gözlenen moleküler titreşimlerin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu yöntem, örneğin kolesterolün fosfolipid jel-sıvı kristal faz geçişi üzerindeki etkisinin araştırılmalarında uygulanmaktadır. Raman spektroskopisi ayrıca Fe-S taşıyan proteinlerde (örneğin transferinde) Fe-S karşılıklı etkileşmeleri veya hem proteinlerdeki porfirin-protein etkileşmeleri, veya çeşitli organik moleküllerinde (örneğin, karotenoidler, vitaminler, antibiyotikler, steroidler ve polisakkaridler) C-C titreşimleri ile ilgili çok önemli bilgiler vermiştir. 2.4. Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi Monomoleküler

katmanların

(tek

katmanların

veya

monolayer’ların)

incelenmesi, membranda yer alan bileşenlerin hakkında çok önemli yapı-aktivite bilgilerini verdiği gibi, monolayer yüzeysel basıncı, incelenmekte olan molekülün lipid tek katmanda işgal ettiği moleküler alanı, bu moleküler alanın yüzeysel basınç üzerindeki etkisi hakkında da bilgiler vermektedir. Bu düzenek böylece molekülün biyomembran yüzeyinde ve hacminde nasıl paketlendiği konusunda da bilgiler vermektedir.

Bu

yaklaşım

böylece,

yeni

farmakolojik

ajan-biyomembran

etkileşmelerinin yeni modellerinin de geliştirilmesinde katkıda bulunmaktadır. Membran ortamında başka maddelerle karışım içinde bulunan bileşiklerin karışımdaki tek tek özelliklerini, stereokimyasını ve etkileşme enerjilerini, suda çözünen bileşiklerin lipidlere karşı gösterdikleri afinitelerini de ortaya çıkarmak mümkündür. Monolayer yöntemi çok katmanlı oriente edilmiş (oriented multilayers) sistemlerinin ve içeriği ve topolojisi önceden belirlenen membran sistemlerinin oluşumunun temelini oluşturmaktadır. Monolayer yöntemini ayrıca daha pratik amaçlarla,

örneğin

uygulamalarda

ve

ortam son

saflılığının

yıllarda

tayininde

kemosensör

ve

ve

kontrolünde,

biyosensör

ekolojik

teknolojisinde

184

mikroçiplerin

orientasyonu

ve

toplaşımı

için

mikroelektronik

sanayide

de

kullanılmaktadır. Gaz-sıvı sınırında oluşan yüzeysel basınç veya pozitiv serbest enerji yüzeyler arasında bu sınırın oluşturulmasının temelini teşkil etmektedir. Bu gibi yüzey sınırlarının yüzeysel basıncı γ; γ=∆F/∆S olarak ifade edilir. Burada ∆F-serbest enerjinin değişimi, ∆S ise – yüzey alanının değişimidir. Yüzeyler arasında oluşan serbest enerjinin ortaya çıkmasını sıvı moleküllerinin hacimsel olarak (sub-phase) fazlar arasındaki sınıra taşınmaları için yapılan işe benzetilebilir. Bu taşınımın gereksinimi, ara fazda (subfazda) belli bir molekül üzerinde diğer moleküller tarafından uygulanan ve etkili olan güçlerin kompanse edilmeleri, yüzeyler sınırında bulunan bir moleküle ise sadece subfaz tarafından çekim güçlerinin etkili olduğundan ortaya çıkmaktadır. Yüzeyler arasındaki kompanse olmayan güçlerin katmandaki derinlikleri su moleküllerin etkileşme özelliklerine göre tayin edilir. Çeşitli iyonların yokluğunda, söz konusu güçler Van der Waals etkileşme güçleridir ve bunların intansitesi moleküller arasında mesafenin x7 oranında propoprsiyonel olarak azalır. Böylece, kompanse edilmeyen etkileşmelerin alanı veya bölgesi birkaç molekül çapından fazla değildir. Gibbs denklemine göre, faz ayrımındaki adsorpsyonu için yüzeysel dansite parametresi şu şekilde ifade edilir: Γ=-[a/(RT)].(δγ/δa). Burada Γ – maddenin yüzeysel dansitesi, a –subfazda maddenin aktivitesidir. Eğer maddenin yüzeyler arasında birikirse, o zaman δγ/δa negativtir, çünkü örneğin lipidler için yüzey arasındaki adsorpsyon ölçülebilen yüzeysel basıncın düşmesine neden olmaktadır. Bu durumda γ0-γ farkı (burada γ0-“saf” su yüzeyinde oluşan yüzeysel basınçtır; γ-örneğin lipid için yüzeyler arasında adsorbsyonundan

185

sonra oluşan yüzeysel basınçtır) adsorbe edilmiş plâkanın yüzeysel basıncı olarak tayin edilir. Faz sınırlarında oluşan tek katmanın yüzeyinde ortaya çıkan basıncın yüzeysel basınca eşit olduğu bir plâka olarak da tasavvur edilebilinir: YB= γSu-γçözelti Burada YB-yüzeysel basınç; γSu ve γçözelti – suyun ve çözeltinin yüzeysel gerilimleridir.

2.4.1. Yüzeysel Gerilimin Wilhelmy Plate Yöntemiyle Ölçülmesi Yüzeysel gerilimin ölçümlerinde su veya sıvı çözeltilerinin yüzeyine dik dörtgen şeklinde küçük bir plâka temas ettirilmektedir. Bu plâka, organik çözeltilerin önceden belli bir muameleyle uzaklaştırıldığı plâtin malzemesinden üretilir. Ancak, bunun yanı sıra, cam ve diğer malzemeler de ölçüm amacına göre kullanılmaktadır. Faz ayrımının sınırında bu plâkaya yüzeysel gerilim kuvvetleri etkilidir (Şekil 2.16).

Şekil 2.16. Langmuir-Blodgett tek katmanlarda Wihelmy plate ile ölçülen yüzey basınç yönteminin bir görünümü. Bu şematik çizim daha önce verilen Şekil 2.10.’a dayanmaktadır.

186

Bu kuvvetler sayesinde plâkanın sıvı yüzeyine teması sağlanmaktadır ve bu kuvvetin şiddetini mekanik kuvveti elektrik sinyaline dönüştürebilen ve mekanotron adı verilen bir cihazla ölçülmektedir (Şekil 2.19). Plâkanın ölçülen kütlesi şu şekilde tayin edilir:

wtoplam = wplâka+γ.cosθp, Burada γ-çözeltinin yüzeysel gerilimi; p-plâkanın boyutu; wplâka – plâkanın gerçek kütlesi. Yüzeyler sınırında çok az miktarda maddenin uygulandığında, γ çözelti veya su subfazının yüzeysel gerilimine eşittir. Yüzeyler arası ayrımının alanının azaldığında, wtoplam düşmektedir.

2.4.2. Lipid Tek Katmanların Özelliklerinin İzoterm Yöntemiyle İncelenmesi 2.4.3. Sub-fazda madde-lipid etkileşmelerinin incelenmesi ve lipid moleküllerinin işgal ettikleri alanın ölçülmesi Tek katmanın en önemli parametresi lipidin moleküler alanıdır (A.). Diğer bir değişle bu bir molekülün işgal ettiği alandır. Kondanze olan katmanlardaki A değerin tayini çift koordinatlı potansiyometre ile ölçülen yüzeysel basınç – tek katman alanı ilişkisini x-eksenine yerleştirilmesiyle ekstrapolasyonuna dayanmaktadır. Böylece, monolayer yöntemi ile bir tek katmanda lipidin işgal ettiği alanı ve kesitini hesaplamak mümkündür. Bu çok önemli bir bilgidir, çünkü doğrudan doğruya doğal biyolojik hücre membranında çeşitli makromoleküllerinin nasıl paketlendiğini göstermektedir. Fosfolipidler için söz konusu kesit lipidin baş kısmının türü ve içerdiği doymuş veya doymamış yağ asitlerin oranına bağlı olarak değişmektedir. Tek katmanın

187

bileşenleri arasındaki etkileşmelerinin spesifikliği ve ayrıca da moleküllerin hidrofil kısmı ile subfazın A değerini etkilemektedir. İyonlar ve subfaz moleküllerinin suya etki ettikleri ve sınır bölgesindeki katmanda lipid baş gruplarının paketlenmelerini de etkiledikleri bilinmektedir. 2.4.4. Tek Katmanda Yer Alan Maddeler Arasındaki Etkileşmelerinin İncelenmesi Bu yaklaşımda, tek katmanın oluşturulmasında kullanılan ve incelenmekte olan maddeden çeşitli oranlarda hazırlanan madde-lipid örnekleriyle seri şeklinde birkaç izoterm ölçümü yapılır. Elde edilen neticelerden, karışımda yer alan Adeğerinin konsantrasyonu Mol (M) olarak ifade edilen madde içeriği arasındaki ilişki diyagram çizilir. Bu diyagramın bir örneği Şekil 2.17 gösterilmiştir. Bu diyagramlar kolesterol ve diheksadesilfosfatidilkolin ile oluşturulan tek katmandaki kompleks oluşturmaları hakkında bilgiler içermektedir. Ancak bu şekildeki eğriler başka biyolojik veya farmakolojik aktiviteye sahip bir makromolekülün fosfolipid membranla oluşturduğu bir kompleks için de geçerlidir.

188

Şekil 2.17. Polikremnik asidin varlığında diheksadesilfosfatifilkolin ile kolesterol arasında etkileşmeler: I-Kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin tek katmanın izoterm’i: 1-kolesterol; 10-diheksadesilfosfatifilkolin; 5-kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin 1:1 oranında karışımı; 8-kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin 2:8 oranında karışımları. Diğer oranda hazırlanan karışımlar arada izoterm eğirleri olarak gösterilmiştir. II. Tek katman içeriğine bağlı olarak karışımlarının tek katmandaki moleküler alanın değişmesi: 1-SiO2 grupların varlığına dayanarak 5 mM konsantrasyonundaki polikremnik asidin varlığında; 2-polikremnik asidin yokluğunda; 3 ve 4-karışım olarak oluşturulan tek katmanların aditiv moleküler alanlar (additive molecular areas). 1:1 ve 4:1 stokiometriye sahip kompleksler adı geçen maddelerin varlığında meydana gelir, ancak subfaz’a polikremnik asidin katıldığında sadece 1:1 stokiometriye sahip kompleksler oluşur. 2.4.5. Tek Katmanlarda Maddelerin Karışım Oluşturma Özelliklerinin İncelenmesi Bir tek katmanda iki bileşiğin karışım oluşturma özelliklerinin tayininde faz kuralı (the phase rule) uygulanmaktadır. Basıncın ve sıcaklığın veya ortam ısısının sabit olması koşuluyla izotermler çizilir. Ancak, bu yöntem daha çok malzeme bilimcileri tarafından uygulandığından ve biyolojik önemi pek olmadığından, bu

189

yaklaşım projemizde öngörülmemiştir. Söz konusu yaklaşım, çözünürlükleri hakkında bilgi bulunmayan iki ayrı maddenin biyolojik ortamda tek katmandaki karışım oluşturma özelliklerinin tayininde uygulanmaktadır. Birçok düzenekte olduğu gibi, projemde hem Taxol®’un, hem de kullandığımız fosfolipidlerin karışım oranları önceden tasarlanmıştır. 2.4.6. Tek Katmanlarda Bulunan Moleküllerin Yapısal Değişikliklerinin İncelenmesi Lipid tek katmanlarının izoterm eğrilerinde yüzey sınırında yer alan moleküllerinin oriyentasyonlarındaki değişikliklerinin göstergesi olan yapısal değişikliklerinin de görmek mümkündür. Uzun hidrokarbon zincirin ucunda iki hidrofil grubu içeren moleküller için örneğin floresan işareti olarak yoğun kullnılan 16 (9-antroiloksi)-palmitik asidin durumunda olduğu gibi, bu lipid ile oluşturulan tek katmanın kondanze olmasıyla, ölçülen izoterm eğrisinin türevinin (slope) de değiştiği bilinmektedir. Söz konusu değişiklik, oluşan yüzey sınırında bu işaretin hidrofil gruplarından biri olan COOH grubunun yer değiştirmesi ve tüm molekülün tek katmandaki konformasyonunun hareketliliği ile açıklanmaktadır. Yüzey basıncın düşük olduğu durumlarda, bu molekül yüzey sınırında su ile en uçtaki COOHgrubunun ve antranil döngüsüne komşu olan CO-grubunun temas yapacak şekilde yerleşir. Bu yaklaşım, özellikle Langmuir-Blodgett tek katman ve floresan mikroskopik araştırmalarında yoğun olarak uygulanmaktadır (Şekil 2.18).

190

Şekil 2.18. Çeşitli lipidlerin tipik π-A izoterm eğrileri. 2.4.7. Tek Katmanın Sabitlilik ve Deformasyon Özelliklerinin Hesaplanması Tek katmanların lateral kompaktizasyonu parametresi c=-(1/A)(δA/δπ)T olarak ifade edilir. Söz konusu hesaplar için bu sabitin resiprokal veya tek katmanın Gibbs deformasyonu da kullanılır: E=-A(δπ/δA)T. 2.4.8. İzoterm Şekillerinin Analizi ve Yorumlanması Farklı lipidlerin tek katmanları için ortam ısısını belli sınırlar içinde değiştiği koşullarda elde edilen izotermlerde bir plato’nun oluştuğu görülmektedir: Alan (A) değerinin azalmasıyla yüzeysel basınç değeri hafifçe yükselmektedir. Elde edilen izoterm eğrilerden biyolojik anlamı çok yüksek olan, bir molekülün modellenen bir 191

hücre yüzeyinde nasıl paketlendiğini gösterir. Bu da, ilâç-hücre etkileşmelerin araştırmalarında çok önemli bilgiler vermektedir.

Şekil 2.19. Bir Langmuir-Blodgett tek katman cihazının şematik şeması. Bu cihazlarla ve çalışma prensibiyle ilgili olarak daha detaylı bilgi için bk.: www.langmuir.com veya www.nima.co.uk. Ayrıca bk.: Ek-12 ve Ek-13.

2.4.9. Projemdeki Deneysel Tasarım 2.4.10. Projemde Geliştirilen Yeni Deneysel Protokol 2.4.10.1. Kimyasallar. Tüm fosfolipidler Sigma Chem. Co., MI (A. B. D.) veya alt birimlerinden veya Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, A. B. D.)’den satın alınmıştır. Özellikleri çok farklılık gösterdiğinden, bu özellikleri test etmek amacıyla Paclitaxel™ çeşitli kaynaklardan alınmıştır47. Tüm kimyasallar en yüksek kalitede ve saflıkta alınmıştır. Kloroform (≥99.8%; HPLC grade) ve etanol (≥99.9%; HPLC grade) kullanılmıştır. Tüm deneylerde kullanıma hazır olarak satılan ve rezistansı 18.2 MΩ olan Milli-Q saf su kullanılmıştır.

47

Bk.: Ek-18

192

2.4.10.2. Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması. Langmuir-Blodgett cihazı NIMA Technology Ltd (The Science Park, Coventry CV4 7EZ, İngiltere; Model 112D) ürünüdür48. Bu cihazı üreten diğer firmalara49 nazaran NIMA Technology Ltd.’in piyasaya sürdüğü son derece popüler ve çok amaçlı modeller50 ve özellikle de bu firma temsilcilerinin tarafımıza yapmış olduğu çok düşük fiyat teklifleri bu firma ürününün alınmasında rol oynamıştır. Söz konusu cihazın teknik özellikleri Ek-12‘de verilmiştir. Bu cihaza diferansiyel taramalı mikrokalorimetre (DSC), Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektpmetresi ve Floresan Mikroskopi sistemlerinin de uygulanıyor olabilmesi son derece önemlidir ve çok yönlü ölçümlerin yapılmasını mümkün kılmaktadır. Söz konusu cihaz 40 cm2 esas alanı, 2 elektromekanik olarak hareket ettirilen bariyer, yüzey basınç sensörü, inverted mikroskopisi için sapphire pencere sistemi, dipper mekanizması ve bilgisayara bağlı software versyon 5.16 içermektedir. Tek katmanların yüzeysel temizliliği kriteri olarak bariyer testi uygulayarak 3 ayrı tekrardan elde edilen izotermler arasındaki farkın ±0.1 mN/m’den daha fazla olmamasına dayanmaktadır. 2.4.10.3. Yüzey basınç-alan (π-A) izotermler. Tek katmanlar air-water (hava-su ara sınır) ara yüzeye kloroformu çözücü olarak kullanarak uygulanmıştır. Fosfolipidler ve Paclitaxel™ stock çözeltileri ilk önce ekvimolar (1:1) 0.2 mM’ lık konsantrasyonlarda hazırlanmıştır. Daha sonra, bunlardan istenilen oranlarda karışımlar hazırlanmıştır. Her uygulamadan önce Hamilton şırıngası 3 kez kloroform ile yıkanmıştır. Bunu takiben ara yüzeye birkaç damla örnek uygulanmıştır. 10 dakika solvent evaporasyonu için beklendikten sonra, yüzey basınç-alan (π-A) izotermleri elde edilmiştir ve kaydedilmiştir. Neticelerin tekrarlanabilirliği bakımından güvenilir olup olmadıkları en az 3 tekrar yaparak değerlendirilmiştir.

48

Bk.: Ek-11 ve www.nima.co.uk. Kibron Ltd (www.kibron.com) ve KSV Ltd. (www.ksvltd.com)-Helsinki, Finlandiya. 50 Bk.: Ek-11. 49

193

2.4.10.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri. Lipid vezikülleri ilk önce geleneksel ince tabaka film (thin-film) yöntemine göre hazırlanmıştır. Bunun için, lipid ve Paclitaxel stock çözeltileri kloroform ile hazırlanıp, bunlardan istenilen miktarlar balon jojelere aktarılmıştır. İyi bir karışım elde etmek için bunlar vortekslenip, gaz N2 ile solvent evaporasyonu uygulanmıştır. Böylece balon jojenin iç cam yüzeyine ince tabaka lipid film oluşturulmuştur. Bu film gece boyunca vakum desikatör ile muamele edilmiştir ve böylece son kloroform kalıntı miktarları da uzaklaştırılmıştır. 1ml saf su veya adı geçen tampon ile balon jojeye aktarılıp 1 dakika boyunca vortekslenmiştir. Balon joje daha sonra söz konusu lipidin faz değişim ısı noktasından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanan sonikatörde tutulmuştur. 5-10 dakikalık bir süreyle sonikasyon uygulanmıştır. Daha sonra bu balon joje shaking su banyosuna 37°C’de 1 saat boyunca bırakılmış ve böylece iyi bir ilâç-lipid karışımı hazırlanmıştır. DSC ölçümleri Perkin-Elmer Pyris Marka DSC cihazı ile Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında yapılmıştır. Referans olarak hermetik kapanabilinen boş alüminyum kaplar kullanılmıştır. Lipid konsantrasyonu olarak 20 mg/ml kullanılmıştır ve bundan 10 µl lipozom süspansyonu hermetik alüminyum kaplara konulmuştur ve bunlar böylece kapatılmıştır. Termogramlar gösterilen sıcaklık aralığında elde edilmiştir. 2.4.10.5. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında yapılmıştır. Bu ölçümlerde tüm spektrum çekimleri ve direkt ölçüm yöntemi uygulayarak gerçekleştirilmiştir. Esas

Langmuir-Blodgett

tek

katmanla

gerçekleştirilen

yüzey

basınç

ölçümlerine geçilmeden önce FTIR ve DSC ölçümleri yapılmıştır. Bunun için uluslararası standartlara uyulmuştur. Bu yaklaşımlar uyarınca ilk önce bir formülasyonunun

ön

fizikokimyasal

özellikleri

iyi

bir

şekilde

incelenmesi

gerekmektedir. Bununla ilgili deneysel tasarımlar aşağıdaki Tablo-2.2’de verilmiştir. Projemde de bu hususlar aynen uygulanmıştır. Bu doğrultuda, ilk önce Paclitaxel™fosfolipid kompleks oluşumunun ön termal ve spektrometrik incelenmesi yapılıp tek katman ölçümlere geçilmiştir.

194

Tablo-2.2. Ön formülasyonlarda öngörülen fizikokimyasal incelemeler*,51.

*(Kaynak: Pharmaceutical Preformulation and Formulation. A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. Mark Gibson (Ed.), Interpharm/CRC, Boca Raton Fl, 2004, pp. 23).

51

Önformülasyonlar hakkında özellikle bk.: Pharmaceutical Preformulation and Formulation. A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. Mark Gibson (Ed.), Interpharm/CRC, Boca Raton Fl, 2004.

195

3. BULGULAR

196

3.1. FTIR Ölçümleri

197

Şekil

3.1.

L-α-Fosfatidilkolin’in

toplam

kızılötesi

(IR)

spektrumu.

198

Şekil 3.2. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:2 oranındaki kompleks oluşumu.

199

Şekil 3.3. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:3 oranındaki kompleks oluşumu.

200

Şekil 3.4. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:5 oranındaki kompleks oluşumu.

201

Şekil 3.5. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:7 oranındaki kompleks oluşumu.

202

Şekil 3.6. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:10 oranındaki kompleks oluşumu.

203

Şekil 3.7. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ tüm karışımlarınnın üst üste getirildikten sonra görünen toplam IR spektrumları.

204

Şekil 3.8. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar kompleksi. Toplam IR spektrumu verilmiştir.

205

Şekil 3.9. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar kompleksi. 700-1500 cm-1 IR aralığı verilmiştir.

206

Şekil 3.10. Fosfatidilkolin’in toplam IR spektrumu. Farklı cihaz kullanıldığından Şekil 3.1. ile kıyaslanmalıdır.

207

Şekil 3.11. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar (1:1) karışımı. Üstte fosfatidilkolinin tek başına IR spektrumu verilmiştir. Taxol® ile 1:1 kompleksi ise aşağıdaki IR spektrumudur. 208

Şekil 3.12. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar (1:1) karışımının toplam IR spektrumu.

209

Fig. 3.13. Fosfatidilkolin-Mg2+ ikili bileşenlerinin IR absorpsiyon spektrumları.

210

3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Ölçümleri

211

Şekil 3.14. Kontrol olarak Fosfatidilkolin’in tek başına çekilen termogramı. Temodinamik parametreler termogram üzerinde belirtilmiştir.

212

Şekil 3.15. 1.28% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram üzerinde belirtilmiştir.

213

Şekil 3.16. 10% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram üzerinde belirtilmiştir.

214

Şekil 3.17. 16% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram üzerinde belirtilmiştir.

215

Şekil 3.18. 20% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram üzerinde belirtilmiştir.

216

Şekil 3.19. Kontrol olarak Paclitaxel™’in termogramı.

217

3.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri

163

Şekil 3.20 Hava-su (air-water interface) ara yüzeyinin kirliliĝi.

164

Şekil 3.21 Yüzey kirliliĝinin giderilmesi.

165

Şekil 3.22: Yüzeydeki kirliliğin giderilmesi.

166

Şekil 3.23. Yüzeydeki kirliliğin giderilmesi. Basıncın aşamalı olarak düşürülmesi kirliliğin giderilmesinin işaretidir.

167

Şekil 3.24. Yüzeydeki parçacıklardan kaynaklanan kirliliğin giderilmesi. Basıncın aşamalı olarak düşürülmesi kirliliğin giderilmesinin işaretidir.

168

Şekil 3.25. Yüzeydeki toz ve parçacık kirliliğinin giderilmesi.

169

Şekil 3.26. Yüzeydeki parçacık ve ortam kirliliğinin giderilmesi.

170

Şekil 3.27. Ölçüm öncesi elde edilen son derece temiz ortamın göstergesi. Basınç “0”’ra çok yakın bir değerdedir.

171

Şekil 3.28. 0.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in konsantrasyon profilleri. Konsantrasyonlar yukarıya doĝru iki misli artırılmıştır. Ölçümler için en yukarıdaki konsantrasyon esas alınmıştır.

172

Şekil 3.29. Kontrol olarak 0.2 mM Taxol®’un tek başına çekilen yüzey basınçAlan (π-A) izotermi.

173

Şekil 3.30. DPPC-Taxol®’un 1/5 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

174

Şekil 3.31. DPPC-Taxol®’un 1/4 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

175

Şekil 3.32. DPPC-Taxol®’un 1/3 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

176

Şekil 3.33. DPPC-Taxol®’un 1/2 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

177

Şekil 3.34. DPPC- Taxol®’un 1/1 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

178

Şekil 3.35. DPPC- Taxol®’un 1/3 (alt) ve 1/1 (üst) karışım izotermlerinin karşılaştırılması. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

179

Şekil 3.36. DPPC- Taxol®’un 1/3 ¼ 1/5. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

180

Şekil 3.37. DPPC- Taxol®’un ½ karışımın alan başına molekül (Area/molecule) olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

181

Şekil 3.38. DPPC- Taxol®’un 1/3 karışımın alan başına molekül (Area/molecule) olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

182

Şekil 3.39. DPPC- Taxol®’un 1/5 karışımın alan başına molekül (Area/molecule) olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

183

Şekil 3.40. DPPC- Taxol®’un 1/3 vs ¼ karışımın alan başına molekül (Area/molecule) olarak elde edilen izotermlerin karşılaştırılması. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

184

Şekil 3.41. 1/3 vs ¼ oranında hazırlanan DPPC-Taxol® karışımları. Karışımlar önceden Eppendorf tüplerde hazırlanarak bu şekilde uygulanmıştır.

185

Şekil 3.42. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/8 oranındaki π-A izotermi, kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

186

Şekil 3.43. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/4 oranındaki izotermi, kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

187

Şekil 3.44. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/2 oranındaki izotermi, kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

188

Şekil 3.45. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/2 oranındaki izotermi, kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

189

Şekil 3.46.Saf yüzey sinyalinin elde edilmesi.

190

Şekil 3.47. Yüzeyin saflık testi. Son derece temiz bir yüzey elde edilişinin kanıtı.

191

Şekil 3.48. 0.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in π-A izotermi.

192

Şekil 3.49. o.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in kırılma noktasi ve geriye doĝru izotermi.

193

Şekil 3.50. 1/8 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

194

Şekil 3.51. 1/8 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

195

Şekil 3.52. Taxol®-DPPC 1/8, 1/6, 1/4, 1/2 ve 1/1 (en alt) oranlardaki izotermleri. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır. Düz çizgiler ekstrapolasyonu göstermektedir.

196

Şekil 3.53. 1/6 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

197

Şekil 3.54. Her deneyden önce elde edilmesi gereken yüzey saflıĝı sinyali. Bu saflık sinyalinin gayet iyi olmasından, diĝer ölçümlere geçilebilmektedir.

198

Şekil 3.55. Saf yüzey sinyalinin elde edilmesinden sonra, esas ölçümlere geçilmeden önce, ilk önce dipalmitoylfosfatidilkolin (DPPC)’in uyumlu izotermi bu şekilde olmalıdır.

199

Şekil 3.56. Dipalmitoylfosfatidilkolin (DPPC)’in kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

200

Şekil 3.57. Taxol®-DPPC (1/4) kompleksin bu konsantrasyondaki yüzeysel basınç (π-A) izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

201

Şekil 3.58. Taxol®-DPPC (1/4) kompleksin bu konsantrasyondaki kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

202

Şekil 3.59. Taxol®-DPPC (1/2) oranındaki kompleks oluşumunun yüzeysel basınç izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

203

Şekil 3.60. Taxol®-DPPC (1/2) kompleksin bu orandaki kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

204

Şekil 3.61. Taxol®-DPPC ekvimolar (1/1) oranındaki kompleks oluşumunun yüzeysel basınç izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

205

Şekil 3.62. Taxol®-DPPC ekvimolar (1/1) kompleksin bu orandaki kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

206

4. TARTIŞMA Bu projemde, çok etkili bir antikanser ilâcı olan Taxol® (Paclitaxel) ile model membran fosfolipidler arasında oluşan moleküler etkileşmeler ele alınmıştır103. Bu konu ile ilgili elde edilecek olan bulgular, daha sonraki aşamalarda yeni ve özellikleri iyileştirilmiş kemoterapötik formülasyonlarının geliştirilmesini mümkün kılacaktır. Bu doğrultuda Taxol® ile tümör hücre zarı arasında meydana gelen etkileşmelerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun için tümör hücre yüzeyi Langmuir-Blodgett tek katman ve fosfolipid yüzeyleriyle modellnmiştir. Bu ölçümlerden elde edilen yüzey kimyasal parametrelerine dayanarak daha sonra in vivo ortamda ilâç-hücre etkileşim modellerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Projemde deneysel tasarım olarak ilk önce ön fizikokimyasal inceleme yapılmıştır. Bunun bilimsel dayanakları ve gerekçelri Tablo-4.1.’de verilmiştir. Ayrıca da, bundan önce sunduğum ara raporlarda da bu hususların önemi vurgulanmıştır. Bu doğrultuda, FTIR spektroskopik ve DSC termodinamik ölçümleri yapılmıştır. Bu cihazların Fakültemizde bulunmaması sebebiyle söz konusu ölçümler yeni kurulan Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi Laboratuvarında yapılmıştır. 4.1. FTIR Ölçümleri FTIR

spektroskopisi

fosfolipidlerle

bağlanmasını

takiben

Taxol®’un

morfolojisinin değişip değişmediğini ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Bunun özellikle yüksek ilâç konsantrasyonlarda ilginç olacağı düşünülmüştür. İlâcın katı fazdaki (solid state) özelliklerinin kontrol edilmesi günümüzde farmasötik endüstrinin başlıca amaçları arasında gösterilmektedir. Birçok ilâcın kendisine ait farklı katı fazına bağlı olarak farklı uygulamaları söz konusudur. Bazen, bir ilâcın sudaki veya başka çözücülerdeki çözünürlülüğü ilâcın hidrasyon seviyesi gibi katı fazdaki özelliklerine bağlıdır. Ayrıca bir ilâcın sabitliliği (stabilitesi) bu ilâcın morfolojik olarak birkaç farklı şekil arasında gösterdiği dönüşümüne bağlıdır. Bu bakımdan, ilâcın katı faz kontrolleri ve karakterizasyonları önemlidir. Bu, özellikle Taxol® için geçerlidir. Bu ilâç, karmaşık organik bileşen olup birkaç katı faz yapısı göstermektedir (Bk.: Şekil 1.26). 4 farklı morfolojik şeklinden 3’ü-dihidrat, anhidrid 103

Projenin amacı ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bk.: Bölüm-2: Gereç ve Yöntem.

207

ve amorf şekilleri sabittir (Şekil 4.1). Projemde de, fosfolipidlerle tanınmasını (recognition) takiben Taxol®’daki morfolojik değişikliklerinin meydana gelip gelmediği konusu ele alınmıştır. Kızılötesi (IR) spektroskopisi katı fazların incelenmesi için çok uygun bir yaklaşımdır,

çünkü

ölçümler

için

incelenen

maddenin

çok

az

miktarını

gerektirmektedir. Bu projemde, FTIR spektroskopisi fosfolipidlerle tanınma olayından sonra Taxol®’un meydana gelen morfolojik şekillerin incelenmesi için uygulanmıştır. Elde edilen bulgular Şekil 3.1-3.13’te gösterilmiştir. Şekil 3.2-3.7 gösterildiği üzere, daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, Taxol®’un amorf şeklinin anhidrid şekline dönüştüğünü göstermektedir. Şekil 3.1. 500 ile 4000 cm-1 aralığında L-α-fosfatidilkolinin tüm IR spektumunu göstermektedir. 15’e yakın frekans bandı bu fosfolipid yapısıyla ilgili önemli spektral ve bilgiler vermektedir (Bkz.: ayrıca Tablo-4.1). Bunların en önemli olanları CH titreşimlerine ait olan 2750-3100 cm-1 ve CH2 wagging progression ve CH2 makaslama titreşimlerini kapsayan 1150-1400 cm-1 ve 1465-1475 cm-1 (PEVSNER ve DIEM, 2003). Bunlardan ilki lipid açil zincirlirindeki konformasyonel düzen hakkında, diğer ikisi ise açil zincirlerinin paketleme etkileri hakkında önemli bilgiler vermektedir. 1258 cm-1 görülen ve PO2- titreşimlerine ait karakteristik frekans burada 1242 cm-1 ‘de görülmektedir. Aradaki 16 cm-1’lik fark kalan su etkileriyle açıklanmaktadır104. Taxol® 1600-1750, 1180-1300 ve 630-770 cm-1 büyük IR bandlarına sahiptir (Bk.: Şekil 3.7, Şekil 4.1 ve Tablo 4.1). Çok küçük kaymalar dışında, tüm bu bandlar ilâç-fosfolipid spektrumlarında da mevcuttur. Bu da, söz konusu bu komplekste Taxol®’un bulunduğunu ve lipidle bağ oluşturduğunu göstermektedir. Tek başına lipidin spektrumu ile ilâç-fosfolipid spektrumları karşılaştırıldığında (Şekil 3.1 ile Şekil 3.7) Taxol®’un 1736 cm-1’daki karbonil stretching titreşimi hafifçe 1732 cm-1’ ye

104

Bu konu ile ilgili çok daha ayrıntılı bilgi Nanomedicine dergisine sunduğumuz makalemizde bulunmaktadır.

208

gitmektedir ki bu da ilâç ile fosfolipid arasında kompleks oluştuğunun bir başka kanıtıdır. Bu, her yeni ve daha yüksek ilâç konsantrasyonlarının kullanıldığında (Şekil 3.2-3.7; Karbonil IR bandı 1736 cm-1’den→ 1707.39 cm-1’ye kaymaktadır) da görülmektedir. Ayrıca, 3300-3500 cm-1’deki güçlü bandlar H-bağlarla bağlı olan OH gruplarına aittir. 2880-3000 cm-1’deki karakteristi 2 band ise çok tipik bir fosfolipid –CH ve –CH2 gruplarına aittir. İlâç ile fosfolipid arasında kompleks oluşmasını takiben, söz konusu bandların intansitesinde önemli düşüşlerin olduğu ve ek band kaymalarının meydana geldiği görülmektedir (Bk.: Şekil 3.1-3.7). Söz konusu hidroksil bandları 3424 cm-1’den→ 3512 cm-1’ye kaymaktadır. Fosfolipid –CH ve – CH2 gruplarına ait bandlar ise gittikçe yükselen Taxol® konsantrasyonlarda tamamen yok olmaktadır (Bk.: Şekil 3.7). İlâcın tek başına ve fosfolipid kompleksindeki IR spektrumları kıyaslandığında, 1647 cm-1’dekiC=C ve C=C’un shoulder yok olmakta ve pik hafifçe daralmaktadır. Bu muhtemelen ilâç ile bağ yapması neticesinde, fosfolipid tarafından alınan konformasyonlarda bir kısıtlamanın meydana geldiğinin işaretidir. Bu da, Taxol®’un esnkeliğinde (flexibility) bir düşüşün olduğunun göstergesidir. Ancak, bu bölgede henüz daha açıklanmayan ilâç yapılarının meydana gelebileceğini de göstermektedir. Bu durumda, bu spektrum bölgesindeki değişikliklerden yola çıkarak çok sağlıklı bir aypabilmek için “ağı su” (D2O) FTIR ölçüm yöntemi uygulanmalıdır105. Sonuç

olarak,

projemde

kullanılan

KBr

tablet

yöntemindeki

suyun

uzaklaştırılması sonucu ilâç ile fosfolipid arasında kompleks oluşmasında genelde fosfolipidin –CH ve –CH2 grupları ve H-bağlı yüzey OH grupları önemli ölçüde rol oynamaktadır. İlâcın da PO2-, C=O, C=C ve CH2 grupları da bağ oluşumunda yer almakatdır. Taxol® ile fosfolipid arasındaki kompleks oluşumundan sonra hidroksil bandların değişikliğe uğraması, önceden varolan H-bağların koptuğunu ve bu da ilâçlipid kompleksinin oluştuğunun yeni bir kanıtı olarak kabul edilebilmeltedir. Şekil 3.13. biyolojik önemi çok büyük olan lipid-metal katyon kompleks oluşumunu göstermektedir. Burada metal katyonlar membran akışkanlığını tetikleyen faktörler olarak incelenmiştir. Görüleceği üzere, Mg2+ ‘un sırasıyla fosfat, Bu konunun önemi için Bk.: Helene Gaussier, Thierry Lefevre, and Muriel Subirade, Binding of Pediocin PA-1 with Anionic Lipid Induces Model Membrane Destabilization. Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2003, Vol. 69, No. 11, 6777–6784. 105

209

karbonil ve CH2 titreşimlerine etkilerini daha iyi bir şekilde yansıtılması amacıyla üç ayrı IR spektral bölgeye yer verilmiştir. Bu ilk iki etki, şeklin üst ve orta kısmında yer almaktadır. Burada fosfatidilkolin üzerinde (1000-1175 cm-1) çok az bir etki görülmektedir. Bundan farklı olarak H-bağlar ve bağlanmış ve bağlanmamış karbonil gruplar üzerindeki etki (1635.3 ve 1734.5 cm-1 ‘de) çok daha belirgindir. Karboniller üzerinde bu etki, karbonil grupların su moleküleriyle azalan etkileşmelere bir cevap olarak H-bağlardaki azalmalardan kaynaklanmaktadır. Fosfat titreşim bölgesini takiben 1467.6 cm-1 ‘de yeni bir band ortaya çıkmaktadır. Bu band, heksagonal paketlemeye geçişi işaret eden önceden daha yüksek olan bağ frekansının düşürülmesindeki Mg2+ iyonların etkisini göstermektedir. Şeklin alt kısmında yer alan spektrum, 720 cm-1 ‘de görülen ve değişime uğramamış CH2 rocking hareketlerine özgü ve lipid zincirin hareketliliğini düşürüldüğünün ve zincir düzenin artırdığının göstergesi olan sinyalin görülmesine rağmen, lipid CH2 sinyallerinde sadece çok hafif bir değişiminin meydana geldiğini ve lipid zincir düzeni ile ilgili bunlardan çok az bilgi alınabileceğini göstermektedir (BINDER ve ZSCHÖRNIG, 2002). Jel fazda bulunan νas PO2- üzerindeki Mg2+’un fosfat gruplarını dehadrasyona uğratma doğrultusundaki beklenilen etkisi burada görülmemektedir. Bu, 1115 ve 1137 cm-1 ‘de çıkması beklenilen sinyallerin yokluğundan ortaya çıkmaktadır (HAUSER, 1991; BINDER ve ZSCHÖRNIG, 2002). Fosfatidilkolinin karbonil grubunun absorpsyon spektrumu üzerine ilginç etkilerin meydana geldiği görülmektedir. 1736.6 cm-1 ‘de görülen pik su ile etkileşmeye giren H-bağ ile bağlanmış karbonillerin bulunduğunu göstermektedir. Mg2+ iyonları νC=O daha düşük dalga numaralarına doğru götürmektedir. Bu etki, karbonil gruplarının iyonların hidrasyon tabakalarında yer almalarından dolayı su molekülleri tarafından daha kolayca ulaşabilmelerinden kaynaklanmaktadır. Buna bir alternativ olarak, bu etkinin lipidlerin polar fazlar arası bölgede bulunduğundan, beraberinde lipid yapılarının faz değişimlerini de getirdiği, karbonil gruplarında etkeleşme neticesinde meydana gelen konformasyonel değişikliklerinden kaynakalanabileceği fikri de geçerli olabilir. Mg2+ ile bağlanma, ayrıca lipidteki CH2 titreşimlerine de etki eder. Yukarıda bahsedildiği üzere, yüzeysel su oluşumu, lipid-metal katyon ikilisinin oluşuşumunun da önemli bir parçasıdır ve etkisi söz konusu spektrumda 3000-4000 cm-1 aralığındaki piklerden görülmektedir. Bu IR absorpsyonu, bu yüzeysel su oluşumuna

210

bağlıdır (POHLE, et. al., 2000). Lipid örneğinde kalan suyun etkisi, L-αfosfatidilkolinin difaransiyel taramalı kalorimetrik (DSC) termogramı ile de teyit edilmiştir106.

Şekil 4.1. Taxol®’un çeşitli katı faz şekilleri. (Bk.:Jeong Hoon Lee, Un-Sook Gi, Jin-Hyun Kim, Yongae Kim, Seon-Ho Kim, Hunseung Oh, and Bumchan Min. Preparation and Characterization of Solvent Induced Dihydrated, Anhydrous, and Amorphous Paclitaxel, Bull. Korean Chem. Soc. 2001, Vol. 22, No. 8, 925-928).

106

Termodinamik teyit ile ilgili yorum ayrıca bu projenin ara raporunda da yer almaktadır.

211

Lipid yapısındaki polar kısmına özgü sinyaller veren C-H absorpsyon bandlarıyla polar olmayan bölgede bulunan C-H grup titreşimlerinden kaynaklanan sinyallerin

birbiriyle

örtüştüğünden,

yaklaşımımda

söz

konusu

spektrum

kıyaslamaları sadece Taxol® ve L-α-fosfatidilkolinin sinyallerinin (fosfat, karbonil ve CH titreşimleri) çakışmadığı IR bölgelerinde yapılmıştır. Bu şekilde ayrıca, ikili kompleks iki ayrı kompleks oluşumu ile (Taxol®-fosfolipid ve fosfolipid-Mg2+) karşılaştırılmıştır. Tüm ikili kompleks oluşum IR absorpsyon spektrumları Şekil 3.23.7 ve Tablo-4.1’de verilmiştir. FTIR ölçümlerinde katı fazda ve sıvı fazda hazırlanan örneklerle çekilen spektrumlarının

kıyaslanması

gerektiğine

dair

gerekçelerden

daha

önce

bahsedilmişti. KBr yönteminin ortamdan yan sinyallere neden olan suyun uzaklaştırması gerektiğinden, bu tür FTIR ölçümlerinde önemli br yeri vardır. Bunların geçerliliği ile ilgili hususlara daha önce verdiğim projemin ara raporlarında yorumlar bölümünde de değinilmiştir. Projemizde şimdiye kadar yer verdiğim neticeler KBr tablet yöntemiyle hazırlanan örneklerle elde edilmiştir. Ancak, hücresel ortam katı değildir. Söz konusu hücresel ortamın sıvı ve akışkan olduğunu göz önünde bulundurarak, tasarımımda yer alan aynı ölçümleri sıvı örneklerle kontrollü nem ortamında hazırlanan ince tabaka lipid filmi ile çekilen FTIR spektral analizleriyle devam etmek arzusundayım. Sıvı örnekleri için: Characterization of a Cationic Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2, 4642-4650, (2000)., FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141, (1998) yayınlarda yer alan prosedürleri bir sonraki projemde esas alarak uygulamak gerekmektedir107.

FTIR ölçümlerinde KBr pellet (tablet) ve sıvı örneklerin önemini vurgulayan ve birbirini tutmaları konusunda yapılan deneylerle ilgili şu kaynaklarda çok önemli protokol ayrıntıları bulunmaktadır: 107

ANCHORDOQUY, T. J., Dean Allison, S., Molina, M. D. C., Girouard, L. G., and Carson, T. K., Physical Stability of DNA-Based Therapeutics, Drug Disc. Today, 6, 463-470, (2001). BANYAY, M., Sarkar, M. and Gräslund, A., A Library of IR Bands of Nucleic Acids in Solution, Biophys. Chem., 104, 477-488, (2003).

212

BINDER, H., and Zschörnig, O., The Effect of Metal Cations on the Phase Behavior and Hydration Charactersitics of Phospholipid Membranes, Chem. Phys. Lipids, 115, 39-61, (2002). BLOOMFIELD, V. A., Crothers, D. M., and Tinoco, I. Jr., Nucleic Acids-Structures, Properties, and Functions. University Science Books, Sausalito, CA 94965 (2000), Pp: 210-212. BRUNI, P., Cingolani, F., Iacussi, M., Pierfederici, F. , and Tosi, G., The Effect of Bivalent Metal Ions on Complexes DNA-Liposome: a FT-IR Study, 565-566, 237-245, (2001). CLEMENT, J., Keifer, K., Kimpfler, A., Garidel, P., and Peschka-Süss, R., Large-Scale Production of Lipoplexes With Long Shelf-Life, Eur. J. Pharmaceut. Biopharm., 59, 35-43, (2005). FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141, (1998). GARIDEL, P., Blume, A., and Hübner, W., A Fourier Transform Infrared Spectroscopic Study of the Interaction of Alkaline Earth Cations With the Negatively Charged Phospholipid 1,2-dimyristoyl-snglycero-3-phosphoglycerol,. Biochim. Biophys. Acta, 1466, 245-259, (2000). GAUGER, D.R., Selle, C., Fritzsche, H., and Pohle, W., Chain-Length Dependence of the Hydration Properties of Saturated Phosphatidylcholines as Revealed by FTIR Spectroscopy, J. Mol. Structure, 565-566, 25-29, (2001). GÜNZLER, H. and Gremlich, H.-U., IR Spectroscopy. An Introduction, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69469, Weinheim (Germany), (2002).

HACKL, E. V., Kornilova, S. V., Kapinos, L. E., Andrushchenko, V. V., Galkin, Vi L., Grigoriev, D. N., and Blagoi, Yu. P., Study of Ca2+, Mn2+ and Cu2+ Binding to DNA in Solution by Means of IR Spectroscopy, J. Mol. Structure, 408/409, 229-232, (1997). HAUSER, H., Effect of Inorganic Cations on Phase Transitions, Chem. Phys. Lipids, 57, 309-325, (1991). HÜBNER, W. and Blume, A., Interactions at the Lipid-Water Interface, Chem. Phys. Lipids, 96, 99123, (1998). JOHNSTON, S. F., Fourier Transform Infrared – A Constantly Evolving Technology, Ellis Horwood Limited, (1991).

213

LAI, E., van Zanten, J. H., Evidence of Lipoplex Dissociation in Liquid Formulations, J. Pharm. Sci., 91, 1225-1232, (2002). Le BIHAN, T., and Pézolet, M., Study of the Structure and Phase Behavior of Dipalmitoylphosphatidylcholine by Infrared Spectroscopy: Characterization of the Pretranstion and Subtransition, Chem. Phys. Lipids, 94, 13-33, (1998). LEWIS, R. N. A. H., Winter, I., Kriechbaum M., Lohner, K. and McElhaney, R. N. Studies of the Structure and Organization of Cationic Lipid Bilayer Membranes: Calorimetric, Spectroscopic, and Xray Diffraction Studies of Linear Saturated P-O-ethyl Phosphatidylcholines, Biophys. J., 60, 13291342, (2001). LEWIS, R.N.A.H. and McElhaney, R.N., Fourier Transform Infrared Spectroscopy in The study of Hydrated Lipids and Lipid Bilayer Membranes. in: H.H. Mantsch and D. Chapman (Eds.), Infrared Spectroscopy of Biomolecules. Wiley-Liss, New York, (1996), Pp: 159-202. PEVSNER, A., and Diem, M., IR Spectroscopic Studies of Major Cellular Components. III. Hydration of Protein, Nucleic Acid, and Phospholpid Films, Biopolymers (Biospectroscopy), 72, 282-289, (2003). POHLE, W., Gauger, D.R., Fritzsche, H., Rattay, B., Selle, C., Binder, H., and Böhlıg, H., FTIRSpectroscopic Characterization of Phosphocholine-Headgroup Model Compounds, J. Mol. Structure, 563-564, 463-467, (2001). POHLE, W., Selle, C., Gauger, D. R., Zantl, R., Artzner, F., and Rädler, J. O., FTIR Spectroscopic Characterization of a Cationc Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2, 4642-4650, (2000). RUTHVEN, N. A., Lewis, H. and McElhaney, R. N., The Structure and Organization of Phospholipid Bilayers as Revealed by Infrared Spectroscopy, Chem. Phys. Lipids, 96, 9–21, (1998). SAENGER, W., Principles of Nucleic Acid Structure, Chapter 17: Water and Nucleic Acids. Mir Publishers, Moscow, (1987), Pp: 63, 393-412 (The Russian translation). SELLE, C. and Pohle, W., Fourier Transform Infrared Spectroscopy as a Probe for the Study of the Hydration of Lipid Self-assemblies. II. Water Binding Versus Phase Transitions, Biospectroscopy, 4, 281-294, (1998).

214

SELLE, C., Pohle, W. and Fritzsche, H., FTIR Spectroscopic Features of Lyotropically Induced Phase Transitions in Phospholipid Model Membranes, J. Mol. Structure, 480-481, 401-405, (1999). SILVESTRO, L. and Axelsen, P. H., Infrared Spectroscopy of Supported Lipid Monolayer, Bilayer, and Multibilayer Membranes, Chem. Phys. Lipids, 96, 69-80, (1998). SORGI, F., and Huang, L., A Dry Powder Formulation for Gene Therapy, Pharm. Res., 12, S266, (1995). TAILLANDIER, I.E. and J. Liquier. (2002), in: J.M. Chalmers and Griffith (eds.), Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, Chichester, Vol. 5, Chapter 2, Pp. 3465-3480. van der WEERT, M., Haris, P.I., Hennink, W.E., and Crommelin, D.J.A., Fourier Transform Infrared Spectrometric Analysis of Protein Conformation: Effect of Sampling Method and Stress Factors, Anal. Biochemistry, 297, 160-169, (2001). ZUNDEL, G. Polar Interactions, Hydration, Proton Conduction and Conformation of Biological Systems – Infrared Results, , in: W. Hoppe, W. Lohmann, H. Markl, H. Ziegler (Eds.), Biophysics, Springer-Verlag, Berlin, Hedelberg, New York, Tokyo, (1983). Pp: 243-254.

215

Tablo 4.1 FTIR ölçümlerinde görülen önemli IR band titreşimleri. Fosfolipid

3424.9

Su band

2922

νs[(CH3)4]

2852.2

νs[(CH3)4]

1736.6

νs[C=O]

700 – 1500

δ[C-H]

1467.4

scissoring δ[(CH2)n]

1378.1

δ[CH2]

1242.6

νas[PO2-]

1091.5

ν[PO2-]

970.4

asimetrik [+N-(CH3)3] stretching

927.0

bölgesi

826.9

ν[C-C-N]

721.8

ν [P(-O-C)n] rocking ν[(CH2)n]

Phospholipid-Mg2+

Taxol®

975.7

ν[C-C-N]

1095.4

ν[PO2-]

1467.6

scissoring δ[(CH2)n]

1635.3

H-bağlı olmayan CO

1734.5

H-bağlı CO

2261.5

CH stretching

2852.9

CH2 stretching

2923.3

CH2 stretching

3241.4

Yüzeysel (Interstitial) su

3405.5

Bağlı su

3064

-C-H

1735

ester

1709

keton

1647

amid

1072

Finger print

216

®

Fosfolipid- Taxol

1244

Finger print

708

Finger print

709

Finger print

969

Asimetrik [+N-(CH3)3] stretching

1095

Simetrik νs[PO2-]

1245

Antisimetrik νas[PO2-]

1467

Scissoring CH2δ (hexagonal)

1647

C=O; simetrik alil C=C

1737

C=O stretching

2853

Simetrik νs[(CH3)4]

2923

Simetrik νs[(CH3)4]

3441

H-bağlı OH grupları

4.2. DSC Ölçümleri Bu ölçümler, Taxol®’un fosfolipid yüzeyine ve faz değişimlerine etkisini ortaya çıkarmak için yapılmıştır. Önceden hazırlanan fosfolipid türlerinin tek başına veya farklı oranlarda Taxol® içeren komplekslerinin DSC termogramları bu raporumun sf. 113’te bulunan Şekil 3.14-3.19 verilmiştir. Genel olarak, Taxol®’un sisteme katılması fosfatidilkolin moleküllerinde birtakım perturbasyonlara veya daha muhtemel olarak mikrodomenlere yol açmaktadır. Egg fosfatidilkolin kullanıldığında çok düşük oranda - 1.28% Taxol® oranı bile glass transitiom (Tg) ısı değişim noktasının değişmesine yol açmaktadır (Şekil 3.15). İkinci bir pikinise 56.19°C’de ortaya çıkması muhtemel olarak birden fazla faz oluştuğunun işaretidir. Muhtemelen Taxol®’un katılmasından kaynaklana mikrodomen oluşumunun işaretidir. Söz konusu faz değişiminin (Tg) fosfolipidlerin polar kısmındaki yabancı moleküllerin bulunmasına son derece duyarlı olduğundan, bu noktanın değişime uğraması sadece spesifik moleküler değişimlerle açıklanamaz. 10% Taxol® içerildiğinde, esas faz değişim ısısı (main phase transition temperatureTm) 26.16°C’den 28.25°C’ye gitmektedir, ancak etrafındaki termgram piki simetriktir. Ancak, Tm piki daralmaktadır ve yüksekliğ düşmektedir. 1.28% Taxol®’un içerildiğinde, esas faz değişimi ısı noktası (Tm) hafifçe daha düşük değerlere 217

gitmektedir (Şekil 3.15; 26.16°C→21.68°C), ancak etrafındaki termogram piki simetrik kalmaktadır. Bu pikin genişliği daralmakatdır. Bu etki, söz konusu faz değişimi

ısı

noktasının

(Tm)

kooperativitesinin

arttığını

ve

fosfolipidlerin

esnekliğinidüşürmektedir. Bu durumda, çok düzenli olan all-trans hidrokarbon fosfolipid zincir konformasyonu mevcuttur. Daha yüksekbir rotasyon serbestliğe yol açan gauche (kinked) konformasyon ise söz konusu değildir. Taxol® içeriğinin 10% faz değişim noktası (Tm) daha düşük değere değil, daha yüksek değerlere gitmektedir (Şekil 3.16; 26.16°C→28.25°C). 56.19°C’deki ikinci pik artık görülmemektedir. Tm piki ise simetrik değildir-sağ tarafında ikinci bir ufak pik belirmektedir. Bu da, Taxol®’un daha yüksek konsantrasyonlarda fosfolipidlere karşı bir şekilde afinitesinin arttığını göstermektedir. Tm‘e kıyasla glass transition temperature (Tg) pikinde daha belirgin etkiler görülmektedir. Başka bir deyişle, Tg Taxol® varlığında daha büyük değişime uğramaktadır. 1.28% Taxol® varlığında, Tg -19.75°C→-22.61°C gitmektedir ve ayrıca da belirgin bir şekilde genişlemektedir. Aynı neticenin, 10%, 16% ve 20% görülmesi (Şekil 3.16-3.18) görülmesi ise son derec ilginçtir. Bu neticeler, 0-10% aralığındaki Taxol® varlığının fosfatidilkolin akışkanlğını arttırmaktadır (Tm‘i düşürmektedir) ve esas faz değişimi noktasının (Tm) kooperativitesini arttırmaltadır (faz geçişini daraltmaktadır). 10% Taxol® varlığında ise farklı bir durum öne çıkmaktadır. Tm yükselmektedir ve 2nci pik yok olmaktadır. Ancak, 16% Taxol® varlığı akışkan fazın (Tm azalmış durumdadır) tekrar ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Akışkan faz Şekil 4.2’de gösterilmiştir.

218

Şekil 4.2. Fosfolipid çift katmanların akışkanlığının meydana gelmesi. 20% Taxol® varlığında ise sadece Tg üzerindeki etki görülmektedir. Başka bir deyişle, daha yüksek Taxol® konsantrasyonlarda fosfatidilkolin dispersiyonu daha akışkan bir hale gelmektedir. Bu noktalarda glass transition noktası (Tg) esas faz değişimi noktasından (Tm) daha önemli bilgiler vermektedir. Bu neticeler, Taxol®’un diğer fosfolipid molekülleriyle etkileşmelerini inceleyen araştırmalardaki durumdan çok farklıdır. Bu egg fosfatidilkolinin diğer fosfatidilkolin türlerine kıyasla farklılıklar gösterdiğini ortaya çıkarmaktadır. Bu, Taxol®’un yapısından kaynaklanmaktadır (Bk.: Şekil 1.26). Çok hacimli bir molekül olduğundan, Taxol® fosfolipid moleküllerinin iç bölgelerine kadar ulaşamaz. Hidrofobik bölgelere penetrasyonu kısıtlıdır ve lipidlerin ilk birkaç açil zinciri ile bağ yapmaktadır. Ancak, bu durum gerçekten lup olmadığı paramanyetik özellikleri olan etiketler kullanarak Electron Spin Resonance Spektroskopisi (ESR) ile teyit edilmelidir. 4.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri 30°C hava/su (air/water) tek başına ve Taxol® ile kompleks halindeki fosfolipidlerin π-A bu raporun sf. 119’da bulunan 3.3. “Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri” başlıklı bölümde verilmiştir. Daha önce de bahsedildiği üzere esas ölçümlere başlamadan önce, ortamın ve özellikle de söz konusu ara yüzeyin temiz hali sağlanmalıdır. Bu yüzeyin temiz hale getirilmesi sırasıyla Şekil 3.20219

3.27’de gösterilmiştir. Temiz ara yüzeyin elde edilişi özellikle Şekil 3.27’de ve Şekil 3.47’de açıkça görülmektedir-bunun kriteri olarak yüzey basıncın 0 ile 1 arası olması gerektiği hususu esas alınmaktadır (Bk.: www.nima.co.uk). Yük taşımayan (zwitterionic, nötr) lipidlerin π-A izotermleri belirtilen konsantrasyonda Şekil 3.28’den itibaren başlamaktadır. Bunlar gibi bir birine çok benzeyen ve aralarında aynı polar baş grubuna sahip ve sadece hidrokarbon zincir kısmında bir-CH2 grubu gibi çok küçük hacimli bir grupla farklılaşan fosfolipidlerde bile farklı izotermler izlenmektedir. Yüksek yüzey basınç bölgesinde izotermlerin şiddetli bir şekilde yükselişleri açıkça görülmektedir (<50 Å2). Fosfolipidler arasında gözlenen bu eğri farkı, daha uzun alifatik zincirli lipid hidrokarbom kısımların arasında meydana gelen daha güçlü van der Waals kuvvetleri ve etkileşmeleri ile açıklanmaktadır. Daha geniş moleküler alan, daha uzun alifatik zincire karşılık geldiği de açıkça görülmektedir. Başka bir deyişle, bu durumda yüzey basıncın yükselmesi için daha fazla lipid molekülleri gerekmektedir. Şekil farklılıklarından başka, farklı fosfolipidlerde izotermlerin dikey olarak yükseliş şekilleri arasında da (the sttepness of the isotherms) önemli farklılıklar gözlenmektedir. Bu olgu, söz konusu lipidlerin hava/su ara yüzeyi üzerinde oluşturdukları tilt angle ile açıklanabilir. Çünkü bu durumda geniş yüzey basınç (π) aralığında bile bazı lipidler daha sıvı halde iken (liquid-expanded phase), başka lipid türlerinin tek katmanları sıvı-kondanze (liquid-condensd phase) fazdadır. Bu gerekçenin doğruluğu, bir lipidlerin açil zincir kısmı ne kadar daha uzunluğuna bağlı olarak bu lipidin daha hdrofobik özellikleri kazanması hususu göz önünde bulundurulduğunda açıkça ortaya çıkmaktadır. Şekil 3.28 bir lipidin konsantrasyon ayarlanması deneylerini göstermektedir. Şekil 3.28’den başlayarak Şekil 3.62’ye kadar farklı deneysel tasarımlar gösterilmiştir. Örneğin, Şekil 3.30-Şekil 3.39 arasında verilen izotermler, önceden belirlenen konsantrasyonlardaki Taxol®-fosfatidilkolin karışımlarının doğrudan LangmuirBlodgett tek katman üzerinde oluşturularak elde edilmiştir. Şekil 3.40 sonraki

220

şekillerde ise söz konusu karışımlar önceden Eppendorf tüplerde hazırlanıp tek katmana uygulanmıştır. Aynı bölümde, π-A izotermleri, lipidin ulaştığı kırılma noktası (collapse point) ve geriye doğru izotermleri gösterilmiştir. Bu şekilde molekül başına düşen alanı (Area/molecule) hesaplamak çok daha kolaylaşmaktadır. Çünkü bu şekilde monolayer compression-extension eğrileri kıyaslayarak tek katman üzerindeki lipid molekülünün veya ilâç karışımının ne kadar alan kapsadığını hesaplamak mümkündür. Şekil 3.48 ise dipalmitoylphosphatidil choline’in (DPPC) tipik bir izotermidir. Bu izoterm diğer lipidlere göre farklıdır, çünkü bu tipik liquid expanded→liquidcondensed faz değişimlerini göstermektedir. Bu bakımdan, bu değişimler first-order olarak adlandırılmaktadır. Tek başına fosfatidilkolin’den başka bir diğer kontrol eğri de tek başına Taxol®’un eğrisi elde edilmiştir ve Şekil 3.29’de gösterilmiştir. Görüldüğü üzere, lipidlere kıyasla Taxol®’un izotermi son derece düzgün bir şekilde ve dalgalanma göstermeksizin gradient olarak yükselmektedir. Bu da, Taxol®’un yüksek bir kompresibiliteye sahip olduğunun bir göstergesidir. Başka bir deyişle, air/water ara yüzeylerde Taxol®’un yüzeysel basıncı lipidlere göre çok daha düşüktür ve bu da ilâcın çok düşük bir yüzey aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Yüzey basıncın, yüzey gerilimin yüzey aktivitesine sahip moleküller tarafından düşürülmesinin ifadesi olduğundan, Taxol®’un su yüzeyinde ekspansiyonu lipidlere göre çok daha düşük olduğu hususu ortaya çıkmaktadır. Bu da mantıklıdır, çünkü lipidlerin amfifilik doğasından dolayı baş gruplaru su yezeyi ile tams etmek durumundadır ve zincirleri ise hava fazına doğru yönelirler. Taxol® ise çok hidrofobiktir. Lipidler gibi air/water ara yüzeylerde aynı eğilimi göstermemektedir. Bu yüzden, Taxol® gibi bir molekülün yüzey basıncını çok daha düşük değerlere götürmektedir. 4.3.1. Bu Projede Yapılan Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümlerinin Daha Önce Başka Bir Cihazla Yaptığım Ölçümlerle Kıyaslanması Bu bölümde bu projemde elde edilen neticelerin daha önce çok daha temiz ortamlarda başka bir Langmuir-Blodgett cihazıyla ve çok deneyimli araştırmacıların kontrolü altında yapmış olduğum deneylerle kıyaslamalara yer verilmiştir. Bu şekilde

221

bu projemde elde edilen verilerin geçerliliği ve tekrarlanabiliriliği hususu vurgulanmaktadır. Ayrıca da, bu tür araştırmalarda farklı cihazların aynı neticeyi verip vermediğini inceleyerek cihazlar arasında ölçüm hassasiyetinin de kontrol edilmesi çok önemlidir. Aşağıda

gösterilen

neticeler,

1998

yılında

konuk

araştırmacı

olarak

bulunduğum Bergen Üniversitesi, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümünde yürütülen

EU

destekli

“Acyl

Specificity

and

Compartmentation

in

Glycerophospholipid Metabolism During Signal Transduction in Brain” başlıklı proje kapsamında elde edilmiştir. Bu neticeleri henüz daha yayımlamadım ve bu raporumda bunlara söz konusu sağlıklı kıyaslamaları yapabilmek amacıyla yer verilmiştir. Söz konusu projede nörokimyasal özellikleri olan klorpromazin ilâcı ile model lipid tek katmanlar arasındaki moleküler etkileşmeler incelenmiştir. Taxol® ile ilgili projemde elde ettiğim neticelerle bunların kıyaslandığında çok iyi bir örtüşmenin söz konusu olduğu ortaya çıkmaktadır. İlk önce, Fakültemizde yaşadığım ortam temizliği sorunu Norveç’teki çok iyi donanımlı üniversite laboratuvarında da yaşanmıştır. Bu sorun, Şekil 4.3 ve 4.4 izotermlerine de yansıtılmıştır. Bu çok büyük sorunu minimuma indirmek amacıyla Fakültemize NIMA Technology’nin ürettiği Langmuir-Blodgett tek katman cihazı108 yanında sunulan koruyucu konteyner ile alınmıştır. Bu çok tozlu olan 422 No’lu Merkez Laboratuvarımızdaki

ortamdan

uzaklaşarak

deneylerin

temiz

bir

ortamda

yapılmasında çok faydalı olmuştur. Fakülteye getirdiğim cihazın bazı rakip firmaların ürettiği (www.kibron.com ve www.ksvltd.com) üstünlükleri de vardır. Örneğin, son derece “user-friendly” software sayesinde neticeleri doğrudan üst üstte getirip inceleme fırsatı sunmaktadır. Ancak, yine de bu projemde elde ettiğim verileri Excel® gibi uygun bir grafik çizim programına dönüştürüp yayın yapmak üzere tekrar grafikleri elde edilecektir. Fakültemize getirdiğim cihaza ayrıca da çok uygun bir su sirkülatörü monte edilmiştir. Bu şekilde sıcaklık kontrolü altında Şekil 4.10-4.11’de gösterilen ortam sıcaklığının önemi bir kez daha vurgulanmıştır. Bu konunun önemi daha önce çözeltilerin pH kontrolü (Bk. Şekil 4.7) ve 4.8 ve saf suyun kullanılmasının (Bk.:Şekil 4.9) önemi ile birlikte ara raporlarımda ayrıntılı olarak ifade edilmiştir. 108

Bk.: www.nima.co.uk veya www.langmuir.com.

222

Şekil 4.3. Kibron marka (www.kibron.com) Langmuir-Blodgett cihazıyla yapılmış bir deney. Ara yüzeyin temizlilik testi gösterilmektedir. Üstte, kirli bir yüzeyin neden olduğu anlamsız izotemler görülmektedir. Altta verilen oklarla dpalmitoilfosfatidilserin (DPPS) çok düzgün bir (π-A) izotermi görülmektedir.

223

Şekil 4.4. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıylayüzey temizliliği testinden sonra (üstteki eğriler) elde edilen düzgün bir lipid izoterminin elde edilişi (altta).

224

Şekil 4.5. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıyla elde edilen dipalmitoylphoshpatidyl choline-chlopromazine (DPPS-chlorpromazine) bileşimlrinin izotermleri. Farklı orandaki karışımlar gösterilmiştir.

225

Şekil 4.6. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıyla yapılmış başka bir lipidchlopromazine etkileşmeleri deneyleri. Yüzey basınç (π)-moleküler alan (apparent surface molecular area (MMA)) ilişkisi, oda sıcaklığında çeşitli lipidlerle meydana gelen etkileşmeler gösterilerek ortaya çıkarılmıştır. 0 (a), 1 (b), 10 (c), 100 (d), and 1000 mM (e) subphase Chlorpromazine konsantrasyonları.

226

Şekil 4.7. Yukarıdaki izotermler üzerie Na+ iyonun etkisi. Deneyler Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı ile yapılmıştır. Lipid alanındaki artış açıkça görülmektedir. Lipid olarak DPPS kullanılmıştır ve monolayer’ı oda sıcaklığında uygulanmıştır; (A) 1 mM CPZ and (B) 20 mM CPZ subphase with 0 (a), 2 (b), and 150 (c) mM NaCl.

227

Şekil 4.8. 150 mM NaCl, DPPS izotermler üzerine etkisi. Tüm izotermler plato ile biten faz değişimi göstermektedir. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı kullanılmıştır; 0 mM cations (1), 2 mM NaCl (2), 2 mM LiCl (3), 150 mM LiCl (4), and 150 mM NaCl (5). Söz konusu iyon etkileri aşağıdaki çizimde daha ayrıntılı bir şekilde göterilmiştir109:

109

Burada sadece modelin algılanması için veridiğinden ve daha sonra buna atıfta bulunulmadığında bu şekle numara verilmemiştir.

228

Şekil 4.9. Milli-Q saf su ile yapılmış tek katman deneyleri. Kibron marka LangmuirBlodgett cihazı kullanılmıştır. Diğer ortam parametreleri şunlardır: Surface pressure/area curve for a DPPS monolayer spread on milli-Q water (1), 1 mM CPZ (2), 10 mM CPZ (3), 1 mM CPZ (4), 10 mM CPZ (5), 1 mM CPZ (6), and 10 mM CPZ (7). 10 mM CPZ.

Şekil 4.10. Farklı sıcaklıklarda elde edilen DPPS monolayer izotermleri. Moleküler alanlar π= 20 mN/m ortam sıcaklığı ıskalasına göre çizilmiştir. Deneyler Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı ile sıcaklık kontrol sistemi kullanarak yapılmıştır.

229

Şekil 4.11. Farklı sıcaklıklarda yapılan DSPS monolayer izotermleri. Moleküler alan hesaplamaları π= 20 mN/m’ında yapılmıştır ve ortam sıcaklığı ıskalasına göre çizilmiştir. Deneyler Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı ile sıcaklık kontrol sistemi kullanarak yapılmıştır.

4.4. Taxol®- Fosfolipid Membran Arasında Oluşan Yapı Bu projemde kullanılan ölçümler sayesinde ortaya çıkarılan Taxol®-fosfolipid etkileşmelerine dayanarak şu model geliştirilmiştir (Şekil 4.12).

Şekil 4.12. Moleküler düzeyde oluşan Taxol®-model membran fosfolipid yaıları. Sağda (B) şeklinde verilen model bu projemde elde edilen neticelere bakacak olursak çok daha muhtemeldir. Bu hususlara daha önce çok detaylı olarak yer 230

verilmiştir. Ayrıca da, bu model projeden kaynaklanacak olan makalelere de yansıtılacaktır. Bu yüzden, bu konuya burada çok kısa olarak değenilmiştir.

4.5. Biyoteknolojik Boyut Bu projemin 2 ayrı boyutundan biridir. Taxol®’un hidrofobik özeklerinden kaynaklanan çözünürlülük problemleri ile ilgilidir. Şimdiye kadar geliştirilen taşıyıcıları ile ilgili verilere dayanarak, bu formülasyonlarının lipide dayalı kontrollü sistemlerin geliştirilmesinde önemli bir motivasyonu teşkil etmektedir. Bu bölümde, projemde

geliştirilen

Taxol®-membran

fosfolipid

etkileşme

modellerinin

biyoteknolojik tasarımlarını vurgulamaktadır. Bu boyut son derece geniş olduğundan burada sadece önemli şekillere yer verimiştir. Buradaki modeller daha önce hazırladığım ders notlar olarak Anabili Dalımızın isteği üzere Fakültemize bunların bir ders olarak vermem konusunda 16.11.2007 tarihinde yazılı olarak bir başvurum olmuştur. Ancak bu dilekçeme herhangi bir cevap (oumlu veya olumsuz, sözlü veya yazılı) verilmemiştir. Bu modelleri istenildiği takdirde raportörlerimize seminerler vererek açıklayabilirim. Bunları burada açıklamak bu raporumun hacmini çok arttıracaktır.

Bu

modeller

projeden

kaynaklanacak

olan

makalelere

de

yansıtılacağında, bunlara burada fazla yer verilmeyecektir. Burada yer alan tüm şekillere renkli olarak www.interscience.wiley.com’dan ulaşmak mümkündür.

231

Şekil 4.13. Lipidlere dayalı antineoplastik formülasyonlarının geliştirilmesi. (Bk.: Gerben A. Koning and Gerard C. Krijger, Targeted Multifunctional Lipid-Based Nanocarriers for Image-Guided Drug Delivery, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 425-440).

232

Şekil 4.14. Hücre içi (intraselüler) antikanser formülasyonlarının akıbeti. (Bk.: Gerben A. Koning and Gerard C. Krijger, Targeted Multifunctional Lipid-Based Nanocarriers for Image-Guided Drug Delivery, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 425-440).

Şekil 4.15 Nanotıp konuları doğrultusunda antikanser ilâçların kullanım perspektifleri (Bk.: Yiyao Liu, Hirokazu Miyoshi and Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug delivery and imaging: A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007). 233

Şekil 4.16. Bu projemde de ele alınan antikanser ilâç formülasyonlarının bastleştirilmiş hazırlanma şemaları.

Şekil No. 4.17. Taxol® gibi çözünürlülük sorunları olan antikanser ilâçlarının hedeflendirilmiş tedavi uygulamaları (Bk.: Yiyao Liu, Hirokazu Miyoshi and Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug delivery and imaging: A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007). .

234

Şekil 4.18 In vivo kanser kemoterapilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş hedfelendirlimiş antikanser tedavi profileri ve biyokonjuge Qdot’ların uygulanma presipleri (Bk.: Yiyao Liu1, Hirokazu Miyoshi and Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug delivery and imaging: A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007)110.

110

Şekil 4.18-b)’de gösterilen in vivo görüntüleme sisteminin Fakültemize getirilmesi için proje hazırlanmıştırbk.: Ek-17.

235

4.6. Hücresel ve Moleküler Biyolojik Boyut Bu konu, projemin ikinci boyutunu oluşturmaktadır ve daha çok hücresel biyolojik teorilere dayanarak Taxol®’un günümüzde gerçerli olan etki mekanizmasına ek bilgiler katmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu konu ile ilgili olarak aşağıda bir öncü hipotez de sunulmuştur. Buradaki modeller, antikanser ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki etkilerine dayanmaktadır (Şekil 4.19-4.20 ve Tablo-4.2-4.4).

Şekil 4.19. Antikanser ilâçların hücresel hedefleri ve kanser ile bağlantı noktaları (Bk.: Petty, 1993).

236

Tablo-4.2 Hücre zarı akışkanlığı ve kanserle bağlantısı. Tablo DPH floresan spektroskopik ölçümlere dayanarak yapılmıştır (Bk.: Petty, 1993).

Tablo-4.3. Neoplazmik Transfromasyon ve Hücrelerdeki Morfolojik Değişiklikler (Bk.: Petty, 1993).

237

Tablo-4.4. Neoplazmik Transformasyona Yol Açan Bazı Membran Proteinleri (Bk.: W. Petty, 1993).

238

Şekil 4.20. Hücre membranı ve neoplazmik oluşumlarındaki rolü (Bk.: W. Petty, 1993).

239

Şekil 4.21. Taxol®’un sinyal iletim mekanizmalarındaki yeri.

240

Şekil 4.22. Taxol®’un sinyal iletim mekanizmalarındaki yeri. Ceramid’in merkezi rolü özellikle vurgulanmıştır.

Bu bağlamda, şu ana kadar çok az sayıda araştırılan antikanser ilâcın membran üzerindeki etkileri araştırlmıştır, ancak konu popularitesini korumaktadır. Bununla ilgili olarak, projemde de Taxol®’un da muhtemelen böyle bir hücre membran üzerinden çalışan ek bir mekanizması üzerine yoğunlaşılmıştır. Taxol®’un mebran üzerindeki sinyal iletim mekanizmalarına muhtemel etki noktaları Şekil 4.21 ve 4.22’de gösterilmiştir. Projemde kullanılan fosfolipid türleri çok dikkatlice seçilmiştir. Zwitterionic lipid türlerinin önemine daha önce ayıntılı olarak yer verilmiştir. Bunun dışında Ceramid (C16) gliserofosfolipid türleri de denenmiştir. Bunun

seçimi

Ceramid’in

Şekil

4.23-4.26

gösterilen

merkezi

rolünden

241

kaynaklanmaktadır. Bundan farklı olarak bir de negativ yüklü fosfatidilserin lipidleri de incelenmiştir. Bunları seçimi de Şekil 4.27’de gösterildiği üzere söz konusu fosfatidilserininin tümör oluşumlarında önemli olan membran lipid raftlardaki rolünden kaynaklanmaktadır. Çünkü birçok kanser hücre membranında normal hücrelerden

farklı

olarak

fosfatidilserin

ekspresyonu

çok

önemli

artışlar

göstermektedir.

Şekil 4.23. Ceramid’in hücresel fosfolipid metabolizmasındaki merkezi rolü.

242

Şekil 4.24. Ceramid’in hücresel fosfolipid metabolizmasındaki merkezi rolünü gösteren başka bir şema.

243

Şekil 4.25. Ceramid’in hücresel apoptoz olaylarında ve bununla bağlantılı olarak lipid raftların oluşumundaki rolü.

Şekil 4.26. Ceramid’in hücre mitokondri membranıyla bağlantı noktaları ve apoptozda oynadığı önemli rol.

244

Şekil 4.27. Fosfatidilserin’in antineoplazmik oluşumlarındaki rolü. Tüm bu konular, projemden kaynaklanacak alınacağından bunlara burada daha fazla yer verilmeyektir.

yayınlarda

ele

245

4.7.

Projemde

Geliştirilen

Tasarımın

Diğer

Analitik

Uygulamalardaki Yeri 4.7.1. İlâç Ligandlarının Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom Kromatografisinin Geliştirilmesi Bu

doğrultuda

ilâç-fosfolipid

arasındaki

tanıma

(drug-phospholipid

recognition) ile ilgil bu şekilde elde edilen önemli fizikokimyasal parametreler çok yakın bir gelecekte çeşitli yapı ve işlevlere sahip farmasötik formülasyonlarının ayrıştırılması, saflaştırılması ve analizleri için yeni ve analitik özellikleri iyileştirilmiş kromatografik stasyoner fazların üretilmesinde ve uygulamasında kanımızca kullanılabileceklerdir. Projemde,

bu

bağlamda

çeşitli

katyonların

da

varlığında

ilâç

konformasyonlarına spesifik olarak ve gerektiğinde spesifik olmayan bir şekilde çeşitli tepkilemelerde önem taşıyan yapı-aktivite ilişkisi araştırmalarında bu bileşenlerde moleküler ve yüzeysel etkileşmelerinin sıvı, çift-fazlı sistem olarak kullanılmalarını vurgulamaktayız. Kromatografik kolonun jel matrikslerine böyle kovalent olarak bağlanmış lipozomlarla çeşitli ilâç türlerinin veya plazmidler arasında kompleks oluşumunun stabilite, bağlanma afiniteleri ve daha sonra meydana gelen konfmasyon

değişikliklerinin

ortaya

çıkarılmasında

çok

daha

kolay

kullanılabilecekleri gibi lipozomlarla bağ yapan, reaksyona giren ve bileşkler oluşturan birçok biyolojik ve farmakolojik özellikleri olan etkin makromoleküllerin de yapılarının aydınlatılması kolaylaşacaktır. Kanımızca, böyle tasarlanmış sistemler önemli biyospesifik tanıma olaylarında kantitativ analizleri mümkün kılacaktır ve daha sonra diğer parametreler dışında, önemleri bu projemde de vurgulandığı gibi, özellikle ortam sıcaklığı, pH, pI ve tampon içeriğine bağlı olarak membrana-bağlı ilâçların nasıl değişime uğradıklarını ve bunun nasıl bir biyolojik önemi olduğunu açıklayacaktır. Bu şekilde elde edilen verilerle biyomembran üzerinden hücre sitozolüne geçiş yapan çeşitli ilâçları ve tedavi amaçlı sentezlenen farmasötik formülasyon bileşenlerinin farklı boyut ve lipid türüne sahip hücre membranlarla

246

kompleks oluşumunun diğer önemli parametrelerini ve özellikle biyolojik neticeleri olan membran akışkanlığı ve bu bağlamda patolojik durumların ortaya çıkması ile ilgili konular aydınlatılacaktır. Bu şekilde kolayca modifiye edilen lipozomlar, sıvı fazı olan ve stasyoner fazı teşkil eden biyomakromoleküllerin spesifik olarak ayrıştırılması için bir model oluşturan lipozomun iç hacmini içeren kısım ile bir çeşit sıvı çift fazlı sistem olarak algılanmaktadır. Böylece, imobilize lipozom kromatografisi sıvı-sıvı partition kromatografisinin (liquid-liquid partition chromatography) bir çeşidi olarak görülmektedir. Bu tasarımımızda, lipozomun sıvı iç hacmi ile dış sıvı fazı arasında çeşitli moleküler ağırlığa sahip maddelere karşı yüksek geçiş özelliklerine sahip olan vezikül katmanı sayesinde bir faz farklılığı oluşmaktadır. Bu sistem, elektrostatik ve hidrofobik bağ kuvvetlerini kullanarak konformasyonel değişiminin de meydana geldiği veya tercihe göre getirilmediği durumlarda ilâçların imobilizasyonunda kullanılabilmektedir. Projemde, bu bağlamda, bu çift fazlı sistem konformasyona spesifik olarak veya tercihe göre olmayarak fosfolipidlerle nükleik asitler arasında kompleks oluşumunun araştırılması konusu, Mg2+ veya diğer çift değerli katyonların (Me2+) da varlığında ele alınmıştır. Lipidlerin faz değişimi ve faz geçiş sıcaklığının üzerinde ve altındaki ısı değelerinde çalışarak, bu sistemin termostatik kontrolü de mümkündür. Ayrıca, lipozom ve farmasötik bileşenlerinin bu yaklaşım sayesinde değişime uğratılarak lipid membranlarının hidrofobik ve elektrostatik baş gruplarını (membrane phospholipid head groups) yerel erişimi yükseltilir. Lipid vezikülleri ile farklı ilâçlar arasında oluşan komplekste, bu gibi konformasyon değişikliği parametreleri ayrıntılı olarak henüz daha araştırılmamıştır ve hedefendirilmiş ilâç taşıyıcılarının yapı aydınlatılmasında kullanılmaları kanımca çok ilginç olmalıdır. Bu bağlamda, söz konusu farmasötik formülasyonlarının yük taşımayan (zwitterionic, nötr) fosfolipidlerin çeşitli katyonların varlığında membran füzyonu meydana getirip getirmedikleri araştırılabilir. Böylece, bu şekilde kovalent olarak

kromatografik

kolonun

jel

matriksine

bağlanan

lipozomların

kendi

akışkanlıklarını ve yüzey tanıma özelliklierini de kontrol ettikleri fikri substrat olarak ele alınan farklı boyut ve konformasyona sahip ilâçlar için de bu soyut varsayımlar ve somut parametreler incelenebilecektir. Buradaki amaç, bu şekilde sterik olarak

247

stabilize edilen veziküllerin elektrostatik etkileşme kaabiliyetlerini kullanarak lipozom yüzeyinde ilâç moleküllerinin adsorbsiyonunu gerçekleştirmektir. Söz konusu lipid fazın içeriğini doğal hücre membranlarda bulunan bileşiklere benzerlik gösterecek şekilde seçerek ve tampon içeriğini, pH, pI ve T°C gibi fizikokimyasal parametreleri de bu doğal hücre ortamında ölçülen değerlerde tutarak, çeşitli lipid’e-bağlı ilâç konformasyonları araştırılabilir. Bu şekilde kovalent olarak imobilize edilmiş lipozomların stabiliteleri, çeşitli ilâç ve terapötik nükleik asitlerin111 membranlara

bağlanma

kompaktizasyon

afiniteleri

özellikleri

ve

fosfolipidlere

incelenmektedir.

Bu

bağlı

nükleik

tasarımımız,

çok

asitlerin katmanlı

(multilamellar vesicles, MLV) veya tek katmanlı (unilamellar vesicles, ULV) lipozomların veya veziküllerin kromatografik kolon jel matriksine (chromatographic gel beads) kovalent bağlama süretiyle enjektör, pompa ve UV-detektör ile donatılmış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (high perfomance liquid chromatography, HPLC) ile söz konusu fizikokimyasal parametrelerinin incelenmesine dayanmaktadır. Bu şekilde kovalent112 olarak stabilize edilmiş fosfolipid vezikülleri çok daha akışkandır ve doğal hücre membranlarına çok daha iyi bir yaklaşım ve modeli teşkil edip, ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki etkilerini incelemek için çok daha uygun bir sistemdir. Fosfolipidler, jel’e fosfatlarıyla fosfodiester bağ ve aktiv grubun karbonat kısmıyla nükleofilik fosfat katalizi ile bağlanmaktadır. Biyomembran ortamına yaklaştığı için imobilize edilmiş veziküllerde heterojen lipid katmanın elde edilmesi tercih sebebidir. Bu tasarımda, tek lipid veya birkaç lipid karışımının kullanıldığında

genelde

elektrostatik

ve

hidrofobik

etkileşmeler

meydana

gelmektedir. Böylece, bu tasarım sayesinde membran-ilâç arasında oluşan kompleksin oluşma kinetiğini de incelemek mümkündür. Ayrıca, bu tasarım, serbest iyonların ve membrana bağlı olarak işlev yapan çeşitli yüklü deterjanların nükleik asit kondanzasyonu ve kompaktizasyonu gerçekleştiren ajanlar olarak lipid’e bağlı gen taşıyıcı tasarımlarda da, fizikokimyasal özellikleri iyileştirilmiş moleküller olarak Günümüzde birçok uluslararası bilimsel terminolojide olduğu gibi, bu projemizde de ilâç ile terapötik nükleik asit kavramları eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. 112 Kovalent bağlanma adı altında burada sadece kromatografik jel matriksine lipozomların bağlanması kastedilmektedir. Bu yöntem ile ilgili çok sayıda protokol ve tasarım vardır. Projemizde ise yenilik olarak bu tasarıma dayanarak kovalent olarak imobilize edilmiş lipozomal stasyoner faza bir de elektrostatik veya hafif kuvvetler veya hidrofobik etkileşmeleri kullanarak çeşitli katyonlar varlığında ilgili ligandları (ilâç, nükleik asit, protein vs.) bağlayarak elüasyonlarını sağlayarak spesifik olarak bu makromolekülleri saflaştırılması yer almaktadır. 111

248

diziliş ve konformasyon’a bağlı nükleik asitlerin saflaştırmasındaki yeri de incelenebilmektedir. Bu konu özellikle gen aktarımı öncesi yüksek miktarlarda saflaştırılması gereken plazmid türleri için geçerlidir. Farmasötik formülasyonlarda kullanımları için büyük ölçüde, miktarda ve saflıkta plazmid DNA’nın üretilmesi insan gen tedavisi gibi birçok biyoteknolojik uygulamalar için esastır. Özellikle plazmid DNA saflığı söz konusu olunca, plazmidleri daha yüksek bir dinamik bağlama kapasitesine sahip ve iyileştirilmiş ve optimize edilmiş kromatografik kolon matrikslerinin tasarımı çok büyük bir önem kazanır. Şu ana kadar saflştırma amacıyla uygulanmakta olan poröz matrikslere bir alternativ olarak tasarımımızda geleneksel malzemelere nazaran iyileştirilmiş hidrodinamik özelliklere sahip membran özellikli matrikslerin uygulamaya yönelik hususlar vurgulamaktadır. Bu bağlamda, çeşitli nükleik asit konformasyonları fizikokimyasal ve stereokimyasal olarak ayrıştırabilen kontrollü DNA presipitasyonlarını gerçekleştirerek tasarımımızda tek ve çift zincirli DNA’ların saflaştırmasına da yer verilmiştir. Böylece DNA işlevsel yüzeyin yaratılmasında ve daha sonra bu lipozomal yüzeyinde nükleik asit imobilizasyonu için kullanılabilir. Genomik ve plazmid DNA veya RNA arasındaki ayrışım kullanılan katyona bağlı olarak farklı kompaktizasyon globülü meydana geleceğinden mümkün olmaktadır. Bu tasarım, yine negativ yüklü DNA ile yüksüz (nötr) veya pozitiv yüklü lipidleri çift valanslı katyonlar (Mg2+, Ca2+, vs.) aracılıyla bir araya getiren elektrostatik etkileşmelerinin

uygulanmasına

dayanmaktadır.

Diğer

yandan,

elektrostatik

kuvvetler dışında DNA-lipid oluşumu bazlarla matriksteki ligand-taşıyan gruplar arasında hidrofobik etkileşmeler sayesinde de meydana gelidiğinden söz konusu konformasyonlar arası ayrışım ters-fazlı sıvı kromatografisi (Reverse Phase Liquid Chromatography, RPLC) ile de inclenebilinmektedir. Bu durumda, bağlı olan polinükleotidler hidrofobik bir özellik olan yükselen hidrofobisiteye göre elüe olmaktadırlar. Böylece, daha yüksek moleküler ağırlığa sahip nükleik asitler RPLC kolonunda daha uzun bir süre kalacaklardır. Sonuç olarak, bu tasarım sayesinde tek sarmallı DNA’yı plazmid DNA’dan ve çift sarmallı DNA’dan saflaştırmak mümkün olur. Süpersarmallı plazmid DNAlar genelde gen nakli için en uygun malzeme olduklarından kromatografik yaklaşımların en önemli amacı bu konformasyonu diğer plazmid konformasyonlardan ayrıştırmak ve saflaştırmaktır.

249

Nükleotid bazlar kromatografik kolon bağlayıcıya (colon linker) şeker, baz veya fosfat kısmındaki çeşitli pozisyonlarda bağlanmaktadır. Gen transkripsiyonu, ve translasyounu, virüs-hücre etkileşmeleri, nükleositoplazmik transport ve hücre bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda rol oynayan proteinlerin büyük bir bölümü öncelikli olarak tek zincirli veya çift zincirli nükleik asit dizilişlerine bağlanmayı tercih ederler. Bu olaylarda önemli rol oynayan makromoleküller membrana-bağlı olarak işlev yapmaktadır. Böylece, bu olayların moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak, bu kilit moleküllerin saflaştırmasına bağlıdır. Bu da yeni nükleotid dizilişi ve konformasyona spesifiklik gösteren kromatografik nükleik asit saflaştırma tasarımlarını zorunlu kılar. Mekanizmaya özgü bir afinite kromatografi tasarımını şematik olarak geliştirebilmek son derece önemlidir. İmobilize afinite lipozom-ilaç ve lipozom-nükleik asit kromatografisi konusunda çalışmalarım yoğun olarak devam etmektedir ve yeni bir araştırma projesi olarak sunulacaktır.

250

4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak Çalışmalar Bu projemle ortaya çıkarılan Taxol®-membran fosfolipid etkileşmelerinden yola çıkarak burada sunulan modelleri in vivo ortamda denemek. Amacım, bu şekilde karakterize edilen antikanser ilâç-lipid bileşenlerinin fizikokimyasal parametrelerine dayanarak bu kontrollü ilâç taşıyıcı tasarımını lipidler aracılıyla gerçekleştirilen in vivo deneylerde denemek suretiyle iyi ve güvenilir bir model terapötik Taxol® formülasyonu elde etmek. Bunun için uluslararası düzeyde ortak çalışmalara girmeyi ümit etmekteyim. Ancak, in vitro ve in vivo ortamda söz konusu formülasyon çalışmalara

girmenin

koşulu

ilk

önce

bu

formülasyonların

fizikokimyasal

karakterizasyonudur ki bunu da projemiz yüzey kimyasal, kolloid ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak başarıldığını inanmaktayım. Bu ön verilere dayanarak bu konuyu çok daha iddialı boyutlara taşımayı arzuluyorum. İleriye yönelik yurt dışı ortaklarımızla yapmayı planladığımız deneyler kısaca şunlardır: • Öncelikle, fakültemizde şu ana kadar atık sorunu tehlikesi yüzünden radyoaktiv bileşenlerle çalışmaların mümkün olmadığından, sözü edilen lipozomhücre

etkileşmelerinin

radyoaktiv

lipid

markerleri

kullanarak

incelemeyi

planlamaktayım. Örneğin, lipozomları radyoaktiv [3H]kolesteril ester ve kolesteril [14C]-oleat işaretleriyle çifte işaretleyerek lipozomların intraselüler akıbeti hakkında çok önmeli bilgiler elde edilebilir. Radyoaktiv işaretleme yöntemine bir alternativ olarak piyasada uzun yıllardan beri bulunan lipidlere spesifik floresan işaretler kullanılabilinir. Ayrıca, lipozomların iç hacminde enkapsüle edilmiş şekilde bulunan DNA’nın kompaktizasyonu konvansyonel floresan mikroskopisi ile veya konfokal lazer taramalı mikroskopisi (confocal laser scanning microscopy) ile incelemek çok önemli bilgiler vermektedir. Örneğin, lipozom lipidlere spesifik olan FM 4-64 uygulandığında bu biyomoleküllerin dinamiği hakkında bilgiler vermektedir (SÜLEYMANOĞLU, 2002). • Projemin bir sonraki aşaması hücre kültürlerinin kullanılması ile ilgilidir. Ancak, bu konu ile ilgili uygulanacak olan protokol hücre türüne göre spesifiklik 251

gösterdiğinden, in situ olarak elde edilecek olan neticeleri çok dikkatlice değerlendirilmeli, çünkü her hücre türü kendine özgü ilâç internalizasyon kinetiği göstermektedir. Diğer yandan, hücre kültürlerinin kullanılmasının büyük avantajı bu hücre kültürlerini piyasadan edinebilme kolaylığı ve yapılmakta olan deneylerin kontrol edilebilme fırsatıdır. Örneğin, hücre kültürü düzeneğini kullanarak kan ve kan bileşenlerinin (serum, plazma ve çeşitli proteinler) veya farklı reseptörlerin lipozom-hücre etkileşmelerine etkilerini ortaya çıkarmayı planlamaktayım. • Bu projemde, nötr fosfolipidlerlerin yanı sıra negativ yüklü fosfatidilserinveya fosfatidilgliserol içeren lipozomların çeşitli hücre kültürleri ve türleri ile yapılan araştırmalarca

farklı

hücre-lipozom

etkileşmelerinin

ve

özellikle

bağlanma

afinitelerin söz konusu olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzden bu projede yapılan tüm ön fizikokimyasal ölçümlerini farklı yük taşıyan lipidleri kullanarak lipozom bileşenlerinin bağlanma afiniteleri, intraselüler salınımları ve hücre içi akıbetlerini incelemeyi hedefliyorum. • In vitro protokoller ortam sıcaklığına göre son derece duyarlıdır ve anlamlı deneylerin yapılabilmesi için ortam sıcaklığının optimize edilmesi gerekmektedir. Örneğin, bazı hücre kültürleri 4°C en etkili ilâç internalizasyon oranı gösterirken diğer hücre türleri 37°C’de en yüksek oran gösterirler. Bu bakımdan, in vitro deneylerini farklı ortam sıcaklığında gerçekleştirerek termodinamik olarak en etkili transfeksyon ortamını tespit etmeyi düşünmekteyim. Bu kısmen bu projemde de sirkülatörlü su pompasının alınmasıyla yapılmıştır. • Ortaklarımızla müşterek olarak yapmayı planladığım projemizin ileriye dönük boyutlardan biri de elde edilen in vitro verilerini in vivo ortamda denemektir ve böylece in vitro – in vivo korelasyonlarını incelemektir. Bunun için sıçan ve rat modellerini kullanarak in vivo ortamda lipozomların klirıns hızı ile ilgili farmakokinetik veriler elde edilebilinir. Bunun için bröşürü Ek-17’e verilen in vivo imaging cihazlarının alımı da uygun görülmüştür. • Bir sonraki aşama olarak, projenin gidişatına göre lipozomların kinetiğini ve doku dağılımlarını ve intra-organ dağılımlarını radyoaktiv ve/veya floresan işaretleri kullanarak araştırmayı hedefliyorum. 252

Bu uzun vadeli çalışmalara dahil edilebilmemiz için bir önkoşul olan söz konusu bileşenlerinin fizikokimyasal karakterizasyonu doğrultusunda, ilâç-lipid kompleks oluşumunun daha mütevazı ancak çok orijinal bir yaklaşım olan FTIR spektroskopisi, termodinamik ve yüzey kimyasal ölçümleri kullanarak elde etmiş bulunmaktayım. Bu ölçümlere dayanarak, daha uzun vadeli ve uluslararası boyutu olan projelere katılmayı ümit ediyorum. Bu konuda daha önce çalıştığım çok iyi laboratuvar donanımlı araştırma grupları ile temas edilmiş ve çok olumlu yanıtlar alınmıştır∇. Böylece, projemin ara raporunda da bahsedildiği gibi çalışmalarımızın nanoteknolojik boyutuna ulaşılmış olunacak ki, bu Avrupa Birliğinin 7ci Çerçeve Programında proje öncelik sıralamasında ilk yerlerde bulunan bir konu olarak bize uluslararası projelere de dahil edilmemizi sağlayacaktır ∏.

4.7.3. Öncü Hipotez Projemde

geliştirilen

hipotez

ile

ilgili

burada

sadece

genel

bilgiler

verilmektedir. Bu hipotezin dayanaklarına burada geniş olarak yer verildiği takdirde bu raporun hacmi çok fazla artacaktır. Ancak, buradaki kısa bilgiler bile bu hipotezin iyi anlaşılmasına yeterli olacağı kanısındayım. Bu projemde geliştirilen Taxol®-hücre membranı etkileşme modellerine dayanarak bu ilâcın yeni etki mekanizmalarının ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Bu bağlamdai bu antikanser ilâcın membran akışkanlığını düzenleyerek başka bir etki mekanizmasının daha mümkün olabileceği öngörülmektedir. Bunun için, bu ilâcın sitotoksisitesini wild-type ve multidrug resistant (MDR) hayvan hücrelerinde inceleyerek önemli kemoduyarlılık mekanizmalarının ortaya çıkarabilme imkânlarına bağlıdır. Bu bağlamda, hipotez modelini oluşturmak için önce literatürde bulunan mevcut bulgulara dayanarak ve ileride bu tür düzeneklerin Fakültemizde de kurulmasıyla bu tür modellerin geçerliliğini inceleme fırsatı bulunacaktır. Örneğin, hipoteze göre, Taxol®’un P-glikoprotein (Şekil 4.28) üzerinden değil de, farklı bir mekanizma ile kemoduyarlılık sitotosisitenin meydana gelmesinde rol oynamaktadır. ∇

Bu konu ile ilgili çok kapsamlı uluslararası projem Ek-16’da verilmiştir. Projemizin uluslararası boyutu ve bu konuda hedeflerimiz ve beklentilerimiz ile ilgili ayrıntılı gerekçelere ayrıca ara raporumuzda yer verilmişti.

∏

253

Bu modeli test etmek için reserpine ve verapamil gibi birçok kemoduyarlılığı meydana

getiren

molekül

kullanılabilir.

Eğer

bunların

uygulanması,

P-gp

bulundurmayan karsinom hücrelerindeki Taxol®’un birikmesine yol açtıkları tespit edilebilirse bu teklif edilen mekanizmanın bir kanıtı olarak sunulabilecektir. Çünkü bu bulgular, kemoduyarlılık yolları üzerinden etki gösteren ve P-gp’inden bağmsız olarak ortaya çıkan membran geçirgenliğinin artmasına ilişkin başka verilele de desteklenecektir. Ancak, bunu ortaya çıkarmak çok iyi çalışılmış Taxol®biyomembran etkileme incelemelerine dayanmaktadır. Bunların bir başlangıç nktasını bu proje ile başlamış bulunmkatayız. Bu projemde vurgulanan hususlar doğrultusunda membran akışkanlığını arttıran bazı moleküller gibi kemoduyarlılığı arttıran moleküller (chemosensitizers) de doza ve konsantrasyona bağlı olarak söz konusu akışkanlığının artmasına neden olmaktadır. Bu olgu, örneğin DPH polarizasyon gibi floresan spektroskopik yöntemlerle hem lipozomlarda hem d ewildtype ve MDR hayvan ve insan hücre membranları üzerinde test edilebilir. Böylece, bu tür chemosntitizer moleküllerin lipid katmanlatın geçirgenliğini arttırıcı etkileri ile anti-kanser ilâçlar karşı başlattıkları sitotoksiste arasında önemli korelasyonlar bulunmaktadır.

Sonuç

olarak,

bu

hipotezde

chemosentisizerler

aracılıyla

biyomembranların yapılarında akışkanlığın değişime uğraması ve geçirgenliklerinin artması gibi olayların, bu tür hücrelerde Taxol®’un sitotoksisitesini ortaya çıkmasında önemli rol oynayabildiklerini teklif edilmeltedir. Bu konuda yapılacak lan ek incelemelerin yeni tedavi profillerinin de geliştirilmesine katkı sağalayacaktır (Şekil 4.29).

254

Şekil 4.28. P-glikoprotein (P-gp) membran üzerinden hücre dışına ilâç moleküllerini pompalayarak kemotedavilerinin etkinliğini önemli ölçüde düşürmetedir.

255

Şekil 4.29. Antikanser ilâç-tümör hücre etkileşmeleri.

256

4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim Fakültemizde göreve başladığım tarihten hemen sonra, 04.Şubat.2004 günü bir Fakülte toplantısı düzenlenmiş, bu toplantıda o zamanki yönetim tarafından tarafıma ve beraber çalıştığım diğer 2 uzman arkadaşıma mevcut laboratuvar durumumuzun çok kötü olduğundan somut projeler üretmemiz konusunda talimatlar verilmiştir. Ayrıca da, bu projelerde suiistimalleri engellemek amacıyla kesinlikle öğretim üyelerinin yazılmaması gerektiği talimatı da tarafımıza verilmiştir. Bana verilen bu talimatları aynen uygulayıp bu proje hazırlanmıştır. Fakültemizdeki tüm kürsülerimize hizmet veren Merkez Laboratuvarın mevcut altyapısını güçlendirmek amacıyla, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje olmasına özen gösterilmiştir. Cihaz seçiminde de son derece dikkatli davranılmıştır. Her kürsünün istifade edebileceği bir cihaz projesi hazırlanmıştır. Bu benim Türkiye’de ilk projem olduğundan daha kısa süreli bir proje olarak hazırlanıp, bu projede elde edilen bulgulara dayanarak çok daha kapsamlı, uzun vadeli, yüksek bütçeli ve uluslararası katılımlı bir proje daha hazırlanmıştır (Bk.: Ek-16). Bunun için tarafıma yurt içinden ve yurt dışından yapılan ortak çalışma başvurularını da (Bk.: Ek-15) değerlendirip ulusal ve uluslararası proje sponsorlarına başvurulması uygun görülmekteyim. Ancak bu şekilde, uzun vadeli bir proje desteği ile şu andaki durum (Bk.: Ek-1 ve Ek-2) iyileştirilebilecektir. Bu doğrultuda, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett cihazına eklenebilecek bazı cihazların alımı ile bu çalışmalarımın niteliği yükseltilebilecektir. Bu bağlamda, daha 2 sene önce bu cihaza eklemek üzere yine yüzey analizlerde yoğun olarak kullanılan Atomik Kuvvet Mikroskopu (Atomic Force Microscopy-AFM) veya yüzeylerde faz değişimlerinin araştırılmasında kullanılan Brewster Angle Microscopy (BAM) sistemlerinin alınması ile ilgili projeler hazırladım. Ancak, söz konusu mikroskopi sistemleri temiz bir ortama bağlı olarak çalıştırılmaktadır. Oysa Fakültemizde henüz daha temiz (tozsuz) bir odamız yoktur. Bu yüzden bu projelerimi böyle bir odanın yapımından sonrası için ertelenmiştir. O zamana kadar Fakültemize daha faydalı olabilecek ve çok orijinal alternativler üzerinde çalıştım ve bundan böyle geliştirmek istediğim laboratuvar donanımını şöyle sıralamaktayım. Tüm ilgili bröşürler sırasıyla E-17’de verilmiştir. İlk önce, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett sistemine ek olarak bir Dip Coaters parçalarının alınması uygun olur. Söz konusu parçalar, çalışılan düzenek

257

çözeltilerine son derece hassas olarak substratların uygulanmasını sağlamaktadır. Böyle bir ek sistemin monte edilmesi çalışmalarımızdaki hassasiyeti arttıracaktır. Çalışmalarımıza termodinamik boyut kazandırmak amacıyla termal analiz cihazlarının getirilmesi için gereken girişimlerde bulunulmuştur. Bu doğrultuda bir Isothermal Titration Calorimeter cihazın alınması için başka bir proje hazırlanacaktır. Söz konusu cihaz şu ana kadar kullandığım Differential Scanning Calorimetry cihazlarından çok önemli üstünlüğü vardır. Örneğin, Isotehrmal Titration Calorimetry ile ligand bağlama kinetiği ölçülmektedir ve bu çok önemli bilgiler vermektedir. Bir sonraki proje hedefim bir Confocal Fluorescence Microscopy sistemidir. Söz konusu mikroskopi sistemi, bu proje ile alınan Langmuir-Blodgett tek katman sistemine inverted versiyonu olarak eklenebilmektedir. Bu sisteme ayrıca da

Epifluorescence

Microscopy

sistemi

de

eklenebilmektedir.

Bu

mikroskopilerin eklenmesi model tek katman membran çalışmalarında son derece önemli bilgiler verecektir, çünkü bu sistemler uygun floresan işaretlerin yardımıyla doğrudan fosfolipid akışkanlığının incelenmesini mümkün kılacaktır. Bunun bilimsel gerekçeleri de şöyle sıralanabilir. Daha 1960lı yıllarda Almanya’da Ruska’nın keşfettiği elektron mikroskopisi hücre biyolojisinde çok önemli rol oynamıştır. Örneğin, virüs ve fajların bakteri yüzeyindeki yapılarını incelenmesini mümkün kılmıştır ve birçok intraselüler organellin yapısını aydınlatmıştır. Ultrasantrifüjün kullanıma girmesiyle bu mikroskopi yöntemi moleküler hücre biyolojisinin ve biyokimyanın gelişmesine olağanüstü bir katkıda bulunmuştur. Ancak daha sonraları araştırıcılar tarafından bazı uygulamaları kuşku uyandırmıştır. Örneğin, bu mikroskopi sisteminde kullanılan sert muameleler (-94°C ortamı ve OsO4 ile fiksaksiyon işlemleri) birçok biyolojik molekülleri olumsuz etkilemektedir. Çünkü doğada böyle ortamlar zaten yoktur. Her nekadar elektron mikroskopisinin TEM (Transmission Electron Microscopy) versiyonu özellikle boyut analizi için günümüzde de kullanılıyorsa da, bu mikroskopilerle elde edilen görüntüler bu sebeplerden dolayı artefakttır (yapaydır). Buna karşılık, floresan mikroskopisinin çok önemli üstünlüğü bulunmaktadır. Örneğin, Gren Fluorescence Protein (GFP)-plazmidlerle klonlanan ve hücresel ekspresyonu gerçekleştirilen bir proteinin söz konusu hücreyi hiç öldürmeden hücre kültürü ortamında protein dinamiğini live cell imaging olarak

258

görüntülemek mümkündür. Anlaşılacağı üzere yaşayan hücrelerle çalışmak çok önemlidir. Ayrıca da, BODIPY türü gibi lipid floresan işaretler kullanarak fosfolipid veziküllerin (lipozomların) (Bk.: Ek-9) şeklini ve akışkanlığını incelemek mümkün olmaktadır. Şimdiye kadar adı geçen cihazlar Langmuir-Blodgett tek katman sistemine doğrudan eklenebilinmektedir. Bu sistem ile elde edilen veriler ve geliştirilen modeller daha sonra in vivo ortamda uygulanabilmelidir ve geçerlilikleri ispat edilmelidir. Bu bakımdan, Fakültemizde bir hücre kültürü düzeneğinin kurumasından sonraki proje amacım Raman Mikroskopi sisteminin getirilmesi. Bunu da, uzun vadeli proje desteği ve Avrupa’daki eski hocalarımın da projelere katılımıyla bir İlâçHücre Etkileşmeleri konulu uluslararası proje kapsamında getirilmesini uygun görmekteyim, çünkü böyle bir sistem 220 000 Avro’luk bir desteği de gerektirecektir. Ancak bu pahalı sistemin çok önemli avantajları vardır. Örneğin, her ne kadar floresan mikroskopisi yaşayan hücredeki yapıları görüntülüyor olsa da bu yöntemde ortaya çıkan “photobleaching” olayı tek başına hücreleri öldürebilmektedir. Bu yüzden, bir yapı görüntülenir görüntülenmez hemen başka bir bölgeye mikroskopi okularının yönlendirilmesi gerekmektedir. Dolayısıyla da deneyimli personele ihtiyaç vardır. Kanımca, buna alternativ olarak böyle bir sorunu olmayan Raman Mikroskopisi teklif edilmelidir. Buraya kadar adı geçen cihazların her biriyle ilgili uluslararası tecrübem bulunmaktadır ve herhangi bir eğitim için zaman kaybedilmeyecektir (Ek-18). Ancak, tüm bu projelerin başarıyla tamamlanması Fakültemizdeki statümün özerkliğine ve suiistimallerin engellenebilmesine bağlıdır. Herkesin projelere müdahale ettiği ve suiistimal etmeye çalıştığı bir noktada zaten Avrupa’daki ortaklarımın bunlara katkıda bulunmaları söz konusu olamaz.

259

5. SONUÇ Bu projemde, kemoterapilrde yoğun olarak kullanılan Taxol®’un (Paclitaxel’in) model olarak uygulanan fosfolipid yapılarıyla etkileşmeleri moleküler düzeyde incelenmiştir.

Yüzeyin

fizikokimyasal

karakterizasyonu

ve

farklı

ilâç-lipid

bileşimlerinin yapı ve termodinamik özelliklerinin aydınlatılması için LangmuirBlodgett tek katman, Fourier Transfrom Infrared (FTIR) Spektroskopi ve Diferansiyel

Taramalı

Kalorimetrik

ölçümlerinde

yararlanılmıştır.

Örneğin

hazırlanmasının, lipid türünün, ilâç konsantrasyonunun gözlemlenen bu özellikler üzerinde belirleyici etkileri vardır. Fosfatidilkolin tarafından Taxol®’un tanınması, lipid baş gruplarınca yüzeyin tanınması, başlangıç, değişim öncesi ve ana faz değişim dereceleri ve açil zincir gruplaşması gibi sonuçlara yol açarak model membran yüzeylerinin fiziksel parametreleri üzerinde sıvılaştırıcı ve akışkanlığı arttırıcı etkileri olduğu ortaya çıkarılmıştır. Projemdeki vurgu Taxol®’un model hücre membranlar üzerindeki etkileri hakkında yoğunlaşmış olmasına rağmen, tümör tedavisi denemelerinde hayati önem taşıyan ilâcın etki mekanizmasındaki biyofiziksel olguların anlaşmasına katkı sağlayabilecek sonuçlar elde edildiğini ümit etmekteyim. Bu iki yaklaşımın doğasına uygun olarak kullanılan deneysel tasarıma uygun düşen bir öncü hipotez ve öneriler de ayrıca tanımlanmıştır. Projemi de önceden öngörülen zaman içerisinde gecikme yaşanmaksızın tamamlamış bulunmaktayım. Benden kaynaklanan herhangi bir gecikme söz konusu değildir. Tüm eksikliklere ve özellikle de temiz (tozsuz) ortamın olmamasına rağmen, projemin başarıyla tamamlanmış olması da buaradaki neticelerin, bu raporumda yer verdiğim ve daha önce böyle tozsuz ortamda yapmış olduğum ölçümlerle kıyaslamalarından da görülmektedir. Sonuç olarak, yapılması son derece zor olan ölçümler tamamlanmış olup, yeni bir düzenek Fakültemize başarıyla kurulmuştur ve sadece Fakültemizde değil, Ankara’da bulunan diğer araştırmacılara da hizmet vermek üzere hazır tutulmaktadır.

260

Ekler Listesi Ek-1: Öğretim Elemanı Başına Düşen Makale Sayısına Göre Üniversite Sıralamasındaki Üniversitemizin Yeri Ek-2: Bologna Süreci Durum Değerlendirme Raporu, 2005-2007 Ek-3: Tübitak Avrupa Birliği 7. Çerçeve Programı: Nanoteknolojiler, Malzemeler ve Yeni Üretim Teknolojileri

Nanobilimler,

Ek-4: Gazi Üniversitesinde Nanotıp Üssünün Kurulması ile ilgili Karar Ek-5: Taxol® (Paclitaxel) ile ilgili Güncel Referanslar Ek-6: Gen Aktarımı ile ilgili Güncel Referanslar Ek-7 Taxol® (Paclitaxel’in) Fizikokimyasal Özellikleri Ek-8 Taxol®’un Sentezi Ek-9 Lipozom Hazırlama Yöntemleri Ek-10 Tek Katmanlı Lipozomların Hacmi, Çapı, Sayıları, Alanları ve Lipid Ağırlığı Arasındaki İlişkiyi Gösteren Bir Nomogram Ek-11 NIMA Technology Ltd.’in ürettiği Langmuir-Blodgett cihazları Ek-12 Langmuir-Blodgett Tek Katman Cihazın Teknik Özellikleri Ek-13 Langmuir-Blodgett Yüzey Kimyasal ve Kolloid Düzeneklerin Teorisi Ek-14 Kemoterapilerde Kullanılmakta Olan Diğer Güncel Anti-Kanser İlâçlar Ek-15 Tarafıma Yurt İçinden Ve Yurtdışından Gelen Ortak Çalışma Başvuruları Ek-16 Avrupa Birliği Destekli Proje Çerçevesine Hazırladığım Çok Katılımlı Uluslararası Ve Uzun Vadeli Proje Ek-17 Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim Ek-18 Projemle İlgili Tüm Evraklar ve Faturalar Ek-19 Özgeçmiş

261

Ek-5: Taxol® (Paclitaxel) İLE İLGİLİ GÜNCEL REFERANSLAR

Abernethy DR. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of amlodipine. Cardiology. 1992;80 Suppl 1:31-6.

262

Adv Cancer Res. 2007;98:149-90 ve Song RX. Membrane-initiated steroid signaling action of estrogen and breast cancer. Semin Reprod Med. 2007 May;25(3):187-97. Advances in Molecular Oncology (Advances in Experimental Medicine and Biology) (Advances in Experimental Medicine and Biology), by Fabrizio d'Adda di Fagagna (Editor), Susanna Chiocca (Editor), Fraser McBlane (Editor), Ugo Cavallaro (Editor); Springer; 1 edition (July 12, 2007). AMA Council Report. Guidelines for Handling Parenteral Antineoplastics. J. Amer. Med. Assoc. 1985; 253 (11): 1590-1592. American Society of Hospital Pharmacists Technical Assistance Bulletin on Handling Cytotoxic and Hazardous Drugs. Am J Hosp Pharm 1990; 47:1033-1049. Aster RH. Drug-induced immune thrombocytopenia: an overview of pathogenesis. Barbato F, di Martino G, Grumetto L, La Rotonda MI. Prediction of drugmembrane interactions by IAM-HPLC: effects of different phospholipid stationary phases on the partition of bases. Eur J Pharm Sci. 2004 Jul;22(4):261-9. Baritaki S, Apostolakis S, Kanellou P, Dimanche-Boitrel MT, Spandidos DA, Bonavida B. Reversal of tumor resistance to apoptotic stimuli by alteration of membrane fluidity: therapeutic implications. Benie AJ, Blume A, Schmidt RR, Reutter W, Hinderlich S, Peters T. Characterization of ligand binding to the bifunctional key enzyme in the sialic acid biosynthesis by NMR: II. Investigation of the ManNAc kinase functionality. J Biol Chem. 2004 Dec 31;279(53):55722-7. Berquand A, Fa N, Dufrene YF, Mingeot-Leclercq MP. Interaction of the macrolide antibiotic azithromycin with lipid bilayers: effect on membrane organization, fluidity, and permeability. Pharm Res. 2005 Mar;22(3):465-75.

263

Berquand A, Mingeot-Leclercq MP, Dufrene YF. Real-time imaging of drugmembrane interactions by atomic force microscopy. Biochim Biophys Acta. 2004 Aug 30;1664(2):198-205. Bhatti M, Yahioglu G, Milgrom LR, Garcia-Maya M, Chester KA, Deonarain MP. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. Int J Cancer. 2007 Oct 31. Bianco R, Damiano V, Gelardi T, Daniele G, Ciardiello F, Tortora G. Rational combination of targeted therapies as a strategy to overcome the mechanisms of resistance to inhibitors of EGFR signaling. Curr Pharm Des. 2007;13(33):3358-67. Biochem Pharmacol. 1999 Mar 1;57(5):503-10. Biochim Biophys Acta. 2000 Nov 23;1508(1-2):210-34. Bordi F, Cametti C, Motta A, Diociaiuti M, Molinari A. Interactions of anthracyclines with zwitterionic phospholipid monolayers at the air-water interface. Bioelectrochem Bioenerg. 1999 Oct;49(1):51-6. Byrnes RW, Antholine WE, Petering DH. Interactions of 1,10-phenanthroline and its copper complex with Ehrlich cells. Free Radic Biol Med. 1992;12(6):457-69. Calcagnile O, Gisselsson D. Telomere dysfunction and telomerase activation in cancer--a pathological paradox? Cytogenet Genome Res. 2007;118(2-4):270-6. Caldwell GW, Masucci JA, Evangelisto M, White R. Evaluation of the immobilized artificial membrane phosphatidylcholine. Drug discovery column for highperformance liquid chromatographic screening of drug-membrane interactions. Capobianco JO, Zakula D, Frost DJ, Goldman RC, Li L, Klein LL, Lartey PA. Cellular accumulation, localization, and activity of a synthetic cyclopeptamine in fungi. Antimicrob Agents Chemother. 1998 Feb; 42(2): 389-93.

264

Carrozzino JM, Khaledi MG. Interaction of basic drugs with lipid bilayers using liposome electrokinetic chromatography. Pharm Res. 2004 Dec;21(12):2327-35. Castaing M, Loiseau A, Dani M. Designing multidrug-resistance modulators circumventing the reverse pH gradient in tumours. J Pharm Pharmacol. 2001 Jul;53(7):1021-8. Castaing M, Loiseau A, Dani M. Thermal dependence of multidrug-resistantmodulator efficiency: a study in anionic liposomes. J Pharm Pharmacol. 2000 Oct;52(10):1171-8. Castaing M, Loiseau A, Djoudi L. Effects of cholesterol on dye leakage induced by multidrug-resistance modulators from anionic liposomes. Eur J Pharm Sci. 2003 Jan;18(1):81-8. Castaing M, Loiseau A, Mulliert G. Interactions between verapamil and neutral and acidic liposomes: effects of the ionic strength. Biochim Biophys Acta. 2003 Apr 1;1611(1-2):107-14. Castaing M, Loiseau A, Mulliert G. Multidrug resistance modulator interactions with neutral and anionic liposomes: membrane binding affinity and membrane perturbing activity. J Pharm Pharmacol. 2005 May;57(5):547-54. Cauchetier E, Loiseau PM, Lehman J, Rivollet D, Fleury J, Astier A, Deniau M, Paul M. Characterisation of atovaquone resistance in Leishmania infantum promastigotes. Cereijido M, Contreras RG, Flores-Benítez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz A, Shoshani L. New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med Res. 2007 Jul;38(5):465-78.

265

Chakraborty H, Banerjee R, Sarkar M. Incorporation of NSAIDs in micelles: implication of structural switchover in drug-membrane interaction. Biophys Chem. 2003 May 1;104(1):315-25. Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. Life and Times of a Cellular Bleb. Biophys J. 2007 Oct 5. Chen WM, Zhang PL, Wu B, Zheng QT. Studies on the chemical constituents of Taxus yunnanensis. Yao Hsueh Hsueh Pao 1991;26(10):747-54. Chen YJ, Chen CY, Shen YC, New taxoids from the seeds of taxus chinensis. J Nat Prod 1999 Jan;62(1):149-51. Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2075-90. Chidgey M, Dawson C. Desmosomes: a role in cancer? Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1783-7. Chiquero MJ, Perez-Victoria JM, O'Valle F, Gonzalez-Ros JM, del Moral RG, Ferragut JA, Castanys S, Gamarro F. Altered drug membrane permeability in a multidrug-resistant Leishmania tropica line. Biochem Pharmacol. 1998 Jan 15;55(2):131-9. Clinical Oncological Society of Australia. Guidelines and Recommendations for Safe Handling of Antineoplastic Agents. Med J Australia 1983; 1:426-428. Deo N, Somasundaran T, Somasundaran P. Solution properties of amitriptyline and its partitioning into lipid bilayers. Colloids Surf B Biointerfaces. 2004 Apr 1;34(3):155-9. Dingemans AM, Pinedo HM, Giaccone G. Clinical resistance to topoisomerasetargeted drugs. Biochim Biophys Acta. 1998 Oct 1;1400(1-3):275-88.

266

Dittmer DP, Krown SE. Targeted therapy for Kaposi's sarcoma and Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Curr Opin Oncol. 2007 Sep;19(5):452-7. Dubielecka PM, Trusz A, Diakowski W, Grzybek M, Chorzalska A, Jazwiec B, Lisowski

M,

Jezierski

A,

Sikorski

AF.

Mitoxantrone

changes

spectrin-

aminophospholipid interactions. Mol Membr Biol. 2006 May-Jun;23(3):235-43.

F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Eds.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, 2004. Fa N, Ronkart S, Schanck A, Deleu M, Gaigneaux A, Goormaghtigh E, MingeotLeclercq MP. Effect of the antibiotic azithromycin on thermotropic behavior of DOPC or DPPC bilayers. Chem Phys Lipids. 2006 Oct;144(1):108-16. Fan J, Tang g, Shu G, Xu X, On the conservation and regeneration of Taxus resources. Chung Kuo Chung Yao Tsa Chih. 1996 Jul;21(7):389-91, 446. Fardel O, Payen L, Sparfel L, Vernhet L, Lecureur V. Drug membrane transporters in the liver: regulation of their expression and activity. Ann Pharm Fr. 2002 Nov;60(6):380-5. Ferte J. Analysis of the tangled relationships between P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and the lipid phase of the cell membrane. Eur J Biochem. 2000 Jan;267(2):277-94. Fox CB, Horton RA, Harris JM. Detection of drug-membrane interactions in individual phospholipid vesicles by confocal Raman microscopy. Anal Chem. 2006 Jul 15;78(14):4918-24. Fresta M, Furneri PM, Mezzasalma E, Nicolosi VM, Puglisi G. Correlation of trimethoprim and brodimoprim physicochemical and lipid membrane interaction properties with their accumulation in human neutrophils. Antimicrob Agents Chemother. 1996 Dec;40(12):2865-73.

267

Fresta M, Panico AM, Bucolo C, Giannavola C, Puglisi G. Characterization and invivo ocular absorption of liposome-encapsulated acyclovir. J Pharm Pharmacol. 1999 May;51(5):565-76. Fukushima M, Takeda J, Fukamiya N, Okano M, Tagahara K, Zhang SX, Zhang DC, Lee KH. A new taxoid, 19-acetoxytaxagifine, from Taxus chinensis. J Nat Prod 1999 Jan;62(1):140-2. Gallois L, Fiallo M, Garnier-Suillerot A. Comparison of the interaction of doxorubicin, daunorubicin, idarubicin and idarubicinol with large unilamellar vesicles. Circular dichroism study. Biochim Biophys Acta. 1998 Mar 6;1370(1):31-40. Garman KS, Nevins JR, Potti A. Genomic strategies for personalized cancer therapy. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R226-32. Gasparini P, Sozzi G, Pierotti MA. The role of chromosomal alterations in human cancer development. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):320-31. Goldenberg DM. "Targeted therapy with monoclonal antibodies: the new generation of pharmaceuticals". Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006; 21-2. Hamill OP, McBride DW Jr. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 1997;59:621-31. Hendrix MJ. A morphological characterization of melanoma tumor cell interaction with a basement membrane model in the absence and presence of an anticancer agent. Scan Electron Microsc. 1984; (Pt 4): 1973-82. Hideshima T, Anderson KC. Preclinical studies of novel targeted therapies. Hematol Oncol Clin North Am. 2007 Dec;21(6):1071-91. Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes-Structure and Function, Plenum Press, New York and London, 1993, pp. 353-377.

268

Int J Parasitol. 2002 Jul;32(8):1043-51. J Chromatogr A. 1998 Mar 27;800(2):161-9. J Chromatogr A. 2001 Apr 13;913(1-2):123-31. J Pharm Sci. 1998 Aug;87(8):960-6. Johansson E, Engvall C, Arfvidsson M, Lundahl P, Edwards K. Development and initial evaluation of PEG-stabilized bilayer disks as novel model membranes. Biophys Chem. 2005 Feb 1;113(2):183-92. Jones RB, et al: Safe Handling of Chemotherapeutic Agents: A Report from the Mount Sinai Medical Center. Ca-A Cancer Journal for Clinicians 1983; (Sept/Oct) 258-263. Korfel A, Thiel E. Targeted therapy and blood-brain barrier. Recent Results Cancer Res. 2007;176:123-33. Kozin SV, Gerweck LE. Related. Cytotoxicity of weak electrolytes after the adaptation of cells to low pH: role of the transmembrane pH gradient. Br J Cancer. 1998 May; 77 (10): 1580-5. Larsen AK, Lametsch R, Elce JS, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA, Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem J. 2007 Dec 12. Li Y, Liu J, Pan D, Hopfinger AJ. A study of the relationship between cornea permeability and eye irritation using membrane-interaction QSAR analysis. Toxicol Sci. 2005 Dec;88(2):434-46.

269

Liang J, Kingston DG. Two new taxane diterpenoids from Taxus mairei. J Nat Prod 1993 Apr;56(4):594-9. Liang JY, Min ZD, Iinuma M, Tanaka T, Mizuno M, Two new antineoplastic diterpenes from Taxus mairei. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1987 Jun;35(6):2613-4. Liang Y, Liu LR, Zhang QQ. Structure and degradation property of the PVAcollagen complex drug membrane. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2004 Feb;26(1):18-23. Liu H, Carter GT, Tischler M. Immobilized artificial membrane chromatography with mass spectrometric detection: a rapid method for screening drug-membrane interactions. Rapid Commun Mass Spectrom. 2001;15(17):1533-8. Liu XY, Nakamura C, Yang Q, Kamo N, Miyake J. Immobilized liposome chromatography to study drug-membrane interactions. Correlation with drug absorption in humans. J Chromatogr A. 2002 Jun 28;961(1):113-8. Liu XY, Yang Q, Kamo N, Miyake J. Effect of liposome type and membrane fluidity on drug-membrane partitioning analyzed by immobilized liposome chromatography. Lundquist A, Engvall C, Boija E, Kurtovic S, Chattopadhyaya J, Hagglund CL, Lundahl P. Interactions of drugs and an oligonucleotide with charged membranes analyzed by immobilized liposome chromatography. Biomed Chromatogr. 2006 Jan;20(1):83-7. Luxo C, Jurado AS, Custodio JB, Madeira VM. Toxic effects of tamoxifen on the growth and respiratory activity of Bacillus stearothermophilus. Toxicol In Vitro. 2001 Aug-Oct;15(4-5):303-5. Ma DW. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007, Jun;32(3):341-50.

270

Ma JY, Barger MW, Ma JK, Castranova V. Inhibition of respiratory burst activity in alveolar macrophages by bisbenzylisoquinoline alkaloids: characterization of drugcell interaction. Exp Lung Res. 1992 Nov-Dec;18(6):829-43. Ma W, Stahlhut RW, Adams TL, Park GL, Evans WA, Blumenthal SG, Gomez GA, Nieder MH, Hylands PJ. Yunnanxane and its homologous esters from cell cultures of Taxus chinensis var. mairei. J Nat Prod 1994 Sep;57(9):1320-4. Majd S, Mayer M. Hydrogel stamping of arrays of supported lipid bilayers with various lipid compositions for the screening of drug-membrane and proteinmembrane interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2005 Oct 21;44(41):6697-700. Chakraborty H, Roy S, Sarkar M. Interaction of oxicam NSAIDs with DMPC vesicles: differential partitioning of drugs. Chem Phys Lipids. 2005 Dec;138(1-2):208. Malheiros SV, Brito MA, Brites D, Meirelles NC. Membrane effects of trifluoperazine, dibucaine and praziquantel on human erythrocytes. Chem Biol Interact. 2000 May 1;126(2):79-95. Mao JJ, Sun J, He ZG. Biopartitioning micellar chromatography: its application in evaluating drug membrane transport and activity. Yao Xue Xue Bao. 2005 Oct;40(10):865-70. Martínez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Plasma membrane remodelling and cell stimulation. Med Sci (Paris). 2004 Feb;20(2):189-95. Mavromoustakos T, Zoumpoulakis P, Kyrikou I, Zoga A, Siapi E, Zervou M, Daliani I, Dimitriou D, Pitsas A, Kamoutsis C, Laggner P. Efforts to understand the molecular basis of hypertension through drug:membrane interactions. Curr Top Med Chem. 2004;4(4):445-59.

271

Meng QC, Johansson JS, Eckenhoff RG. Chromatographic approach for determining the relative membrane permeability of drugs. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 Jul 5;774(1):89-95. Middleton DA, Reid DG, Watts A. Combined quantitative and mechanistic study of drug-membrane interactions using a novel 2H NMR approach. J Pharm Sci. 2004 Feb;93(2):507-14. Min ZD, Jiang H, Liang JY. Studies on the taxane diterpenes of the heartwood from Taxus mairei. Yao Hsueh Hsueh Pao 1989;24(9):673-7. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics,by Lauren Pecorino, Oxford University Press, USA; 1 edition (May 21, 2005). Montenez JP, Van Bambeke F, Piret J, Brasseur R, Tulkens PM, Mingeot-Leclercq MP. Interactions of macrolide antibiotics (Erythromycin A, roxithromycin, erythromycylamine

[Dirithromycin],

and

azithromycin)

with

phospholipids:

computer-aided conformational analysis and studies on acellular and cell culture models. Toxicol Appl Pharmacol. 1999 Apr 15;156(2):129-40. National Study Commission on Cytotoxic Exposure - Recommendations for Handling Cytotoxic Agents. Available from Louis P. Jeffrey, ScD, Chairman, National Study Commission on Cytotoxic Exposure. Massachusetts College of Pharmacy and Allied Health Sciences, 179 Longwood Avenue, Boston, Massachusetts, 02115. Nusbaum P, Lainé C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing and vesicle release, CD43 and CD16 down-regulation and phosphatidylserine externalization. Biochem Soc Trans. 2004 Jun;32(Pt3):477-9. Oberdoerffer P, Sinclair DA. The role of nuclear architecture in genomic instability and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Sep;8(9):692-702.

272

Ornskov E, Gottfries J, Erickson M, Folestad S. Experimental modelling of drug membrane permeability by capillary electrophoresis using liposomes, micelles and microemulsions. J Pharm Pharmacol. 2005 Apr;57(4):435-42. OSHA

Work-Practice

Guidelines

for

Personnel

Dealing

with

Cytotoxic

(Antineoplastic) Drugs. Am J Hosp Pharm 1986; 43:1193-1204. Pajak B, Molnar J, Engi H, Orzechowski A. Preliminary studies on phenothiazinemediated reversal of multidrug resistance in mouse lymphoma and COLO 320 cells. In Vivo. 2005 Nov-Dec;19(6):1101-4. Pajeva I, Todorov DK, Seydel J. Membrane effects of the antitumor drugs doxorubicin and thaliblastine: comparison to multidrug resistance modulators verapamil and trans-flupentixol. Eur J Pharm Sci. 2004 Feb;21(2-3):243-50. Paulussen JJ, Fischer MJ, Zuidam NJ, v Miltenburg JC, de Mol NJ, Janssen LH. Influence of the antiallergic drug oxatomide and derivatives on membrane structures: relation with inhibition of calcium influx in rat basophilic leukemia cells. Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, Campos A. Interaction of quinine with model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci. 2003 Jan;92(1):4557. Principles of Molecular Oncology, by Miguel H. Bronchud, MaryAnn Foote, Giuseppe Giaccone, Olufunmilayo I. Olopade, Paul Workman (Editors), Humana Press; 3rd ed. edition (November 30, 2007). Rabow AA, Shoemaker RH, Sausville EA, Covell DG. Mining the National Cancer Institute's tumor-screening database: identification of compounds with similar cellular activities. J Med Chem. 2002 Feb 14; 45(4): 818-40. Rakotomanga M, Saint-Pierre-Chazalet M, Loiseau PM. Alteration of fatty acid and sterol metabolism in miltefosine-resistant Leishmania donovani promastigotes

273

and consequences for drug-membrane interactions. Antimicrob Agents Chemother. 2005 Jul;49(7):2677-86. Recommendations for the Safe Handling of Parenteral Antineoplastic Drugs. NIH Publication No. 83-2621. For sale by the Superintendent of Documents, US Government Printing Office, Washington, DC 20402. Robertson IG, Atwell GJ, Baguley BC. The relationship between lipophilichydrophilic balance, uptake and anti-bacteriophage lambda activity of experimental anti-tumour bisquaternary salts. Chem Biol Interact. 1988; 65(1): 85-95. Rodrigues C, Gameiro P, Reis S, Lima JL, de Castro B. Derivative spectrophotometry as a tool for the determination of drug partition coefficients in water/dimyristoyl-L-alpha-phosphatidylglycerol (DMPG) liposomes. Biophys Chem. 2001 Dec 11;94(1-2):97-106. Rodriguez-Casado A, Molina M, Carmona P. New accessory for studies of isotopic 1H/2H exchange and biomolecular interactions using transmission infrared spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2006 May; 385(1): 134-8. Rojo F, Dalmases A, Corominas JM, Albanell J. Pharmacodynamics: biological activity of targeted therapies in clinical trials. Clin Transl Oncol. 2007 Oct;9(10):63444. Schop H, Wiese M, Cordes HP, Seydel JK. Partial resistance of E. coli mutants against 2, 4-diamino-5-benzylpyrimidines by interactions with bacterial membrane lipopolysaccharides. Derivation of quantitative structure-binding relationships. Schreier S, Malheiros SV, de Paula E. Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects. Schultz H, Hume J, Zhang de S, Gioannini TL, Weiss JP. A novel role for the bactericidal/permeability increasing protein in interactions of gram-negative bacterial outer membrane blebs with dendritic cells. J Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2477-84.

274

Semin Hematol. 1999 Jan;36(1 Suppl 1):2-6. Shanghai Kou Qiang Yi Xue. 2004 Aug;13(4):252-5. Sharma SV, Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes Dev. 2007 Dec 15;21(24):3214-31. Sharp SY, O'Neill CF, Rogers P, Boxall FE, Kelland LR. Retention of activity by the new generation platinum agent AMD0473 in four human tumour cell lines possessing acquired resistance to oxaliplatin. Eur J Cancer. 2002 Nov;38(17):230915. Sheetz MP, Sable JE, Döbereiner HG. Continuous membrane-cytoskeleton adhesion requires continuous accommodation to lipid and cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006;35:417-34. Shen YC, Chen CY, Kuo YH. A new taxane diterpenoid from Taxus mairei. J Nat Prod 1998 Jun 26;61(6):838-40. Shen YC, Chen CY. Taxane diterpenes from Taxus mairei. Planta Med 1997 Dec;63(6):569-70. Shen YC, Tai HR, Chen CY. New taxane diterpenoids from the roots of Taxus mairei. J Nat Prod 1996 Feb;59(2):173-6. Shi QW, Oritani T, Sugiyama T, Yamada T. Isolation and structural determination of a novel bicyclic taxane diterpene from needles of the Chinese yew, Taxus mairei. Biosci Biotechnol Biochem 1999 Apr;63(4):756-9. Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Kiyota H. Three novel bicyclic 3,8-secotaxane diterpenoids from the needles of the chinese yew, taxus chinensis var. mairei. J Nat Prod 1998 Nov;61(11):1437-40.

275

Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Three novel bicyclic taxane diterpenoids with verticillene skeleton from the needles of Chinese yew, Taxus chinensis var. mairei. Planta Med 1999 May;65(4):356-9. Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Two bicyclic taxane diterpenoids from the needles of taxus mairei. Phytochemistry 1999 Feb;50(4):633-6. Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514. Skrede S, Holmsen H. A role for antipsychotic agents in the membrane hypothesis of schizophrenia? Tidsskr Nor Laegeforen. 2003 Sep 25;123(18):2568-70. Srinivasan V, Ciddi V, Bringi V. Shuler ML, Metabolic inhibitors, elicitors, and precursors as tools for probing yield limitation in taxane production by Taxus chinensis cell cultures. Biotechnol Prog 1996 Jul-Aug;12(4):457-65. Sugawara M, Takekuma Y, Yamada H, Kobayashi M, Iseki K, Miyazaki K. A general approach for the prediction of the intestinal absorption of drugs: regression analysis using the physicochemical properties and drug-membrane electrostatic interaction. Sun J, Zhang T, He Z. Immobilized artificial membrane chromatography and its application in profiling the drug membrane transport. Se Pu. 2005 Jul;23(4):37883. Targeted Molecular Imaging in Oncology, by E. Edmund Kim and David J. Yang (Editors), Springer; 1 edition (January 15, 2001). The Biology of Cancer, by Robert A. Weinberg, Garland Science; 1 edition (June 9, 2006). The Molecular Biology of Cancer, by Michael Khan, Stella Pelengaris (Editors), Wiley-Blackwell; 1 edition (February 28, 2006).

276

Thein-Han WW, Stevens WF. Transdermal delivery controlled by a chitosan membrane. Drug Dev Ind Pharm. 2004 Apr;30(4):397-404. Tokes ZA, Rogers KE, Rembaum A. Synthesis of adriamycin-coupled polyglutaraldehyde microspheres and evaluation of their cytostatic activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Mar; 79(6): 2026-30. Tournaviti S, Hannemann S, Terjung S, Kitzing TM, Stegmayer C, Ritzerfeld J, Walther P, Grosse R, Nickel W, Fackler OT. SH4-domain-induced plasma membrane dynamization promotes bleb-associated cell motility. J Cell Sci. 2007 Nov 1;120(Pt 21):3820-9. Uchiyama Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Arch Histol Cytol. 1995 Jun;58(2):127-37. Venkitaraman AR. Chromosomal instability in cancer: causality and interdependence. Cell Cycle. 2007 Aug;6(19):2341-3. 2007 Jul 18. Venter BR, Venter JC, Kaplan NO. Affinity isolation of cultured tumor cells by means of drugs and hormones covalently bound to glass and Sepharose beads. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 Jun; 73(6): 2013-7. Vereb G Jr, Panyi G, Balazs M, Matyus L, Matko J, Damjanovich S. Effect of cyclosporin A on the membrane potential and Ca2+ level of human lymphoid cell lines and mouse thymocytes. Biochim Biophys Acta. 1990 Aug 30;1019(2):159-65. Verkleij AJ, Post JA. Physico-chemical properties and organization of lipids in membranes: their possible role in myocardial injury. Basic Res Cardiol. 1987;82 Suppl 1:85-91. Voltz E, Gronemeyer H. A new era of cancer therapy: Cancer cell targeted therapies are coming of age. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(1):1-8.

277

Wang Y. Chromosome instability in yeast and its implications to the study of human cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2091-102. Wang YJ, Sun J, He ZG. Liposome electrokinetic chromatography and its application in evaluating drug-membrane interactio. Yao Xue Xue Bao. 2006 Jul;41(7):583-8. Wiese M, Pajeva IK. Molecular modeling study of the multidrug resistance modifiers cis- and trans-flupentixol. Pharmazie. 1997 Sep;52(9):679-85. Yang Q, Liu XY, Ajiki S, Hara M, Lundahl P, Miyake J. Avidin-biotin immobilization of unilamellar liposomes in gel beads for chromatographic analysis of drug-membrane partitioning. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1998 Apr 10;707(12):131-41. Yang Q, Liu XY, Yoshimoto M, Kuboi R, Miyake J. Covalent immobilization of unilamellar liposomes in gel beads for chromatography. Anal Biochem. 1999 Mar 15;268(2):354-62. Yoon KA, Burgess DJ. Mathematical modelling of drug transport in emulsion systems. J Pharm Pharmacol. 1998 Jun;50(6):601-10. Zhang S, Chen WM, Chen YH. Isolation and identification of two new taxane diterpenes

from

Taxus

chinensis

(Pilger)Rehd.

Yao

Hsueh

Hsueh

Pao

1992;27(4):268-72. Zhang S, Tung-Ling Lee C, Kashiwada Y, Chen K, Zhang DC, Lee KH, Yunantaxusin A, a new 11(15-->1)-abeo-taxane from Taxus yunnanensis. J Nat Prod 1994 Nov;57(11):1580-3. Zhao L, Feng SS. Effects of lipid chain unsaturation and headgroup type on molecular

interactions

between

paclitaxel

and

phospholipid

within

model

biomembrane. J Colloid Interface Sci. 2005 May 1;285(1):326-35.

278

Zhao L, Feng SS. Effects of cholesterol component on molecular interactions between paclitaxel and phospholipid within the lipid monolayer at the air-water interface. J Colloid Interface Sci. 2006 Aug 1;300(1): 314-26.

279

EK-6: GEN AKTARIMI İLE İLGİLİ GÜNCEL REFERANSLAR

280

ADRIAN-SCOTTO M, Vasileva D., Mallet G., Vasilescu D., About Hydration of Mg2+: a quantum DFT study, Internet Electron. J. Mol. Des., 1, 1-13, (2003). AHMAD R., Arakawa H., Tajmir-Riahi H. A., A Comparative Study of DNA Complexation with Mg(II) and Ca(II) in Aqueous Solution: Major and Minor Grooves Bindings, Biophys. J., 84, 2460-2466, (2003). AKAO T., Fukumoto T., Ihara H., Ito A., Conformational Change in DNA Induced by Cationic Bilayer Membranes, FEBS Lett., 391 (1-2), 215-8, (1996). AKHTAR, S., Basu, S., Wickstrom, E., Juliano, R. L., Cationic liposome-mediated transfection with lipofection reagent Methods of Molecular Biology, 91-98, (1991). ANGELOVA M. I., Tsoneva I., Interactions of DNA with Giant Liposomes, Chem. Phys. Lipids, 101, 1, 123-137, (1999). ANCHORDOQUY, T. J., Dean Allison, S., Molina, M. D. C., Girouard, L. G., and Carson, T. K., Physical Stability of DNA-Based Therapeutics, Drug Disc. Today, 6, 463-470, (2001). ANWER K. B,, Rhee G., Mendiratta S.K., Recent Progress in Polymeric Gene Delivery Systems, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier. Syst., 20(4), 249-293, (2003). AVRAMOVIC-ZIKIC O., Colbow K., Turbidity Changes of Lipid Vesicles Near the Phase Transition Temperature as an Indication of Fusion, Biochim Biophys Acta, Sep 11, 512(1), 97-104, (1978). AZZAM T., Domb A. J., Current Developments in Gene Transfection Agents, Curr Drug Deliv., Apr;1(2), 165-93, (2004). BALKRISHNAN K., Mehdi S. Q., McConnell H. M., Binding and Mobility of AntiDinitrophenyl Monoclonal Antibodies on Fluid-like Langmuir-Blodgett Phospholipid Monolayers Containing Dinitrophenylated Phospholipids, Biochim. Biophysic. Acta, 1064, 219-228, (1991).

281

BANYAY, M., Sarkar, M. and Gräslund, A., A Library of IR Bands of Nucleic Acids in Solution, Biophys. Chem., 104, 477-488, (2003). BARTOSCH B., Cosset F. L., Strategies for Retargeted Gene Delivery using Vectors Derived from Lentiviruses, Curr Gene Ther., Dec;4(4), 427-43, (2004). BICHENKOV E. E., Budker V. G., Korobeinicheva I. K., Savchenko E. V., Filimonov V. V., DNA Interaction with Phosphatidylcholine Liposomes. Melting of DNA and Phase Transition of the Lipid Membrane in the Complex, Biologicheski Membrani, 5, 8, 843-851 (1988). BINDER, H., and Zschörnig, O., The Effect of Metal Cations on the Phase Behavior and Hydration Charactersitics of Phospholipid Membranes, Chem. Phys. Lipids, 115, 39-61, (2002). BLOOMFIELD V. A., Crothers D. M., Tinoco I. Jr., Nucleic Acids-Structures, Properties, and Functions, University Science Books, Sausalito, California, (2000). BRAUN C. S., Kueltzo L. A., Midaugh C. R., Ultraviolet Absorption and Circular Dichroism Spectroscopy of Nonviral Gene Delivery Complexes, In: Methods in Molecular Medicine, vol. 65: Nonviral Vectors for Gene Therapy, M. A. Findeis (Ed.), Humana Press Inc., Totowa, NJ., (2001), pp.253-284. BRUNI, P., Cingolani, F., Iacussi, M., Pierfederici, F. , and Tosi, G., The Effect of Bivalent Metal Ions on Complexes DNA-Liposome: a FT-IR Study, 565-566, 237-245, (2001). BUELER H.,Adeno-Associated Viral Vectors for Gene Transfer and Gene Therapy, Biol Chem., Jun;380(6), 613-22, (1999). BURCKBUCHLER V., Wintgens V., Lecomte S., Percot A., Leborgne C., Danos O., Kichler A., Amiel C., DNA Compaction into New DNA Vectors Based on Cyclodextrin

282

Polymer: Surface Enhanced Raman Spectroscopy Characterization, Biopolymers, Apr 5;81(5), 360-70, (2006). BURTON E. A., Fink D. J., Glorioso J. C., Gene Delivery Using Herpes Simplex Virus Vectors, DNA Cell Biol., Dec;21(12), 915-36, (2002). CAFFREY M., Lipidat, CRC Press, Inc. (1993). CARACCIOLO G., Pozzi D., Amenitsch H., Caminiti R., Multicomponent Cationic Lipid-DNA Complex Formation: Role of Lipid Mixing, Langmuir, Dec 6; 21 (25), 11582-7, (2005). CASTELLI F., Raciti G. ,A Calorimetric Study of the Influence of Divalent Cations on the Thermotropic Behaviour of some Phosphatidylcholines, Thermochim. Acta, 186, 205-215, (1991). CHABAUD P., Camplo M., Payet D., Serin G., Moreau L., Barthelemy P., Grinstaff M. W., Cationic Nucleoside Lipids for Gene Delivery, Bioconjug Chem., Mar-Apr;17(2), 466-72, (2006). CHALIKIAN T. V., Völker G., Plum E., Breslauer K. J., A More Unified Picture for the Thermodynamics of Nucleic Acid Duplex Melting: A Characterization by Calorimetric and Volumetric Techniques, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7853-7858, (1999). CHONG C. S., Colbow K., Light Scattering and Turbidity Measurements of Lipid Vesicles, Biochim. Biophys. Acta, 436, 260-282, (1976). CHU D., Sullivan C. C., Weitzman M. D., Du L., Wolf P. L., Jamieson S. W., Thistlethwaite P. A., Direct Comparison of Efficiency and Stability of Gene Transfer into the Mammalian Heart Using Adeno-Associated Virus Versus Adenovirus Vectors, J. Thorac Cardiovasc Surg., Sep;126(3), 671-9, (2003).

283

CLEMENT, J., Keifer, K., Kimpfler, A., Garidel, P., and Peschka-Süss, R., Large-Scale Production of Lipoplexes With Long Shelf-Life, Eur. J. Pharmaceut. Biopharm., 59, 35-43, (2005). CONWAY J. E., Zolotukhin S., Muzyczka N., Hayward G. S., Byrne B. J., Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Replication and Packaging is Entirely Supported by a Herpes Simplex Virus Type 1 Amplicon Expressing Rep and Cap., J. Virol., Nov;71(11), 8780-9, (1997). DANG J. M., Leong K. W., Natural Polymers for Gene Dlivery and Tissue Engineering, Adv Drug Deliv Rev., Jun 6; (2006). DASS R., Cytotoxicity Issues Pertinent to Lipoplex-Mediated Gene Therapy In-Vivo, J. Pharm. Pharmacol., 54, 593-601, (2002). de GENNES P-G., Problems of DNA Entry into a Cell, Physica A, 274, 1-7, (1999). DRITSCHILO, A., Thierry, A.R., Rahman, A., Targeted delivery of DNA by liposomes and polymers, J. of Contr. Release, 19, 269-274, (1992). DUGUID J. G., Bloomfield V. A., Aggregation of Melted DNA by Divalent Metal IonMediated Cross-Linking, Biophys J., 69, 2642-2648, (1995). EGBARIA K., Weiner N., Hydroxylated Nylon Polymers Hydroxylated Nylons Based on Unprotected Esterified D-Glucaric Acid by Simple Condensation Reactions, J. Amer. Chem. Soc., 116, 571-578, (1994). EL-ANEED A., An Overview of Current Delivery Systems in Cancer Gene Therapy, J. Control Release., Jan 8;94(1),1-14, (2004). ESPONDA P., Goldstein M., Witkin S. S., In Vitro Transfection of the Human Vas Deferens Using DNA-Liposome and DNA-Neutral Lipid Complexes, Fertility and Sterility, 81;1, 171-175, (2004).

284

FALKNER F. G., Holzer G. W., Vaccinia Viral/Retroviral Chimeric Vectors, Curr Gene Ther., Dec;4(4), 417-26, (2004). FELGNER P. L., Liposomes for the transformation of eukaryotic cells, Biochim. Biophysica Acta, 1097, 1-17, (1991). FLETCHER S., Ahmad A., Perouzel E., Heron A., Miller A. D., Jorgensen M. R., In Vivo Studies of Dialkynoyl Analogues of DOTAP Demonstrate Improved Gene Transfer Efficiency of Cationic Liposomes in Mouse Lung, J. Med Chem., Jan 12; 49 (1), 349-57, (2006). FLETCHER S., Ahmad A., Perouzel E., Jorgensen M. R., Miller A. D., A Dialkynoyl Analogue of DOPE Improves Gene Transfer of Lower-Charged, Cationic Lipoplexes, Org Biomol Chem., Jan 21; 4 (2), 196-9, (2005). FLOTTE T. R., Laube B. L., Gene Therapy in Cystic Fibrosis, Chest., Sep;120(3 Suppl), 124S-131S, (2001). FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141, (1998). FRAÚSTO DA SILVA J. J. R., Williams R. J. P., The Biological Chemistry of the Elements. The Inorganic Chemistry of Life, Chapter 9: The Biological Chemistry of Magnesium:Phosphate Metabolism, 2nd. ed., Oxford University Press, Oxford, New York, (2001), pp. 251-276. FUJII G. ,To Fuse or Not to Fuse: The Effects of Electrostatic Interactions, Hydrophobic Forces, and Structural Amphiphilicity on Protein-Mediated Membrane Destabilization, Adv Drug Deliv Rev., 20; 38(3), 257-277, (1999). GAMON B. L., Virden J. W., Berg J. C., The Aggregation Kinetics of an Electrostatically Stabilized Dipalmitoyl Phosphatidylcholine System, J. Coll. Interf. Science, 132, 1, 125-138, (1989).

285

GARIDEL, P., Blume, A., and Hübner, W., A Fourier Transform Infrared Spectroscopic Study of the Interaction of Alkaline Earth Cations With the Negatively Charged Phospholipid 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol,. Biochim. Biophys. Acta, 1466, 245-259, (2000). GAUGER, D.R., Selle, C., Fritzsche, H., and Pohle, W., Chain-Length Dependence of the Hydration Properties of Saturated Phosphatidylcholines as Revealed by FTIR Spectroscopy, J. Mol. Structure, 565-566, 25-29, (2001). GEBHART C. L., Kabanov A. V., Evaluation of Polyplexes as Gene Transfer Agents, J. Contr. Releas., 73, 401-416, (2001). GEILEN C. C., Wieder T., Haase A., Reutter W., Morre D. M., Moore D. J., Pharmacokinetic Behavior and Antineoplastic Activity of LiposomalHexadecylphosphocholine, Cancer Chemotherapy & Pharmacology, 34, 393-398, (1994). GELBART W. M., Bruinsma R. F., Pincus P. A., Parsegian V. A., DNA-Inspired Electrostatics, Physics Today, Sep., 38-44, (2000). GODBEY W. T., Atala A., In Vitro Systems for Tissue Engineering, Ann N Y Acad Sci., Jun;961, 10-26, (2002). GRDADOLNIK J., Hadzi D., Conformational Effects of Metal Salt Binding to the Polar Head of Phosphatidylcholines iIvestigated by FTIR Spectroscopy, Chem. Phys. Lipids, 65, 121-132, (1993). GREGORIADIS G. (Ed.)., Liposome Technology, Vol 1, 2, and 3, CRC Press, Inc., (1993). GUNSTONE F. D., Harwood J. L.and Padley, F. B., The Lipid Handbook, 2nd Ed., CRC Pres., (1994).

286

GÜNZLER, H. and Gremlich, H.-U., IR Spectroscopy. An Introduction, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69469, Weinheim (Germany), (2002). HACKL, E. V., Kornilova, S. V., Kapinos, L. E., Andrushchenko, V. V., Galkin, Vi L., Grigoriev, D. N., and Blagoi, Yu. P., Study of Ca2+, Mn2+ and Cu2+ Binding to DNA in Solution by Means of IR Spectroscopy, J. Mol. Structure, 408/409, 229-232, (1997). HART S.L. Lipid Carriers for Gene Therapy, Curr Drug Deliv., Oct; 2 (4), 423-8, (2005). HAUSER H., Effect of Inorganic Cations on Phase Transitions, Chem. Phys. Lipids , 57, 309-325, (1991). HENDRIE P. C., Russell D. W., Gene Targeting with Viral Vectors, Mol Ther., Jul;12(1), 9-17, (2005). HENDRIKS W. T., Ruitenberg M. J., Blits B., Boer G. J., Verhaagen J., Viral VectorMediated Gene Transfer of Neurotrophins to Promote Regeneration of the Injured Spinal Cord, Prog Brain Res., 146, 451-76, (2004). HERMANSON, G. T., Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Pres, (1996). HINRICHS W. L., Mancenido F. A., Sanders N. N., Braeckmans K., De Smedt S. C., Demeester J., Frijlink H. W., The Choice of a Suitable Oligosaccharide to Prevent Aggregation of PEGylated Nanoparticles During Freeze Thawing and Freeze Drying, Int J Pharm., Mar 27; 311 (1-2), 237-44, (2006). HOLT J. R., Johns D. C., Wang S., Chen Z. Y., Dunn R. J., Marban E., Corey D. P., Functional Expression of Exogenous Proteins in Mammalian Sensory Hair Cells Infected with Adenoviral Vectors, J. Neurophysiol., Apr;81(4), 1881-8, (1999). HUD N. V. Polak M., DNA – Cation Interactions: The Major and Minor Grooves are Flexible Ionophores, Curr Opin Struct Biol., 11, 293-301, (2001).

287

HUG P., Slight, R. G., Liposomal delivery as a new approach to transport antisense oligonucleotides, Gene Regulation, Erickson, R. P. & Izant, G., (Eds.), (1992), Raven Press, New York., Pp: 147-161. HÜBNER, W. and Blume, A., Interactions at the Lipid-Water Interface, Chem. Phys. Lipids, 96, 99-123, (1998). IGARASHI S, Hattori Y, Maitani Y, Biosurfactant MEL-A Enhances Cellular Association and Gene Transfection by Cationic Liposome, J. Control Release, May 30; 112(3), 362-8, (2006). IVANOV I. I., Chapter V: Calorimetric Methods of Studying Biopolymers and Membrane Systems, in: Modern Methods of Biophysical Investigations – a Practicum of Biophysics, Ed. A. B. Rubin, Vishaya Shkola, Moscow, (1988), pp 203 – 216. JANG J. H., Houchin T. L., Shea L. D., Gene Delivery from Polymer Scaffolds for Tissue Engineering, Expert Rev Med Devices, Sep;1(1),127-38, (2004). JANOFF, A. S. (Ed.), Liposomes: Rational Design, Marcel Dekker (1998). JEWELL C. M., Hays M. E., Kondo Y., Abbott N. L., Lynn D. M., FerroceneContaining Cationic Lipids for the Delivery of DNA: Oxidation State Determines Transfection Activity, J. Control Release, May 1; 112(1), 129-38, (2006). JOHNSTON, S. F., Fourier Transform Infrared – A Constantly Evolving Technology, Ellis Horwood Limited, (1991). JULIANO R. L., Peptide and protein drugs: I. Therapeutic applications, absorption and parenteral administration, Inter. J. Pharm., 75, 97-115, (1991). JULLIEN L., Cottet H., Hamelin B., Jardy A., Thermodynamic Behaviour of a Supramolecular System Self-Assembled by Electrostatic Interaction in Aqueous

288

Solution. Results and Theoretical Analysis, J. Phys. Chem. B, 103, 10866-10875, (1999). KABANOV A.V., Kabanov V. A., DNA Complexes with Polycations for the Delivery of Genetic Material into Cells, Bioconjug Chem., Jan-Feb;6(1), 7-20, (1995). KAMIYA H., Akita H., Harashima H., Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Considerations in Gene Therapy, Drug Discov Today, 1; 8(21), 990-6, (2003). KAPLITT M. G., Makimura H., Defective Viral Vectors as Agents for Gene Transfer in the Nervous System, J. Neurosci Methods, Jan;71(1), 125-32, (1997). KARMALI P. P., Majeti B. K., Sreedhar B., Chaudhuri A., In Vitro Gene Transfer Efficacies and Serum Compatibility Profiles of Novel Mono-, Di-, and TriHistidinylated Cationic Transfection Lipids: A Structure-Activity Investigation, Bioconjug Chem., Jan-Feb; 17(1):, 59-71, (2006). KAUFMANN-KOLLE P., Drevs J., Berger M. R., Kotting J., Marschner N., Unger C., Eibl H., Topical Administration of Hexadecyl-Phosphocholine in Patients with Cutaneous Lymphomas: Results of a Phase I/II study, J. of the American Academy of Dermatology, 29, 963-970, (1993). KAWAKAMI S., Ito Y., Fumoto S., Yamashita F., Hashida M., Enhanced Gene Expression in Lung by a Stabilized Lipoplex Using Sodium Chloride for Complex Formation, J Gene Med., Dec; 7 (12), 1526-33, (2005). KEILY D. E., Chen, L., Lin T. H., Alkyl Phosphocholine Structure of Glucagon-Like Peptide (7-36) Amide in a Dodecyl-Phosphocholine Micelle as Determined by 2D NMR, Biochemistry, 33, 3532-3539, (1994). KHALIL I. A., Kogure K., Akita H., Harashima H., Uptake Pathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery, Pharmacol Rev., Mar; 58(1), 3245, (2006).

289

KHARAKOZ D. P., Khusainova R. S., Gorelov A. V., Dawson K. A., Stoichiometry of Dipalmytoilphosphatidylcholine-DNA Interaction in the Presence of Ca2+: a Temperature-Scanning Ultrasonic Study, FEBS Lett., 446, 27-29, (1999). KHAZANOV E., Simberg D., Barenholz Y., Lipoplexes Prepared from Cationic Liposomes and Mammalian DNA Induce CpG-Independent, Direct Cytotoxic Effects in Cell Cultures and in Mice, J. Gene Med., (2006). KIRBY C. J., Gregoriadis G., Liposomes, in: E. Mathiowitz (Ed.), Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, Vol. 1, John Wiley &Sons, Inc., (1999), pp. 461-492. KOBAYASHI, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery, In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318. KOOTSTRA, N. A., Verma I. M., Gene Therapy with Viral Vectors, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 43, 413-39, (2003). KOYNOVA R., Koumanov A., Tenchov B., Metastable Rippled Gel Phase in Saturated Phosphatidylcholines: Calorimetric and Densitometric Characterization, Biochim. Biophys. Acta, 1285, 101-108, (1996). KOYNOVA R., Wang L., Tarahovsky Y., MacDonald R. C., Lipid Phase Control of DNA Delivery, Bioconjug Chem., Nov-Dec;16 (6), 1335-9, (2005). KUVITCHKIN V. V., Sukhomudrenko A. G., Interaction of Natural and Synthetic Polynucleotides with Liposomes in the Presence of Divalent Cations, Biophysics, XXXII, 4, 628-633 (1987). LAI, E., van Zanten, J. H., Evidence of Lipoplex Dissociation in Liquid Formulations, J. Pharm. Sci., 91, 1225-1232, (2002). LAM M. I., Cullis P. R., Calcium Enhances the Transfection Potency of Plasmid DNACationic Liposome Complexes, Biochim. Biophys. Acta, 1463, 279-290, (2000).

290

LAMBERT G., Fattal E., Couvreur P., Nanoparticulate Systems for the Delivery of Antisence Oligonucleotides, Adv. Drug Del. Rev., 47, 99-112, (2001). LASIC D. D. & Yechezkel B., Handbook of Nonmedical Applications of Liposomes, Vol. I, II, III, & IV, CRC Press, Inc., (1996). LASIC D. D. (Ed.), Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, Inc., (1997). LASIC D. D. and Papahadjopoulos D. (Ed.), Medical Applications Of Liposomes, Elsevier Press. LASIC D. D. and Templeton N. S. (Ed.), Gene Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Marcel Dekker (2000). LASIC, D. D., Targeted liposomes and intracellular delivery of macromolecules, Progress in Clinical and Biology Research, 343, 95-102, (1990). Le BIHAN, T., and Pézolet, M., Study of the Structure and Phase Behavior of Dipalmitoylphosphatidylcholine by Infrared Spectroscopy: Characterization of the Pretranstion and Subtransition, Chem. Phys. Lipids, 94, 13-33, (1998). LESERMAN, L., Machy, P., Leonetti, P., Jilhaud, P. G., Degols, G., Lebleu, B., Liposomal Drug Delivery System, Polymembrane Preparation ,Vol. 31, 159-160, (1990). LEVENTIS R., Silvius J. R., Systemic Gene Expression After Intravenous DNA Delivery in Adult Mice, Science, 261, 209-211, (1993). LEWIS, R. N. A. H., Winter, I., Kriechbaum M., Lohner, K. and McElhaney, R. N. Studies of the Structure and Organization of Cationic Lipid Bilayer Membranes: Calorimetric, Spectroscopic, and X-ray Diffraction Studies of Linear Saturated P-Oethyl Phosphatidylcholines, Biophys. J., 60, 1329-1342, (2001).

291

LEWIS, R.N.A.H. and McElhaney, R.N., Fourier Transform Infrared Spectroscopy in The study of Hydrated Lipids and Lipid Bilayer Membranes. in: H.H. Mantsch and D. Chapman (Eds.), Infrared Spectroscopy of Biomolecules. Wiley-Liss, New York, (1996), Pp: 159-202. LIN A. J., Slack N. L., Ahmad A., George C. X., Samuel C. E., Three-Dimensional Imaging of Lipid Gene-Carriers: Membrane Charge Density Controls Universal Transfection Behaviour in Lamellar Cationic Liposome-DNA Complexes, Biophys. J., 84, 3307-3316, (2003). LIU F., Huang L., Development of Non-Viral Vectors for Systemic Gene Delivery, J. Contr. Release, 78, 259-266, (2002). Liposome Preparation, Pharmaceutical Manufacturing of Liposomes, Martin F. J. (1990), In: Liposomes as Drug Delivery Systems, Part I: Preparation, Pharmaceutical Technology Volume 16, (1992), Pp: 96-106. LOBO B. A., Rogers S. A., Wiethoff C. M., Choosakoonkriang S., Bogdanovich-Knipp S., Middaugh C. R., Characterization of Cationic Vector-Based Gene Delivery Vehicles Using Isothermal Titration and Differential Scanning Calorimetry, in: Methods in Molecular Medicine, Vol. 65, Nonviral Vectors for Gene Therapy, Eds. M. A. Findeis, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, (2001), pp 319-348. LOHMEYER M., Bittman R., Uptake, Subcellular Distribution and Metabolism of the Phospholipid Analogue Hexadecylphosphocholine in MCDK Cells, Biochemica et Biophysica Acta, 1211, 14-22, (1994). LOPEZ-BARCONS L. A., Polo D., Llorens A., Reig F., Fabra A., Targeted Adriamycin Delivery to MXT-B2 Metastatic Mammary Carcinoma Cells by Transferrin Liposomes: Effect of Adriamycin ADR-to-Lipid Ratio, Oncol Rep., Nov; 14 (5), 133743, (2005).

292

LOSER P., Huser A., Hillgenberg M., Kumin D., Both G. W., Hofmann C., Advances in the Development of Non-Human Viral DNA-Vectors for Gene Delivery, Curr Gene Ther., May;2(2), 161-71, (2002). MACDONALD P. M., Leisen J., Marassi F. M., Responce of Phosphatidylcholine in the Gel and Liquid-Crystalline States to Membrane Surface Charges, Biochemistry, 30, 3558-3566, (1991). MACDONALD R. C., Gorbonos A., Momsen M. M., Brockman H. L., Surface Properties of Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Ethylphosphocholine, A Cationic Phosphatidylcholine Transfection Agent, Alone and in Combination with Lipids or DNA, Langmuir, Mar 14; 22(6), 2770-9, (2006). MAH C., Byrne B. J., Flotte T. R., Virus-Based Gene Delivery Systems, Clin Pharmacokinet., 41(12), 901-11, (2002). MAHESHRI N., Koerber J. T., Kaspar B. K., Schaffer D. V., Directed Evolution of Adeno-Associated Virus Yields Enhanced Gene Delivery Vectors, Nat Biotechnol., Feb;24(2):198-204, (2006). MARSH D., Handbook of Lipid Bilayers, CRC Press, Inc., (1990). MARUYAMA, K., Kennel, S. & Huang, L., Liposomes designed to avoid the reticuloendothelial system, Progress in Clinical and Biological Research, 343, 85-93, (1990). MATSUZAKİ K. O., Murase K., Sugishita S., Yoneyama K., Akada M., Ueha A., Nakamura Kobayashi S., Optical Characterization of Liposomes by Right Angle Light Scattering and Turbidity Measurement, Biochim. Biophys. Acta, 1467, 219-226, (2000). MAXWELL I. H., Spitzer A. L., Long C. J., Maxwell F., Autonomous Parvovirus Transduction of a Gene Under Control of Tissue-Specific or Inducible Promoters, Gene Ther., Jan;3(1), 28-36, (1996).

293

McCULLOUGH, H. N, Juliano, R. L., Liposomes: a pulmonary perspective, In:Liposomes as Drug Carriers, Gregoriadis, G., (Ed.), (1988), Pp: 679-694. Measured by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, Biophys. J., 58, 1235-1249, (1990). MEIDAN V. M, Glezer J., Salomon S., Sidi Y., Barenholz Y., Cohen J. S., Lilling G., Specific Lipoplex-Mediated Antisense Against Bcl-2 in Breast Cancer Cells: A Comparison Between Different Formulations, J. Liposome Res., Mar;16(1), 27-43, (2006). MEL'NIKOV S. M., Dias R., Mel'nikova Y. S., Marques E. F., Miguel M. G., Lindman B., DNA Conformational Dynamics in the Presence of Catanionic Mixtures, FEBS Lett., 453, 113-118, (1999). METZ M. Z., Best D. M., Kane S. E., Harvey Murine Sarcoma Virus/MDR1 Retroviral Vectors: Efficient Virus Production and Foreign Gene Transduction Using MDR1 as a Selectable Marker, Virology, Apr 20;208(2), 634-43, (1995). MIHALKO P., Schreier, H., Abra, R. M., Liposomes for pulmonary applications, In: Modern Medicine of Canada, Volume 45, (1990), Pp: 233-237. MILLER A. D., Nonviral Liposomes. Methods Mol. Med., 90, 107-38, (2004). MILLER D., The Problem with Cationic Liposome/Micelle-Based Non-Viral Vector Systems for Gene Therapy, Curr. Med. Chem., 10, 1195-1211, (2003). MOHR L., Geissler M., Gene Therapy: New Developments, Schweiz Rundsch Med Prax., Dec 18;91(51-52), 2227-35, (2002). MOLDAWER L. L, Edwards P. D., Josephs M., Minter R. M., Copeland E. M. 3rd, MacKay S. L., Application of Gene Therapy to Acute Inflammatory Diseases, Shock, Aug;12(2), 83-101, (1999).

294

MORET-TATAY I., Sanmartin I., Marco F. M., Diaz J., Alino S. F., Nonviral Therapeutic Cell Vaccine Mediates Potent Antitumor Effects, Vaccine, May 1; 24(18), 3937-45, (2006). MÖNKKÖNEN J., Urtti A., Lipid Fusion in Oligonucleotide and Gene Delivery with Cationic Lipids, Adv. Drug Deliv. Rev., 34, 37-49, (1998). NICOLAU C.,Cudd A., Amphipathic Antigens Availability of Dinitrophenylated Lipids Haptens for Specific Antibody Binding Depends on the Physical Properties of Host Bilayer Membranes, J. Biol. Chem., 257, 6434-6439, (1982). NICOLAU, C. & Cudd, A., Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (liposomes), Nucleic Acids Research, 19, 5551-5559, (1991). OKADA T., Caplen N. J., Ramsey W. J., Onodera M., Shimazaki K., Nomoto T., Ajalli R., Wildner O., Morris J., Kume A., Hamada H., Blaese R. M., Ozawa K., In situ Generation of Pseudotyped Retroviral Progeny by Adenovirus-Mediated Transduction of Tumor Cells Enhances the Killing Effect of HSV-tk Suicide Gene Therapy In Vitro and In Vivo, J. Gene Med., Mar;6(3),288-99, (2004). OPANASOPIT P., Nishikawa M., Hashida M., Factors Affecting Drug and Gene Delivery: Effects of Interaction with Blood Components, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst., 19(3), 191-233, (2002). OTTOVA-LEITMANNOVA, A. and Tien H. Ti, Membrane Biophysics: As Viewed from Experimental Bilayer Lipid Membranes (Planar Lipid Bilayers and Spherical Liposomes)., Elsevier, (2001). PAASONEN L., Korhonen M., Yliperttula M., Urtti A., Epidermal Cell Culture Model with Tight Stratum Corneum as a Tool for Dermal Gene Delivery Studies, Int J Pharm., Jan 13; 307 (2), 188-93, (2006). PALMER J. A., Branston R. H., Lilley C. E., Robinson M. J., Groutsi F., Smith J., Latchman D. S., Coffin R.S., Development and Optimization of Herpes Simplex Virus

295

Vectors for Multiple Long-Term Gene Delivery to the Peripheral Nervous System, J. Virol., Jun;74(12), 5604-18, (2000). PAPAHADJOPOULOS, D. & Gabizon, A., Encapsulation/Delivery of DNA Interactions of cationic lipid vesicles with negatively charged phospholipid vesicles and biological membranes, Biochemistry, 27, 3917-3925, (1988). PASSINI M. A., Watson D. J., Wolfe J. H., Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus, Methods Mol Biol.,;246, 225-36, (2004). PEETERS L., Sanders N. N., Braeckmans K., Boussery K., Van de Voorde J., De Smedt S. C., Demeester J., Vitreous: A Barrier to Nonviral Ocular Gene Therapy, Invest Ophthalmol Vis Sci., Oct; 46 (10), 3553-61, (2005). PELISEK J., Gaedtke L., DeRouchey J., Walker G. F., Nikol S., Wagner E., Optimized Lipopolyplex Formulations for Gene Transfer to Human Colon Carcinoma Cells Under In Vitro Conditions, J Gene Med., Feb; 8 (2), 186-97, (2006). PETERS A. R., Dekker, N., van den Berg, L., Boelens, R., Kaptein, R., Slotboom, A. J., de Haas G. H., Antitumor ether lipids and alkyl phosphocholines, Drugs of the Future, 19, 1021-1037, (1994). PEVSNER, A., and Diem, M., IR Spectroscopic Studies of Major Cellular Components. III. Hydration of Protein, Nucleic Acid, and Phospholpid Films, Biopolymers (Biospectroscopy), 72, 282-289, (2003). PHILLIP R., Liggitt D., Phillip M., Dazin P., Debs R., Liposomes as carriers of DNA, Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst., 6, 239-271, (1989). PISARCHICK M. L., Thompson N. L., Immune Clearance of Liposomes Inhibited by an Anti-FC Receptor Antibody in vivo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,83, 2699-2703, (1986).

296

POHLE, W., Gauger, D.R., Fritzsche, H., Rattay, B., Selle, C., Binder, H., and Böhlıg, H., FTIR-Spectroscopic Characterization of Phosphocholine-Headgroup Model Compounds, J. Mol. Structure, 563-564, 463-467, (2001). POHLE, W., Selle, C., Gauger, D. R., Zantl, R., Artzner, F., and Rädler, J. O., FTIR Spectroscopic Characterization of a Cationc Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2, 4642-4650, (2000).

RASMUSSEN U. B., Benchaibi M., Meyer V., Schlesinger Y., Schughart K, Novel Human Gene Transfer Vectors: Evaluation of Wild-Type and Recombinant Animal Adenoviruses in Human-Derived Cells, Hum Gene Ther., Nov 1;10(16), 2587-99, (1999). REMAUT K., Lucas B., Braeckmans K., Sanders N. N., Demeester J., De Smedt S. C. Protection of Oligonucleotides Against Nucleases by Pegylated and Non-Pegylated Liposomes as Studied by Fluorescence Correlation Spectroscopy, J. Control Release, Dec 10; 110 (1), 212-26, (2005). RITTER T., Lehmann M., Volk H. D., Improvements in Gene Therapy: Averting the Immune Response to Adenoviral Vectors, BioDrugs,;16(1),3-10, (2002). ROBBINS P. D., Ghivizzani S. C., Viral Vectors for Gene Therapy, Pharmacol Ther., Oct; 80(1), 35-47, (1998). ROMANCZUK H., Galer C. E., Zabner J., Barsomian G., Wadsworth S. C., O'Riordan C. R., Modification of an Adenoviral Vector with Biologically Selected Peptides: A Novel Strategy for Gene Delivery to Cells of Choice, Hum Gene Ther., Nov 1;10(16), 2615-26, (1999). ROMOREN K., Fjeld X. T., Poleo A. B., Smistad G., Thu B. J., Evensen O., Transfection Efficiency and Cytotoxicity of Cationic Liposomes in Primary Cultures of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) gill cells, Biochim Biophys Acta, Nov 10; 1717 (1), 50-7, (2005). BOULANGER C., Di Giorgio C., Vierling P., Synthesis of AcridineNuclear Localization Signal (NLS) Conjugates and Evaluation of Their Impact on

297

Lipoplex and Polyplex-Based Transfection, Eur J Med Chem., Dec; 40 (12), 1295-306, (2005). RUTHVEN, N. A., Lewis, H. and McElhaney, R. N., The Structure and Organization of Phospholipid Bilayers as Revealed by Infrared Spectroscopy, Chem. Phys. Lipids, 96, 9–21, (1998).

SAENGER W., Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, MIR Publishers, Moscow, (1987). SAFINYA C. R., Structures of Lipid-DNA Complexes: Supramolecular Assembly and Gene Delivery, Curr. Opin. Struct. Biol., Aug. 11 (4), 440-8, (2001). SALVATI A., Ciani L., Ristori S., Martini G., Masi A., Arcangeli A., Physico-Chemical Characterization and Transfection Efficacy of Cationic Liposomes Containing the pEGFP Plasmid, Biophys Chem., Apr 20; 121 (1), 21-9, (2006). SANTEL A., Aleku M., Keil O., Endruschat J., Esche V., Durieux B., Loffler K., Fechtner M., Rohl T., Fisch G., Dames S., Arnold W., Giese K., Klippel A., Kaufmann J., RNA Interference in the Mouse Vascular Endothelium by Systemic Administration of siRNA-Lipoplexes for Cancer Therapy, Gene Ther., Apr 20, (2006). SARAF A., Mikos A. G., Gene Delivery Strategies for Cartilage Tissue Engineering, Adv Drug Deliv Rev., Jun 9, (2006). SATO Y., Nomura S.-I., Yoshikawa K., Enhanced Uptake of Giant DNA in Cell-Sized Liposomes, Chem, Phys. Lett., 380, 279-285, (2003). SAVVA M., Chen P., Aljaberi A., Selvi B., Spelios M., In Vitro Lipofection with Novel Asymmetric Series of 1,2-dialkoylamidopropane-Based Cytofectins Containing Single Symmetric Bis-(2-dimethylaminoethane) Polar Headgroups, Bioconjug Chem., NovDec;16 (6), 1411-22, (2005).

298

SELLE, C. and Pohle, W., Fourier Transform Infrared Spectroscopy as a Probe for the Study of the Hydration of Lipid Self-assemblies. II. Water Binding Versus Phase Transitions, Biospectroscopy, 4, 281-294, (1998). SELLE, C., Pohle, W. and Fritzsche, H., FTIR Spectroscopic Features of Lyotropically Induced Phase Transitions in Phospholipid Model Membranes, J. Mol. Structure, 480-481, 401-405, (1999). SHEK P. N., Barber R. F., Jurimaromet, M., Topical Applications of Liposomes, In: Liposomes as a topical drug delivery system, Polym. Mater. Sci. Eng., 63, 59-63, (1990). SILMAN N. J., Fooks A. R., Biophysical Targeting of Adenovirus Vectors for Gene Therapy, Curr Opin Mol Ther., Oct;2(5), 524-31, (2000). SILVESTRO, L. and Axelsen, P. H., Infrared Spectroscopy of Supported Lipid Monolayer, Bilayer, and Multibilayer Membranes, Chem. Phys. Lipids, 96, 69-80, (1998). SIMOES S., Filipe A., Faneca H., Mano M., Penacho N., Duzgunes N., de Lima M. P., Cationic Liposomes for Gene Delivery, Expert Opin Drug Deliv., Mar;2 (2), 237-54, (2005). SINGH M., Ariatti M., A Cationic Cytofectin with Long Spacer Mediates Favourable Transfection in Transformed Human Epithelial Cells, Int J Pharm., Feb 17; 309 (1-2), 189-98, (2006). SORGI, F., and Huang, L., A Dry Powder Formulation for Gene Therapy, Pharm. Res., 12, S266, (1995). SMALL D., Handbook of Lipid Research Vol. 4, The Physical Chemistry of Lipids, Plenum Pres, (1986).

299

SMITH J. G., Walzem R. L., German G. B., Liposomes as Agents of DNA Transfer, Biochim. Biophys. Acta, 1154, 327-340, (1993). SOROKIN V. A., Valeyev V. A., Gladchenko G. O., Blagoi Yu. P., Features of the Interaction of Bivalent Metal Ions with Homopolynucleotides in the Multichain Conformation, Biophysics, 1994; 39,5, 821-832, (1996). STEBELSKA K., Dubielecka P. M., Sikorski A. F., The Effect of PS Content on the Ability of Natural Membranes to Fuse with Positively Charged Liposomes and Lipoplexes, J. Membr Biol., Aug; 206(3), 203-14, (2005). STONE D., David A., Bolognani F., Lowenstein P. R., Castro M. G., Viral Vectors for Gene Delivery and Gene Therapy Within the Endocrine System, J. Endocrinol., Feb;164(2), 103-18, (2000). STRAYER D. S., Viral Gene Delivery, Expert Opin Investig Drugs., Dec;8(12), 21592172, (1999). SÜLEYMANOĞLU E., Turbidimetric Study of Interaction Between Polyribonucleotides, Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO-Advanced Study Institute Proceedings: Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular Sorting to Membrane Fusion, June 19-30, (1994), Espinho, Portugal. SÜLEYMANOĞLU E., M. Sc. Thesis, Middle East Technical University, Ankara, Turkey, (1995). SÜLEYMANOĞLU E., Preparation and Phase Behaviour of Surface-Active Pharmaceuticals: Self-Assembly of DNA and Surfactants with Membranes. Differential Adiabatic Scanning Microcalorimetric Study, Farmaco, 60, (8), 701-10, (2005). SÜLEYMANOĞLU E., Fluorescence Microscopy of Condensed DNA Conformations of Bacterial Cells, J. Microbiol., 40, (4), 319-326, (2002).

300

SÜLEYMANOĞLU, E., A Nanoscale Polynucleotide-Neutral Liposome SelfAssemblies Formulated for Therapeutic Gene Delivery, Electron. J. Biomed., 2, 13-35, (2004). SZOKA, Jr. F. & Papahadjopoulos, D. Comparative Properties and Methods of Prepartaion of Lipid Vesicles (Liposomes), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467-508, (1980). TAILLANDIER, I.E. and J. Liquier. (2002), in: J.M. Chalmers and Griffith (eds.), Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, Chichester, Vol. 5, Chapter 2, Pp. 3465-3480. TAKAHASHI T., Harada A., Emi N., Kono K., Preparation of Efficient Gene Carriers Using a Polyamidoamine Dendron-Bearing Lipid: Improvement of Serum Resistance, Bioconjug Chem., Sep-Oct; 16 (5), 1160-5, (2005). TALSMA, H & Crommelin, D. J. A., Liposomes as Drug Delivery Systems, Part III: Stabilization, Pharmaceutical Technology, Volume 17, (1992), Pp: 48-59. TALSMA, H. & Cormmelin, D. J. A., Liposomes as Drug Delivery Systems, Part II: Characterization, Pharmaceutical Technology, Volume 16, (1992), Pp: 52-58. TALSMA, H. & Crommelin, D. J. A., Drug Delivery Overview: Liposomes: Synthetic lipid microspheres serve as multipurpose vehicles for the delivery of drugs, genetic material and cosmetics, American Scientist, 80, 20-31, (1992). TARAHOVSKY Y. S., Khusainova R. S., Gorelov A. V., Nikolaeva T. I., Deev A. A., Dawson A. K., Ivanitsky G. R., DNA Initiates Polymorphic Structural Transitions in Lecithin, FEBS Lett., 390, 133-136, (1996). TATULIAN S. A., Gordeliy V. I., Sokolova A. E., Syrykh A.G., A Neutron Diffraction Study of the Ions on Phospholipid Membrane Interactions, Biochim. Biophys. Acta, 1070, 143-151, (1991).

301

TEMPLETON N S., Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategies, 2nd Ed., Marcel Dekker, (2003). TEMPLETON N. S., Developments in Liposomal Gene Delivery Systems, Expert Opin. Biol. Ther., 1, 1-4, (2001). TEMPLETON N. S., Liposomal Delivery of Nucleic Acids In Vivo. DNA Cell Biol., 12, 857-867, (2002). THIERRY A. R., Abes S., Resina S., Travo A., Richard J. P., Prevot P., Lebleu B., Comparison of Basic Peptides- and Lipid-Based Strategies for the Delivery of Splice Correcting Oligonucleotides, Biochim Biophys Acta, Mar; 1758 (3), 364-74., (2006). THORNTON K., Gorenstein D.G., Conformational changes in phospholipase A2 upon binding to micellar interfaces in the absence and presence of competitive inhibitors. A 1H and 15N NMR study, Biochemistry, 31, 10021-10030, (1992). UHRIKOVA D., Rapp G., Kunst B. H., Balgavy P., Interaction of DNA with DPPC Bilayers in the Presence of Mg (II) Ions, 1998; EMBL DESY Outstation – Hamburg; Project No: ML-98-6. ULRICH A. S., Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles, Bioscience Rep., 22, 2, 129-149, (2002). van der WEERT, M., Haris, P.I., Hennink, W.E., and Crommelin, D.J.A., Fourier Transform Infrared Spectrometric Analysis of Protein Conformation: Effect of Sampling Method and Stress Factors, Anal. Biochemistry, 297, 160-169, (2001). VARGA C. M, Wickham T. J., Lauffenburger D. A., Receptor-Mediated Targeting of Gene Delivery Vectors: Insights from Molecular Mechanisms for Improved Vehicle Design, Biotechnol Bioeng., Dec 20; 70(6), 593-605, (2000). VLASSOV V. V., Balakireva L. A., Yakubov L. A., Transport of Oligonucleotides Across Natural and Model Membranes, Biochim Biophys Acta, 1197, 95-108, (1994).

302

WALTHER W., Stein U., Viral Vectors for Gene Transfer: A Review of Their Use in the Treatment of Human Diseases, Drugs, Aug;60(2), 249-71, (2000). WANG X. T., Liu P. Y., Xin K. Q., Tang J. B., Tendon Healing In Vitro: bFGF Gene Transfer to Tenocytes by Adeno-Associated Viral Vectors Promotes Expression of Collagen Genes, J. Hand Surg [Am]. Nov;30(6), 1255-61, (2005). WANG, Binghe, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug Delivery: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005). WANG, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 411-434. WASUNGU L., Scarzello M., van Dam G., Molema G., Wagenaar A., Engberts J. B., Hoekstra D., Transfection Mediated by pH-Sensitive Sugar-Based Gemini Surfactants; Potential for In Vivo Gene Therapy Applications, J. Mol Med., Jun 8, (2006). WHITTLESEY K. J., Shea L. D., Nerve Growth Factor Expression by PLG-Mediated Lipofection, Biomaterials, Apr; 27 (11), 2477-86, (2006). WILSON D. R., Viral-Mediated Gene Transfer for Cancer Treatment, Curr Pharm Biotechnol., Jun;3(2), 151-64, (2002). YOUNG L. S., Searle P. F., Onion D., Mautner V., Viral Gene Therapy Strategies: From Basic Science to Clinical Application, J. Pathol., Jan;208(2), 299-318, (2006). ZHANG X., Godbey W.T., Viral Vectors for Gene Delivery in Tissue Engineering, Adv Drug Deliv Rev., Jun 6, (2006). ZHOU X, Huang L., Improved encapsulation of DNA in pH sensitive liposomes for transfection, Liposome Research, 2, 125-139, (1992).

303

ZHOU X. H., Po, A. L. W. Pulmonary Delivery of Drugs Organ-selective action of an antitumor drug: pharmacologic studies of liposome-encapsulated beta-cytosine arabinoside administered via the respiratory system of the rat, J. Natl. Cancer Inst., 63, 727-731, (1979). ZHOU X., Klibanov A. L., Huang L., Encapsulation/Delivery of Proteins Interactions of proteins and drugs with liposomes, In: Liposomes, Ostro M., (Ed.), Marcel Dekker, New York, (1983) Pp: 53-86. ZHU N., Liggitt D., Phillip M., Dazin P., Debs R., In Vivo Gene Delivery. Efficient Transfection of T lymphocytes in Adult Mice, J. Biol. Chem., 268, 16087-16090, (1993). ZUNDEL, G. Polar Interactions, Hydration, Proton Conduction and Conformation of Biological Systems – Infrared Results, , in: W. Hoppe, W. Lohmann, H. Markl, H. Ziegler (Eds.), Biophysics, Springer-Verlag, Berlin, Hedelberg, New York, Tokyo, (1983). Pp: 243-254.

304

Gen Taşıyıcı Tasarımlarında Kullanılan Çeşitli DNA Kompaktizasyon Molekülleri

Tablo yapımında kullanılan kaynaklar62: [1] http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/index.html.; [2] ZIAUDDIN J., Sabatini D. M., Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature,411 (6833), 107–10, (2001). [3] MARTIN-HERRANZ A., Ahmad A., Evans H. M., Ewert K., Schulze U., Safinya C. R., Surface functionalized cationic lipid-DNA complexes for gene delivery: PEGylated lamellar complexes exhibit distinct DNA-DNA interaction regimes. Biophys J 86(2), 1160–8, (2004). [4] BOULANGER C., Di Giorgio C., Gaucheron J., Vierling P., Transfection with fluorinated lipoplexes based on new fluorinated cationic lipids and in the presence of a bile salt surfactant. Bioconjug Chem 15(4), 901–8, (2004). [5] SEGURA T., Shea L. D., Materials for non-viral gene delivery, Annu Rev Mater Res, 31, 25–46, (2001). [6] Anderson D. G., Lynn D. M.,

62

Tablo takibi daha kolay olması açısından burada yer alan kaynaklar Yararlanılan Kaynak Listesine dahil edilmemiştir.

305

Langer R., Semi-automated synthesis and screening of a large library of degradable cationic polymers for gene delivery, Angew Chem Int Ed Engl, 42(27), 3153–8, (2003). [7] EWERT K., Ahmad A., Evans H. M., Safinya C. R., Cationic lipid–DNA complexes for non-viral gene therapy: relating supramolecular structures to cellular pathways. Expert Opin Biol Ther, 5(1), 33–53, (2005). [8] TRANCHANT I., Thompson B., Nicolazzi C., Mignet N., Scherman D., Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids. J Gene Med, 6 (Suppl 1), S24–35, (2004). [9] BOUSSIF O., Lezoualc’h F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad Sci USA, 92(16), 7297–301, (1995). [10] BRAUN C. S., Vetro J. A., Tomalia D. A., Koe G. S., Koe J. G., Russell Middaugh C., Structure/function relationships of polyamidoamine/DNA dendrimers. as gene delivery vehicles. J Pharm Sci , 94 (2), 423–36, (2005). [11] WANG J., Zhang P. C., Mao H. Q., Leong K. W., Enhanced gene expression in mouse muscle by sustained release of plasmid DNA using PPE-EA as a carrier, Gene Ther,9 (18), 1254–61, (2002). [12] AKINC A., Lynn D. M., Anderson D. G., Langer R., Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library for gene delivery, J Am Chem Soc, 125 (18), 5316–23, (2003). [13] NEU M., Fischer D., Kissel T., Recent advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and its derivatives, J Gene Med, 7 (8), 992–1009, (2005). [14] SCHAFFER D. V., Fidelman N. A., Dan N., Lauffenburger D. A.. Vector unpacking as a potential barrier for receptor-mediated polyplex gene delivery, Biotechnol Bioeng., 67(5), 598–606, (2000). [15] AGARWAL A., Unfer R., Mallapragada S. K., Novel cationic pentablock copolymers as non-viral vectors for gene therapy. J Control Release,;103 (1), 245–58, (2005). [16] REINEKE T. M., Davis M. E., Structural effects of carbohydratecontaining polycations on gene delivery. 1. Carbohydrate size and its distance from charge centers, Bioconjug Chem, 14 (1), 247–54, (2003). [17] POPIELARSKI S. R., Mishra S., Davis M. E.. Structural effects of carbohydrate-containing polycations on gene delivery. 3. Cyclodextrin type and functionalization, Bioconjug Chem,14 (3), 672–8, (2003). Ek-9 LİPOZOM HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ63,64

63

Bu bölümde lipozomlarla ilgili sadece genel bilgiler yer almaktadır. Modern farmasötik biliminde çok sayıda kullanım alanlarıyla ilgili güncel makalelerin ve derlemelerin de bulunduğu Referanslar listesine başvurulmalıdır.

306

Lipid Vezikülleri (Lipozom) Hazırlama Yöntemleri

Lipozomlar veya veziküller üç boyutlu olmaları itibariyle doğal hücrelere benzeyen fosfolipidler gibi amfifilik (Şekil E5.1) moleküllerin kendi kendine oluşturdukları (self-assembling) yapılara sahip yuvarlak agregatlardır. Lipozomlar ilk olarak A. D. Bangham65,66 1960lı yıllarda keşfedildiler. Yüksek biyoyararlılıkları ve çeşitli molekül ve maddelerin vezikül hacmi içinde yüksek miktarda enkapsüle

64

Bu bölümün hazırlanmasında: Wang, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery:

Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 411-434; Kobayashi, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery, In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318; Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug Delivery: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005)’dan yararlanılmıştır. 65 66

Bangham, A. D., Horne, R. W., Nature, 196, (1962), 952-953. Bangham, A. D., Horne, R. W., J. Mol. Biol., 8, (1964), 660-668.

307

edilebilmeleri bakımından, lipid vezikülleri o yıllarda mükemmel bir ilâç taşıma aracı olarak değerlendirilmişlerdir. Lipozomların çeşitli türleri (MLV, SUV, LUV, FRV) uygulanmakta olan birçok yöntemi kullanarak hazırlamak mümkündür (Şekil E5.2 ve E5.6). Projemizde çok popüler bir yöntem olan “hand-shaken vesicles preparation” yöntemi uygulanmıştır. Lipozomların herhangi bir formülasyonunu hazırlamak için lipid moleküllerini önce sıvı ortamına aktarmak gerekmektedir. Orijinal prosedüre uygun olarak, ince tabaka lipid filmi yuvarlak balon jojeye konulmak suretiyle bunların daha sonra sıvı ortamında çalkalanması ve çözülmesi sağlanmaktadır (Şekil E5.3 ve E5.4). İlâç formülasyonları, gen taşıyıcıları ve kanser tedavilerinde kullanılan çeşitli farmasötik bileşenlerinin enkapsülasyonu gibi alanlardaki uygulanmaları dışında, lamelar veziküller biyomembran modelleri olarak da çok önem kazanmışlardır (WANG, et. al., 2005; KOBAYASHI, et. al, 2005 WANG, et. al., 2005). Lipozomlar özellikle bağışıklık sisteminin fagositlerine yönelik ilâç hedeflendirilmesinde etkilidir. Lipozomlara dayalı ilâç taşıyıcısistemleri terapötik endeksi ve biyoyararlılığı iyileştirebildikleri gibi, kontrollü salınım sistemlerinin etkinliğini artırırlar ve toksisiteyi düşürürler. Bu bileşenler, antikanser, DNA ve proteinlerin, diabet ve kardiyovasküler hastalıklara karşı ilâçların taşıyıcıları olarak kullanılmışlardır. Keşfedildiklerinden itibaren, birçok lipozomal formülasyon klinik araştırmalarda uygulanmıştır ve birkaç başarılı lipozom’a dayalı ilâç formülasyonu patent olarak Food

and

Drug

Administration

(FDA)

tarafından

kabul

edilmiş

ve

ruhsatlandırılmıştır. Bunlar arasında doxorubicin (Doxil ve Myocet), daunorubicin (DaunoXome) gibi antikanser ilâçları ve mantarlara karşı kullanılan amphotericin B (AmBisome, Amphotect, ABELCET) formülasyonları örnek olarak verilebilir. Bu ilâçların lipozomal formülasyonları önemli ölçüde toksisiteyi düşürmüşlerdir ve etken maddelerin etkinliğini korumuş veya yükseltmişlerdir. Son yıllarda lipozomlar viral olmayan gen taşıyıcı tasarımlarında da yoğun olarak yer almakta ve uygulanmaktadır67.

67

Bkz: Referanslar listesini.

308

Ancak, lipozomal ilâç ve gen taşıyıcı sistemlerinin terapötik potansiyellerine tam olarak henüz daha ulaşılamamıştır. Bunun nedenlerinden biri, bu taşıyıcı sistemlerle karşılaşılan birçok tasarım ve uygulama sorunlarının olmasıdır. Bu sorunlar arasında sabitlilik, salınım zamanı ve hızı, formülasyon maaliyeti, kısa süren biyoyararlılık ve birçok ilâçla etkisiz etkileşmelerin olduğu durumlar sayılabilir. Ayrıca, sirkülasyonda sabitliliğini destekleyerek aynı zamanda söz konusu ilâçın hedef dokudaki biyoyararlılığını seçici olarak artırmak çok güçtür (WANG, 2005). 1. Vezikül Oluşumunun Mekanizması. Lipozomlar (lipid vezikülleri) ince tabaka lipid filmlerinin veya diğer lipid yüzeylerinin hidrasyonu sonucu oluşurlar (Şekil E5.1). Bu yapılarda sıvı kristal şeklinde bulunan lipid katmanları akışkan hale gelir. Hidrasyonu meydana gelmiş lipid katmanların agitasyon ve çalkalama esnasında bulundukları balon jojenin veya kabbın iç yüzeyinden ayrılırlar ve daha büyük yuvarlak çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur. Kenarlarda katmanın hidrokarbon kısmının su ile etkileşmeleri engellendiğinden, bu yapı termodinamik açıdan da bakılacak olursa çok

sağlam

ve

sabittir.

Parçacıkların

oluşumundan

sonra

boyutlarının

düşürülmesisonik enerjinin (sonication) veya mekanik enerjinin (extrusion) harcanmasını gerektirmektedir. 2. Lipozom Hazırlama Yöntemleri. Lipid formülasyonların özellikleri lipid içeriğine (katyonik, anyonik veya nötr lipidler) bağlıdır, ancak, aynı hazırlama prosedürü tüm lipid veziküllerin hazırlanmasında lipid türü önem taşımaksızın uygulanabilmektedir (Şekil E5.2). Genel

olarak,

prosedür

hidrasyon

için

lipidin

hazırlanması,

eşzamanlı

gerçekleştirilen hidrasyon, agitasyon ve çalkalama ve veziküllerin homojen dağlımının sağlanması için yapılan boyutlandırma aşamalarından ibarettir.

309

Şekil E5.1: Lipozomların genel yapısı. Kaynak: www.cem.msu.edu/~reusch/ VirtualText/lipids.htm

Şekil E5.2: Çeşitli lipozom formülasyonlarının hazırlama yöntemlerini özetleyen genel klasifikasyon. SUV, small unilamellar vesicles; MLV, multilamellar vesicles; LUV, large unilamellar vesicles; FRV, freeze-drying rehydration vesicles. Kaynak: LASCH, J. Weissig, V. and Brandl, M. Preparation of liposomes, In: Liposomes. A

310

Practical Approach, 2nd Ed. (Torchilin Vl. P. And Weissig, V., Eds.), Oxford University Press, (2003), Pp: 3-29. a. Hidrasyon İşlemi. Lipid karışımlarından oluşan lipozomları hazırlarken, lipidler ilk önce organik çözgende çözülmeli ve homojen lipid karışımının elde edilmesi için iyice karıştırılmalıdır. Genelde, bu işlem kloroform veya kloroform:metanol karışımı kullanılarak gerçekleştirilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Burada amaç, lipidlerin tam olarak karışımını sağlamak için temiz lipid çözeltinin elde edilmesidir. Genel olarak, lipid çözeltileri 10-20 mg lipid/ml organik çözgen konsantrasyonunda hazırlanır. Ancak, lipid çözünürlülüğü veya lipidlerin tam olarak karışımı isteniliyorsa, daha yüksek konsantrasyonlarla çalışmak avantajlıdır (TORCHILIN, et. al., 2003). Organik çözgende lipidlerin çözülmesinden sonra, bu çözücüyü azot veya argon gazı ile uzaklaştırarak ince lipid filmi elde edilir. Daha küçük organik çözgen hacimleri ile çalışılıyorsa (<1 ml), bu işlem iyi neticeler verir (TORCHILIN, et. al., 2003). Daha büyük organik çözgen hacimlerinin söz konusu olduğunda ise uzaklaştırma işlemi rotary evaporator ile gerçekleştirilir. Her iki işlem sonucunda da balon jojenin dibinde ince lipid filmi veya tabakası oluşmaktadır. Muhtemelen bu ortamda kalan organik çözgeni uzaklaştırmak amacıyla, bu film daha sonra bir gece boyunca vaküm pompa ile kurutulur. Kloroform kullanımı tercih edilmiyorsa, onun yerine lipidleri tersiyer butanol veyasikloheksanda çözmek de mümkündür. Lipid çözeltisi kaplara aktarılır ve kuru buz veya kuru buz-aseton karışımıyla veya alkol (etanol veya metanol) banyosuna konularak dondurulur. Banyoda konulduğu takdirde, ani ısı değişiklerinden kaynaklanabilecek olan muhtemel kap çatlamasını engellemek için dikkat edilmeli. Tam olarak dondurulduktan sonra, lipidin içinde bulunduğu kap vaküm pompaya bağlanır ve lipid filminin kuruyuncaya kadar liyofilize edilir. Bu işlem elde edilmesi istenilen lipid hacmine göre değişir ve genelde 1 ile 3 gün arasında sürer. Bunun ardından, kurutulmuş lipid filmi bulunduran balon joje vaküm pompadan çıkarılır ve tekrar bir sonraki hidrasyon için dondurulmuş vaziyette muhafaza edilir. b. Lipid Filminin Hidrasyonu. Kuru lipid filminin hidrasyonu basitçe sıvı ortamın veya tampon çözeltisinin lipidin bulunduğu balon jojeye katarak ve çalkalayarak gerçekleştirilir. Hidrasyon

311

ortamının ısısı kullanılan lipidin genel jel-sıvı kristal faz geçiş ısısından (Tc veya Tm) daha yüksek olmalı. Bu işlemden sonra lipid süspansiyonu, bulunduğu kendi ortam ısısının söz konusu Tm ‘in üzerinde olacak şekilde muhafaza edilmelidir. Yüksek faz geçişine sahip lipidler için bu işlemi balon joje içinde bulunan lipidleri rotary evaporator

sistemine

bağlayarak

vaküm

kullanılmaksızın

gerçekleştirmek

mümkündür. Daha sonra, bu balon jojeyi yine önceden lipid süspansyon ısısısnın üzerinde bulunan bir ısı ortamında ısıtılmış su banyosuna aktarılarak ve çalkalayarak lipidin hidrasyonunu gerçekleştirerek lipidlerin akışkan fazı elde edilmiş olur. Lipid türüne bağlı olarak hidrasyon için gereken zaman değişmekte, ancak bu işlemin çalkalama ve vorteksleme zamanları ile birlikte, genelde bir saati aşmamasına özen gösterilir.

Bazı

durumlarda,

veziküllerin

boyut

dağılımı

ve

homojeniteleri

iyileştirildiğinden, bundan sonraki aşama olan vezikül boyutlandırma işlemine geçmeden önce, lipid süspansyonu bu şekilde bir gece bekletilir68. Hidrasyon ortamını genelde lipid veziküllerin uygulama amacı tayin eder. Uygun hidrasyon ortamı, distile su, tampon çözeltileri, tuzları, ve şeker çözeltileri gibi elektrolit olmayan bileşenleri içerir. In vivo uygulamalar için fizyolojik osmolalitede (290 mOsm/kg) çalışmak tavsiye edilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Bu gereksinimleri karşılayan genel olarak kullanılan bir çözelti: 0.9% tuz, 5% dekstroz ve 10% sukroz’u içerir. Hidrasyon esnasında, bazı lipidler yapılarına özgü kompleksler oluştururlar. Yüksek düzeyde yük taşıyan lipidlerin hidrasyonları esnasında ve düşük pI’e sahip çözeltilerde, vis köz jel oluşturdukları görülmüştür (TORCHILIN, et. al., 2003). Bu sorun, ortama tuzların katılması veya vezikül boyutlarının düşürülmesiyle giderilebilir. Fosfatidiletanolamin gibi hidrasyonu zor olan lipidler kendi kendine agregatlar oluştururlar. >60% fosfatidiletanolamin içeren veziküller vezikül etrafında oluşan düşük hidrasyon tabakasına sahiptir. Bu durumda bu fosfolipidten oluşan veziküller arasında uzaklaştırıcı kuvvetlerin zayıflaması sonucu birbirine çok yaklaşıp birbirleri bağlanarak daha büyük agregatlar oluştururlar (). Bu parçacıklar çözeltide daha büyük dispers flokülasyonlar olarak meydana gelir. Hidrasyonun sonucunda, büyük çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur. Katmanlar arasında bulunan lipid yüzeyleri su katmanı ile çevrilidir. Aralarında oluşan mesafe lipid katmanlarındaki lipid içeriğine bağlıdır. Örneğin, polihidre 68

Bu olay “aging” olarak da adlandırılmaktadır. Ancak, lipid hidrolizinin meydana gelme olasılığının yüksek derecelerde artığından, bu işlem yüksek faz geçişine sahip lipidlere uygulanması tercih edilmez (TORCHILIN, et. al., 2003).

312

katmanlar, elektrostatik uzaklaştırma neticesinde oluşan yüklü lipid katmanlarına göre birbirine daha yakın bir mesafede oluşurlar. Sabit, hidrasyonu gerçekleştirilmiş çok katmanlı veziküllerin (Large Multilamellar Vesicles, LMV) elde edilmesinden sonra, bu parçacıkların boyutları sonication ve extrusion gibi birçok yöntem kullanılarak düşürülür (TORCHILIN, et. al., 2003).

c. Lipid Süspansyonlarının Boyutlandırılması Sonication LMV süspansyonlarının sonik enerji (sonication) kullanarak parçalanması tipik olarak çapları 15-50 nm arasında değişen küçük, tek katmanlı veziküllerin (SUV) oluşmuuna neden olur. Bunu gerçekleştirmek için kullanılan cihazlar “probe tip sonicators” olarak bilinmektedir. Ancak bu yöntem birçok tercih edilmeyen yan etkilere de sahiptir. Örneğin, bu yöntemi kullanarak elde edilen küçük tek katmanlı veziküller sabit değildir ve zamanla agregasyonlar neticesinde çapları daha büyük olan agregatlara dönüşürler. Sonuç olarak, elde edilen lipozom formülasyonları son derece heterojendir. Ayrıca, sonikasyon lipid peroksidasyonlara da neden olmuştur. Bu peroksidasyonları engellemek amacıyla araştırmacılar lipozom formülasyonlarına lipid koruyucu ve antioksidan etkilerine sahip α-tokoferol (Vitamin E) katmışlardır. Ancak bu vitaminin büyük hacmi lipozomların daha sonraki boyut incelemelerini ve spektroskopik araştırmalarını çok sayıda yan sinyal verdiklerinden olumsuz olarak etkilemştir. Bu yüzden günümüzde tek katmanlı lipid veziküllerinin elde edilmesinde kullanılan diğer bir yöntem olan extrusion yöntemi tercih edilmektedir. Extrusion Bu yöntemde lipid süspansyonu önceden bilinen ve tercih edilen por büyüklüğüne sahip 2 polikarbonat filtre üzerinden 10 defa geçirilerek bu por büyüklüğüne yakın boyuttaki tek katmanlı veziküller elde edilir.

Bu yöntem

sayesinde ortalama olarak söz konusu tek katmanlı veziküllerin boyut dağlımı son derece homojendir. Şimdiye kadar bahsedilen tüm diğer lipozom boyutunun düşürülmesinde kullanılan yöntemlerde olduğu gibi burada da bu işlem lipidin faz geçiş derecesinin üzerinde bir değerde çalışılması gerekmektedir. Aksi takdirde, bu derecenin altında lipidlerin rijid olduklarından ve bu yüzden de polikarbonat filtresindeki

porlara

yapışıp

tıkanmalarına

neden

olduklarından,

bu

işlem

313

başarısızlıkla

sonuçlanacaktır.

100

nm

por

büyüklüğüne

sahip

filtreden

geçirildiklerinde MLV genelde ortalama olarak çapları 120-140 nm arasında değişen büyük, tek katmanlı (large unilamellar vesicles (LUV))’i meydana getirir. Bu işlem sunucunda, elde edilen lipozomların boyutu particle sizer cihazıyla teyit edilir. Bu ortalama partikül boyutu ayrıca lipid içeriğine bağlıdır ancak son derece tekrarlanabilir bir prosedürdür.

Şekil E5.3 Çok katmanlı veziküllerin hazırlanması enasında oluşan fosfolipid yapıları. Kaynak: http://www.avantilipids.com

314

Şekil E5.4 MLV’lerin hazırlanmasındaki üç aşamanın şematik gösterimi. 1: Önceden oluşturulan kurutulmuş ince tabaka lipidlere sıvı fazın katılması; 2: Balon jojeyi çalkalama ve ısıtma neticesinde lipid filmin erimesi ve çözülmesi; 3: Ekvilibre edilmiş MLVlerin sütsü süspansyonu. Kaynak: http://www.avantilipids.com

315

Şekil.E5.5: Makromoleküler enkapsülasyon amaçlı tasarlanan çeşitli lipozomlar. Kaynak: www.unizh.ch/ onkwww/lipos.htm

316

Şekil E5.6: Çeşitli Lipozom boyutları. Kaynak: www.azonano.com/details. asp?ArticleID=1243

EK-10 TEK KATMANLI LİPOZOMLARIN HACMİ, ÇAPI, SAYILARI, ALANLARI VE LİPİD AĞIRLIĞI ARASINDAKI İLİŞKİYİ GÖSTEREN BİR NOMOGRAM69

69

Johnes, G. R. and Cossins, A. R., Lposomes-A Practical Approach, IRL Pres, (1990)’tan alınmıştır.

317

318

Ek-18 ÖZGEÇMİŞ

319

CURRICULUM VITAE

Name and Surname: Erhan Süleymanoğlu Date of Birth: 22.03.1967 in Sofia, Bulgaria. Citizenship: The Netherlands, Bulgaria and Turkey (Trial Citizenship) Home Address: Gazi Mahallesi, Polatlı Caddesi, No:115/5, Yenimahalle, 06560-Ankara, Turkey Tel.: (00-90)-5423527265 Home tel.: (00-90-312)-211-19-47 E-mail: [email protected], [email protected] and [email protected] http://erhan.boom.ru Non-academic Affiliations: November 1992-January 1993: Official translator and consultant on Russian Federation of Sutek Trade and Construction Co. Ltd.- Ankara, Turkey. 1993-present: Authorized translator of 9th Notarial Service - Ankara, Turkey. 2001-2002: Foreign Affairs Officer of DEM İLÂÇ PHARMACEUTICALS Co. Ltd. official distributor of Instituto Grifols, S.A. (Barcelona, Spain) in Turkey and advisor on authorization of medicinal products to be submitted to The Turkish Ministry of Health for further approval. 2004-present: Member of The Editorial Board of Electronic Journal of Biomedicine (University Hospital Yägue-Burgos, Spain): http://biomed.uninet.edu

320

2006-present: Member of The Editorial Board of International Journal of Biomedical Sciences (www.ijbs.org).

Primary Education: 1974-1985: Russian Language High School - Sofia and in parallel UNESCO English Language School - Sofia, Bulgaria.

Academic Achievements and Research Experience: 1989: B.Sc. Programme in Biotechnology - The Biotechnology Centre of The Sofia University - Sofia, Bulgaria. 1992: B.Sc. in Biology - Middle East Technical University, Department of Biology Ankara, Turkey. 1995: M.Sc. in Biochemistry, Institute of Natural and Applied Sciences, Department of Biochemistry - Middle East Technical University - Ankara, Turkey (M.Sc. Thesis Topic: "Effect of Metal Ions on Interaction Between Nucleic Acid, Protein (Melittin) and Drug (Tamoxifen) with Model Membranes").

Predoctoral Training: October 1996-March 1997: University of Vienna, Medical Faculty, VIENNA BIOCENTER, Molecular Virology Group - Vienna, Austria (Research Topic: "Study of the Interaction Between Neutralizing Antibodies with Human Rhinoviruses from the Minor Receptor Group").

2001: Ph.D. in Biochemsitry, Institute of Biochemistry, University of Vienna, Medical Faculty, VIENNA BIOCENTER (Ph.D. Thesis Topic: "Cloning and Characterization of Human Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein (hnRNP) A3 - a Novel Member of the hnRNP A/B Family"; Abstract available at: www.arcs.ac.at/dissdb/rn036425).

321

Post-doctoral Research: January 2000-September 2001: Swammerdam Institute for Life Sciences, Section of Molecular Cytology, University of Amsterdam, BioCentrum Amsterdam Amsterdam, The Netherlands (Research Topic: "Prokaryotic DNA Organization: Balancing Physical and Physiological Forces").

Assistantships and Other Research Appointments: 1. September 1994-April 1996: Research assistantship at Gazi University, Medical Faculty, Department of Biophysics - Ankara, Turkey (Duties included teaching general physics with laboratory section to medical students and performing research on effects of electromagnetic fields on living cells and tissues). 2. January-February 1997: Guest scientist at University of Bergen, Faculty of Medicine, Pre-clinical Institutes, Institute of Biochemistry and Molecular Biology Bergen, Norway (Research Topic: "Acyl Chain Specificity in Phospholipid Metabolism and Signal Transduction in Brain" - The European Union supported project). 3. June 1997: Guest scientist at J.A. Comenius University, Faculty of Pharmacy, Department of Physical Chemistry, Biophysics Section - Bratislava, Slovakia, and at The Slovak Academy of Sciences, Institute of Experimental Physics, Department of Biophysics - Kosice, Slovakia (Research Topic: "Differential Scanning Calorimetric Studies on the Effect of Metal Ions on Interaction Between Phospholipid Membranes with Nucleic Acids, Immunomodulators and Surfactants"). 4. April-May 1999: Guest researcher at Institut Curie, UMR-216 du CNRS - Genetique et Chemie des Genomes Eucaryotes; bat. 110, Centre Universitair Paris - Sud, Orsay Cedex - France (Research Topic: "Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy of RNA-Protein Folding Patterns in Ribonucleoprotein Particles and Their Role in Autoimmune Diseases"). 5. March 1999: Guest researcher at Institute of Chemical Technology, NMR Laboratory - Prague, Czech Republic (Research Topic: "NMR Spectroscopy of RNAProtein Recognition in hnRNP particles - Implications for Disease Specific Epitope Formation").

322

6. October 2000 - February 2001: Guest researcher at Department of Molecular Cell Physiology and Mathematical Biochemistry, BioCentrum Amsterdam, Free University of Amsterdam - Amsterdam, The Netherlands (Research Topic: "Physics and Molecular Physiology of DNA Supercoiling").

Scholarships Awarded: 1. 1985-1989: Scholarship of The Chemicopharmaceutical Research Institute (НИХФИ-СОФИЯ) - Sofia, Bulgaria. 2. 1993-1995: Scholarship of The Technical and Research Council of Turkey (TÜBİTAK) for research on protein folding and denaturation mechanisms of citrate synthase - in collaboration with University of Bath - United Kingdom. 3. 1996-1999: Ph. D. Scholarship of The Austrian Government.

Publications: 1. Severcan, F., Süleymanoğlu, E., Boyar, H. Turbidity studies of the effect of divalent cations on Tamoxifen - model membrane interactions. Biochem. Soc. Trans., 25 (3): 493S, (1997). 2. Huber, W., Süleymanoğlu, E., et. al. The hnRNP-D/AUF proteins - a novel group of autoantigens in rheumatology - In: Pathogenesis and Diagnostic Relevance of Autoantibodies; Report on the 4th Dresden Symposium on Autoantibodies, hold in Dresden - Germany on Octomber 21-24, (1998); Conrad, K., Humbel, R-L., Muerer, M., Shoenfeld, Y., E.M.T., (Eds.) PABST Publishers. 3. Skriner, K., Huber, W., Süleymanoğlu, E., Smolen, J., Steiner, G. Are mRNA decay complexes target structures in systemic autoimmune diseases? Arthritis and Rheumatism, 43 (9), Suppl. S, Sept. (2000). 4. Cunha, S., Odijk, T., Süleymanoğlu, E., Woldringh, C.L. Isolation of Escherichia coli nucleoid. Biochimie, Feb., 83 (2): 149-154, (2001).

323

5. Süleymanoğlu, E. Electrorelease of Escherichia coli nucleoids. Folia Microbiol. 47 (4): 365-370, (2002). 6. Süleymanoğlu, E. Fluorescence microscopy of condensed DNA conformations of bacterial cells. J. Microbiol. 40 (4): 319-326, (2002). 7. Steiner, G., Cervenak, Z., Skriner, K. and Süleymanoğlu, E. Molecular cloning, expression and immunochemical properties of new human hnRNP A/B type autoantigen, Biomedica, 19: 8-17, Jul.-Dec. (2003). 8. Süleymanoğlu, E. Molecular phylogenetics and functional evolution of major RNA recognition domains of recently cloned and characterized autoimmune RNA-binding particle, Geno., Prot. & Bioinfo. 1 (4): 310-320, (2003). 9. Süleymanoğlu, E. Circular dichroism and fluorescence spectroscopic study of RNAprotein folding patterns in human hnRNP A3 and their implications in human autoimmune diseases. Prog. Biochem. Biophys. 31 (3): 219-224, (2004). 10. Süleymanoğlu E. Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study. Il Farmaco, Aug; 60 (8): 701-710, (2005). 11. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNAMg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction as a Gene Delivery Formulation, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4): 218-231, (2006). 12. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an Immobilized Liposome Chromatography for DNA Separation and Analysis, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4): 232-239, (2006). 15. Manavbasi Y, Suleymanoglu E., Probing Taxol (TM) (Paclitaxel)-cell membrane interactions with Langmuir-Blodgett monolayer, Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry, FEBS JOURNAL 273: 354-354 Suppl. 1, JUN (2006).

324

16. Manavbaşı Y. and Süleymanoğlu E., Nucleic acid-phospholipid recognition: Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipidinorganic cation-DNA complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of nanometric liposome based gene delivery formulations. Arch Pharm Res., Aug; 30 (8): 1027-40, (2007). 17. Karl Skriner, Wolfgang Hueber, Erhan Süleymanoglu, Elisabeth Höfler, Veit Kren, Josef Smolen and Günter Steiner, The Regulator of TNFα mRNA Decay AU-rich Element Binding Factor 1 is Targeted by Autoantibodies of Patients with Systemic Rheumatic Diseases, (accepted for publication in Rheumatism and Arthritis-2007). Books: Hayriye S. Yenisoy, Nergiz Aksoy and Erhan Süleymanoglu, Contemprorary Bulgarian, published by Kurmay Yayınevi (www.kurmayyayinevi.com)-2007.

Conferences and Workshops Attended: 1. Intensive Course on Protein Structure, Function and Stability, April 18-22, 1994, Ankara - Turkey; Organized by Middle East Technical University - Ankara, Turkey and University of Bath - United Kingdom. 2. Turbidimetric Study of Interaction Between Polyribonucleotides, Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO Advanced Study Institute: Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular Sorting to Membrane Fusion, June 19-30, 1994, Espinho, Portugal. 3. Spectrophotometric Study of the Interaction Between Polyribonucleotides, Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, VIth National Biophysical Congress, September 28-30, 1994, Silivri - Istanbul, Turkey. 4. Calcium/Magnesium Specificity in Modulation of Phospholipid Phase Transition Induced by Tamoxifen, NATO Advanced Study Institute: Molecular Dynamics of Biomembranes, June 19 - July 1, 1995, Cargese, Corsica, France. 5. Self-Assembly of Lipid Vesicles and Polyribonucleotides - An Inorganic Perspectives for the Origin of Life, NATO Advanced Study Institute: Solvents and Self-Organization of Polymers, July 23, 1995, Belek, Antalya, Turkey.

325

6. Self-Assembly of Lipid Droplets and Polyribonucleotides or Primordial Soup Revisited, ISSOL'96: International Conference on The Origin of Life, July 7 - 12, 1996, Orleans, France. 7. Self-Association of Melittin with Model Membranes, Winter School of Biophysics: Biophysical Aspects of Protein Folding; Organized by Stockholm Graduate School in Biophysics, as a joint programme between The Karolinska Institute, The Royal Institute of Technology and Stockholm University, April 1 - 4, 1997. 8. International Workshop on Modern Spectroscopic Techniques in Biophysics, June 1 - 5, 1998, Neptun, Romania. 9. 1998 Joint Meeting and Symposium of Clinical Biochemistry: New Trends in Clinical Biochemistry of Transplantation, Artis Tower Hotel - Vienna, Austria; Organized by Austrian Society for Clinical Chemistry and Instituto di Semiotica Medica, Universita degli Studi Padova - Italia and Society Italiana Di Biochemica Clinica. 10. The hnRNP-D/AUF Proteins - A Novel Group of Autoantigens in Rheumatology, National Scientific Meeting, Arthritis and Rheumatism - Abstract Supplement, Vol. 41, No: 9, Sept. S349, November 8-12, 1998, San Diego, California, U.S.A. 11. The hnRNP-D/AUF Proteins - a Novel Group of Autoantigens in SLE, MCTD and RA, XVIII European Workshop for Rheumatology Research, March 12 - 15, 1998, Athens, Greece. 12. ISPPP98 - 18th International Symposium on the Separation and Analysis of Proteins, Peptides and Polynucleotides, November 1 - 4, 1998, Hilton Hotel - Vienna, Austria. 13. The hnRNP A/B type proteins - major molecular targets in rheumatic autoimmune disease, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June, 1999, University of Edinburgh, Scotland. 14. Cloning of a novel hnRNP A/B type protein highly homologous to hnRNP-A3 from X. laevis, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June, 1999, University of Edinburgh, Scotland.

326

15. Identification of a novel autoantigen highly related to hnRNP-A2/RA33, The 19th European Workshop for Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway. 16. Epitope Mapping of hnRNP-D/AUF-1 proteins, The 19th European Workshop for Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway. 17. The hnRNP-D/AUF-1 Proteins - Novel Autoantigens in Rheumatology, 4th European Conference on Systemic Lupus Erythematosus; Organized by Vienna Academy of Postgraduate Medical Education and Research, January 23 - 26, 1999, Vienna, Austria. 18. Thermodynamics of nucleic acid-membrane-self-assembly as a precellular precursors and the emerging role of Ca2+ and Mg2+ as condensing agents, 12th International Conference on the Origin of Life and 9th ISSOL Meeting, 11-16, 1999, San Diego, California, U.S.A.

19. Are mRNA stability complexes target structures in systemic autoimmunity?, 14th European Immunology Meeting, EFIS, Sept. 23-27, 2000, Poznań, Poland.

20. Confocal Light Microscopy: Fundamentals and Biological Applications; BioCentrum Course with practical training; University of Amsterdam, May 8-12, 2000, Amsterdam, The Netherlands. 21. Visualizing Cellular Processes, 8 June, 2000, Free University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. 22. Analysis of Compaction Forces and Supercoil Content of Isolated E. coli nucleoids, International Summer School on DNA and Chromosomes: Physical and Biological Approaches, July 31 - August 12, 2000, Cargese, Corsica, France. 23. Analysis of DNA Compaction within the Bacterial Cell, EMBO Workshop: The Cell Cycle and Nucleoid Organization in Bacteria; Netherlands Institute for Sea Research (NIOZ), September 2-6, 2000, Island of Texel, The Netherlands. 24. AiK (The Association for Physics Students) Symposium: Complex Systems, November 3, 2000, Free University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.

327

25. Fall Symposium of The Dutch Society for Biochemistry and Molecular Biology: Into the Living Cell and Beyond, November 7, 2000, BioCentrum Amsterdam - Free University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. 26. Autoantibodies to the mRNA destabilizing protein hnRNP-D/AUF1 in patients with systemic autoimmune diseases, 21st European Workshop for Rheumatology Research, Parkhotel Schönbrunn, Vienna, Austria. 1-4 March 2001, published in Arthritis Res. 2001, 3(Suppl A): P012. 26. Symposium on Live Cell Imaging; Organized by PerkinElmer Life Sciences and hold at Institute of Molecular Pathology, April 10, 2001, Vienna, Austria. 27. IMMPC - 1: First International Meeting on Medical and Pharmaceutical Chemistry, September 25-28, 2002, Hotel Ankara Dedeman - Ankara, Turkey. 28. Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy of RNA - Protein Folding Patterns and Their Role in Autoimmune Diseases, The Inaugural Austral - Asian Biospectroscopy Conference: Organized by Monash University - Australia and hold at the Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima (Korat) - Thailand, February 3-7, 2003. 29. Fluorescence Microscopy of Polymer - Induced Phase Separation and Divalent Cation - Dependent Compaction and Structural Integrity of Bacterial Chromosome, Bionanotechnology - EuroConference on Biomolecular Devices - Granada, Spain, 914 July, 2003. 30. Macromolecular Crowding and Bacterial DNA Cytoarchitecture - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.

31. Adiabatic Differential Scanning Microcalorimetric Study of Divalent Cation Induced Neutral Lipid - DNA Nanocondensate Formation Assambled for Gene Delivery - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30

328

anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.

32. Light Microscopy of Polyethylene Glycol-Induced Phase Separation and Divalent Cation-Dependent Compaction of Prokaryotic Nucleoids - ELSO-2003: European Life Scientist Organization - 2003, Dresden, Germany. 33. On-line Dissolution, Advanced Detection Methods and Authomated Method Development. Workshop organized by Waters Corporation (U.S.A.), Gazi University, Faculty of Pharmacy 11.03.2004, Ankara, Turkey. 34. Biophysical Aspects of RNA-protein Folding Features in A/B Type hnRNP Proteins and Their Implications in Human Systemic Autoimmune Pathology, 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference - The Protein World, 2 - 7 July, 2005, Budapest, Hungary. 35. Workshops of Middle East Technical University-Central Laboratory, 1. Rheological Characterization of Materials; 2. Particle Size Measurement Using Laser Diffraction Technique; 3. Particle Size Measurement Using Dynamic Light Scattering Techniques and Zeta Potential Measurement; 4. Thermal Analysis Techniques, 30.11.2005-21.12.2005, Ankara, Turkey. 36. Thermal Analysis and Rheological Applications in Polymer Field, Workshop organized by TA Instruments (UK), Gazi University, Faculty of Pharmacy, 21.12.2005, Ankara, Turkey. 37. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with Langmuir-Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry, 1st Multidisciplinary Cancer Research Symposium, Uludağ-Bursa, Turkey, 2006. 38. Preparation and Physicochemical Characterization of Biomolecular DNAZwitterionic Phospholipid Self-Assemblies and Their Implications in Chemicopharmaceutical Design of Liposome Based Gene Delivery Nanoformulation, NanoTR-II: NanoScience and NanoTechnology 2006, 3-5 May 2006, Middle East Technical University, Ankara, Turkey. 39. Assessment of Structures of Poly(ribo)nucleotide-Phospholipid Self-Assemblies and Their Implıcations in Gene Transfection and DNA Chromatography, 8th 329

International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), 13-16 June, 2006, Ankara, Turkey.

40. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with LangmuirBlodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry, FEBS-2006, Istanbul, Turkey. 41. METU-CENTER WORKSHOP on Modern Electron Paramagnetic Resonance (EPR) Spectroscopy, 6-9 November 2006, Middle East Technical University (METU) Central Laboratory. 42.

Fluorescence

Microscopy

and

Interfacial

Characterization

of

DNA

Condensation, Compaction and Release from Stable Virus-Resembling Phospholipid-Nucleic Acid Self-Assemblies and Their Implications as Non-Viral Gene Delivery Nanopharmaceuticals, NANO-TRIII 2007-Bilkent University, Ankara, Turkey. 43. An FTIR Spectrometric Study of the Physicochemical Characteristics of Nucleic Acid-Phospholipid Nanoformulations Designed for Gene Delivery at the Molecular Level, X. National Congress of Spectroscopy, 04-07 July 2007, Izmir Institute of Technology, Urla, Izmir.

44. Applying multilayer films and planar lipid bilayers (BLMs) for designing nucleic acid nanobiosensors: some examples of bioengineering at the molecular level, NANOMAT 2007, International Workshop on nanobiotechnology & Genome Technologies, October 31-November 03, 2007, Antalya, Turkey.

Memberships: Member of The New York Academy of Sciences, The Biophysical Society, The British Biophysical Society, The Society for Mathematical Biology, The European Society of Neurochemistry, The Austrian Society of Clinical Chemistry, The International Society for the Study of the Origin of Life, Metbio™.

330

Fluency in Foreign Languages: Excellent fluency in English, Russian, Bulgarian, Turkish and week knowledge of German.

331