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LORETO PEREZ ANA LAURA VELASCO DE MATA JOSE DARIO
ARGUELLA CANCHOLA MARIO ROJAS MORALES ALBERTO 1602
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Unidades formadoras de colonias (UFC): bacteria o agrupación de
bacterias viables que forman una colonia visible.
Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana,
proveniente de una sola célula. Cultivo
contaminado: cultivo bacteriano microorganismos extraños no deseados.
colonizado
por
Cultivo mixto: cultivo en laboratorio que contiene dos o más cepas
de organismos. 1602
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Aislamiento de microorganismos Separación de microorganismos presentes en una población
mixta puede lograrse de varias maneras: separando a los microorganismos -físicamente mediante diluciones o por agotamiento de un pequeño inoculo en un medio de cultivo sólido: utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir a los microorganismos no deseados y aprovechamiento de características
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CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS numerosos métodos que permiten establecer el
número de microorganismos en una muestra dada. Algunos métodos cuantifican el número de células, otros cuantifican la masa total de la población (la cual con frecuencia directamente proporcional al número de células).
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Clasificación de métodos para el conteo de microorganismos. Muestra
Concentración o dilución
Recuento total (viable y no viable) -métodos directos: a)cuenta al microscopio, b)contadores electrónicos. c)filtracion -métodos indirectos: turbidimetría
Recuento de viables (directos) -En placa (UFC)* -En tubo (NMP) **
*UFC= unidades formadoras de colonias
**NMP= número más probable
Curva patrón (absorbancia vs. células viables) Recuentos en placas Estandarización de McFarland Luz transmitida
Suspensiones coloidales Cantidad de luz
Turbidimetría y nefelometría
Nefelometría Mide la luz difractada Nefelómetro
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VENTAJAS
DESVENTAJAS
La turbidimetría puede
realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta. La fuente de radiación más frecuentemente usadas es la lámpara de wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación visible.
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Para densidades microbianas
bajas; de microorganismos unicelulares y tamaños de unos cuantos micrómetros Para microorganismos mas grandes y productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada
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•Método de Breed •Recuento en cámara de Petroff-Hauser •Contador de Coulter
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Método de Breed (1911) Un volumen conocido de muestra es extendido sobre
un cuadrado de 1 cm (1 a 4 cm) de lado de un portaobjeto. Posteriormente, la muestra es secada, fijada y teñida y se determina el número de microorganismos en varios campos del microscopio. Conociendo el área de los campos del microscopio es posible determinar el número total de microorganismos.
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1
2,3
4,5
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Determinar la superficie del campo microscópico
Metodo de Breed 1602
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Ventajas
Desventajas
Simple, facil ,eficaz Se puede utilizar un microscopio de
cuando las poblaciones son
pequeñas, el margen de error es fluorescencia, en el cual se utilizara grande un colorante distinto (fluorenscente) como el azul de anilina modificado. Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de Las celulas viables se pueden muestras diferenciar de las no viables, para eso se puede usar la naranja de acridina (0,01%). no requiere de un equipo caro
Staphyllococcus aureus 1602
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La muestra es distribuida en un volumen conocido de
una cámara de recuento. El número de microorganismos presentes en un área definida de la cámara de recuento multiplicado por el factor apropiado, determina el número total de microorganismos presentes en la muestra.
METODO DE PETROFFHAUSER
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Para evitar la cuantificación de las mismas células dos veces omitir los microorganismos ubicados en la líneas de la parte superior izquierda de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son considerados en los cuadros superior y derecho adyacentes 1602
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Ventajas
Desventajas
bastante exacto cuando se
Es muy tedioso, no es
trabaja con •nuestras que contienen poblaciones abundantes no requiere de un equipo caro, tan sólo se necesita una cámara de recuento puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas
práctico para un gran número de muestras No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bact/ml para que sean observadas al microscopio No distinguen células vivas de muertas
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Contador de Coulter El contador de Coulter está basado
en la determinación de la resistencia eléctrica de un medio de cultivo líquido al pasar a través de un orificio. Al pasar una célula, la resistencia aumenta bruscamente y dicho aumento es registrado por un dispositivo electrónico. Es posible determinar el número de partículas y su tamaño.
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ventajas
desventajas
fácil y rápido, muy sensible.
no distingue entre
microorganismos viables, muertos o partículas
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The coulter counter
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en placa Fuentes de error en elRecuento recuento en placa. El número de colonias que se obtiene en una determinación de viables depende: Por extensión tamaño del inoculo. El medio de cultivo. Siembra por vertido en placa Condiciones de incubación.
Por diluciones seriadas Asa calibrada
Miles Misra 1602
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Recuento en placa Método de extensión en placa
La muestra se extiende uniformemente sobre la superficie del agar usando una asa de vidrio estéril
La muestra (0.1mL o menos). Se pipetea sobre la superficie de la placa con agar
Resultado típico de la siembra por extensión UFC/mL
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Recuento en placa -por extensión
Ventajas
Desventajas
La técnica es rápida
Tiempo de incubación
barato
Uniformidad en la extensión de los microorganismos
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Método del vertido en placa
La muestra se pipetea en la placa estéril
Se añade medio estéril y se mezcla bien con el inóculo
Resultado típico del vertido en placa UFC/mL
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Recuento en placa -siembra por vertido en placa
Ventajas
Desventajas
Poco material Poca muestra
Tiempo de incubación
No hay dilución
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promedio de colonias X el factor de dilución= UFC/mL
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Recuento en placa -por diluciones seriadas
ventajas Muy sensible
Permite detectar pocos microorganismos /ml
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Desventajas Temperatura del medio de cultivo Preparación de las diluciones Material Tiempo de incubación y técnica Restricción del conteo (entre 30 a 300 colonias) Procesamiento de la muestra
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Recuento en placa -asa calibrada Técnica: Muestra liquida concentrada homogenizada Utilizar una asa que dispensa un volumen conocido Realizar siembra en masivo (estriado cerrado) en el medio de cultivo. Incubar Contar colonias Número de colonias X el factor de dilución 1602
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Recuento en placa - asa calibrada
Ventajas
Desventajas
La técnica es rápida
Tiempo de incubación
No hay restricción para el conteo
Uniformidad en la extensión de los microorganismos
Poca muestra barato
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METODO DE GOTA O DE MILES MISRA Se emplean pipetas Pasteur previamente calibradas. Desengrasar con cloroformo Se comprueba su exactitud. Se liberan de 48 a 52 gotas por mL. Colocar un número determinado de gotas de la muestra diluida sobre las placas de agar seco, después de que las gotas son absorbidas por el agar . se invierten las placas y se incuban.
RECUENTO POR FILTRO DE MEMBRANA Es viable Útil para establecer el número de microorganismos en muestras que contengan una población muy reducida. Los volúmenes grandes de aire o liquido se filtran a través de una membrana porosa en donde se concentran los microorganismos.
RECUENTO POR FILTRO DE MEMBRANA Filtro de membrana (0.2 μm o 0.45 | μm) Cultivo sólido.
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Colonias bacterianas desarrolladas sobre un filtro de membrana 1602
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VENTAJAS Proporciona
DESVENTAJAS recuentos
directos Rápido y fácil de realizar
Interfieren los altos niveles de
turbiedad
Método NMP Bacterias coliformes en agua Tablas estadísticas.
Bajas concentraciones (leche y agua) Tamaño de poblaciones. Viables
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Método de Breed (1911) 1. 2. 3.
4.
5. 6.
En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2 , invertir el portaobjetos Homogeneizar el tubo o matraz con el cultivo problema. Tomar 0.01 mL del cultivo y transferirlo al portaobjetos previamente marcado, extendiendo la muestra en el área marcada con el asa de platino estéril. Dejar secar al aire y fijar. Cubrir el frote con solución de azul de metileno de Lóeffler durante 2 min. Lavar con agua y dejar secar al aire.
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7. Determinar la superficie del campo microscópico, aplicando la
siguiente fórmula: 8. r2 en cm X 3.1416 = Superficie de campo microscópico en cm 9. 7 Determinar el número de campos microscópicos que existen en la preparación con la siguiente fórmula:
Superficie de la preparación
Número de campos microscópicos
Superficie del campo microscópico
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Calcular el número de microorganismos que hay en la preparación (0.01 ml) y en 1.0 ml del cultivo, mediante la siguiente fórmula:
Numero de microorganismos
Numero de campos en el microscopio
Numero de microorganismos en la preparación
100
Numero de microorganismos /ml de cultivo
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En condiciones de asepsia, colocar en el área hundida de la
plataforma de Petroff-Hauser, una gota y extenderla rápidamente. Pequeños excesos del cultivo, se acumulan en los canales de la orilla de la plataforma; en el caso de que éstos se inunden totalmente (el cubreobjetos no reposará al nivel de la superficie), limpiar la cámara y repetir el procedimiento. Coloque el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X. Cuente las células en cuadros individuales Cuente cuando menos 10 campos para obtener coeficientes de variación de 10% 1602
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Aplique la siguiente fórmula y calcular el número de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra original.
1 Volumen del cuadro
Promedio del numero de microorganismos contados
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Factor de dilución
Microorganismos por ml de la muestra original
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