Enzimas

“Biologia celular”

“Enzimas” • ‘Justus von Liebig’: – “Reacciones de fermentacion que producen alcohol, no son distintas de otras reacciones biologicas”

• ‘Louis Pasteur’: – “El proceso de fermentacion solo puede producirse en el interior de la celula”

• ‘Finalmente, Hans y Edward Buchner’: – “Demostraron que la fermentacion no requeria la presencia de celulas intactas”

“Enzimas” – La fermentacion actualmente se sabe es diferente de las reacciones quimicas organicas. – La fermentacion necesita la presencia de un conjunto de ‘catalizadores’ que no tiene semejanza en el mundo inanimado. – Los primeros catalizadores se llamaron ‘enzimas’ – Enzimas, mediadores del metabolismo, encargados de todas las reacciones que ocurren en una celula. – Sin las enzimas, las reacciones serian imperceptibles por su lentitud.

“Enzimas” – James Summner en 1926, cristalizo la primera ‘ureasa’ e identifico su composicion. – Pronto se demostro que varias enzimas mas, son ‘proteinas’ y despues de varios decenios mas se acepto que todas las enzimas son proteinas. – No obstante esto, se ha demostrado que el RNA puede tener accion catalizadora. – Las enzimas son proteinas, pero muchas de ellas son proteinas conjugadas, o sea que, tienen componentes ‘no-proteicos’ llamados ‘cofactores’, que pueden ser inorganicos (metales) u organicos (coenzimas)

“Enzimas” – Cuando estan presentes los ‘cofactores’ participan importantemente en el funcionamiento de las enzimas, y a veces hacen actividades que los aminoacidos no son adecuados. – Las enzimas en conjunto tienen las siguientes actividades: • Solo se precisan en pequenas cantidades. • No sufren cambios irreversibles durante la reaccion. • NO tienen efecto termodinamico sobre la reaccion

“Enzimas” – El ultimo punto es muy importante: ‘las enzimas no aportan energia para una reaccion quimica, por lo que no determinan si una reaccion es favorable’ (exergonica) o desfavorable (endergonica), desde el punto de vista termodinamico. – Las enzimas tampoco establecen las proporciones entre sustrato y producto de las sustancias quimicas que participan en reacciones. – Solo pueden acelerar la velocidad a la que procede una reaccion quimica favorable.

“Enzimas” – No es necesario que haya relacion entre la magnitud de la ∆G para una reaccion particular y la velocidad con la que se produce. – La magnitud de ∆G solo informa sobre la diferencia en la energia libre entre el estado inicial y el equilbrio. – La oxidacion de la glucosa es un proceso muy favorable, por la cantidad de energia liberada durante su combustion.

“Enzimas” – Las enzimas son catalizadores muy eficientes. – Los catalizadores organicos en el laboratorio (acido, platino metalico, y magnesio, aceleran las reacciones de 100 a 1000 veces respecto de la velocidad sin catalizador. – En contraste, las enzimas aceleran la reaccion hasta 108 a 1013 veces. Estas reacciones las realizan las enzimas a temperatura ambiente y en el pH del interior de la celula.

“Enzimas” – Las enzimas son muy especificas en relacion con los reactivos a los que se unen y la reaccion que catalizan. – Los reactivos unidos con una enzima se llaman ‘sustratos’ – Ademas de ser las enzimas, muy especificas y con un alto nivel de actividad, tambien son directores del trafico metabolico en el sentido de que las reacciones catalizadas por las enzimas sean muy ordenadas, y los unicos productos que se forman, sean los apropiados.

“Enzimas” – Por ultimo, diferente de otros catalizadores, la actividad de las enzimas puede regularse para cubrir las necesidades en un momento determinado. – Enzimas: una coleccion prodigiosa de maquinas subcelulares en miniatura. – A cada enzima se le dan dos nombres: • El primero, corto, el nombre recomendado, conveniente para el uso diario. • El segundo es el nombre sistematico, que es usado cuando la enzima debe ser identificada sin ambiguedad (funcion)

“Enzimas” • “Nombre recomendado: los nombres usados, usualmente tienen el sufijo “asa”, pegado al sustrato de la reaccion : – Glucosidasa, oxidasa, sucrasa; o a una descripcion de la funcion desarrollada, por ej., lactato deshidrogenasa y adenylato sintasa. Etc.

• Tambien algunas enzimas retienen su nombre original, que no da idea de la reaccion enzimatica asociada asociada: ‘tripsina’ pepsina’. • “Nombre sistematico”: Se ha desarrollado un sistema de nomenclatura en la cual las enzimas son divididas en 6 clases principales, con muchos subgrupos, que a veces son muy grandes para ser de uso comun ejemplo: • D-Glicerato 3-fosfato:NAD oxidoreductasa.

“Enzimas” • “Superacion de la barrera de la energia de activacion” – Como las enzimas pueden realizar una catalisis tan efectiva? • En principio; las reacciones favorables, desde el punto de vista termodinamico no proceden por si mismas a una velocidad alta sin contar con las enzimas. • Incluso el ATP cuya hidrolisis es tan favorable, permanece estable en la celula hasta que se degrada en una reaccion enzimatica controlada. • Si esto no fuera asi, el ATP seria de poca utilidad en la celula.

“Enzimas” • Para que haya transformaciones quimicas, ciertos enlaces covalentes, dentro de los reactivos deben romperse. • Para que esto ocurra, los reactivos deben contener suficiente energia cinetica (energia en movimiento) para superar una barrera conocida como “energia de activacion”

“Enzimas” • La energia de activacion se representa en la grafica como la ‘altura de las curvas’. -Los reactivos de una reaccion quimica, se comparan con un objeto que tiene energia potencial. • La grafica muestra la ‘energia de activacion y reacciones enzimaticas.

“Enzimas” • La grafica nos da la informacion de la transformacion de una molecula de glucosa en ‘glucosa 6-fosfato • Esta conversion es favorecida por la presencia de una enzima que cataliza la fosforilacion de la glucosa.

“Enzimas” • Una solucion a temperatura ambiente, existen moleculas en un estado de movimiento aleatorio, cada una con energia cinetica en un instante determinado. • Entre una poblacion de moleculas, su energia se distribuye en una curva en forma de campana. • Algunas con muy poca energia y otras con mucha mas.

“Enzimas” • Las curvas indican el contenido de energia de una poblacion de moleculas presentes en una mezcla de reacciona dos diferentes temperaturas. El volumen de moleculas reactivas que contienen suficiente energia para presentar la reaccion aumenta con el calentamiento de la mezcla o la adicion de un catalizador enzimatico. -El calor aumenta la velocidad de reaccion porque aumenta el contenido de energia de las moleculas, mientras que la enzima lo hace porque baja la energia de activacion necesaria para que se produzca la reaccion.

“Enzimas” – La velocidad de una reaccion depende del numero de moleculas reactivas que contienen la energia cinetica necesaria en cualquier momento especifico. – Una manera de aumentar esta velocidad de reaccion consiste en aumentar la energia de los reactivos. La manera mas simple es aumentar la temperatura de la mezcla de reaccion. – En contraste, la aplicacion de calor e una reaccion mediada por enzimas conduce a la desactivacion rapida de la enzima por desnaturalizacion.

“Enzimas” – Los reactivos estan en la cima de la cresta de energia y listos para convertirse en productos, y se dice que estan en estado de transicion. – Ahi, los reactivos formaron un complejo activado, efimero en el se forman y rompen enlaces. -Las enzimas catalizan las reacciones mediante reduccion de la magnitud de la barrera de la energia de activacion.

“Enzimas” – Las enzimas son capaces de bajar la energia de activacion al unirse con mas fuerza al estado de transisicon que los reactivos, lo cual estabiliza este complejo bajando su energia. – Porque es importante el estado de transicion? • Los compuestos que simulan ese estado de transicion de una reaccion pueden ser inhibidores de esa reaccion porque se pueden unir firmemente a la region catalitica de la enzima. • Normalmente, los anticuerpos no actuan como enzimas, tan solo se unen con gran afinidad a las moleculas.

“Enzimas” – “El Sitio Activo y la Especificidad molecular” • Las enzimas, como catalizadores aceleran los procesos de rotura y formacion de enlaces. • Logran su participacion formando un complejo con los reactivos llamado complejo sustratoenzima. • En la mayoria de los casos la relacion entre la enzima y el sustrato no es covalente, solo en algunos casos se observa una relacion covalente ‘transitoria’

“Enzimas”

“Enzimas” • La parte de la molecula enzimatica, que se une con el sustrato, se le llama ‘sitio activo’. • El sitio activo y el sustrato tienen formas complementarias. • La union del sustrato con la enzima es a traves de interacciones no-covalentes. • En la figura anterior, hay resduos con carga positiva en sitios estrategicos para unirse a atomos de carga negativa del sustrato. • Las cadenas de aminoacidos en el sitio activo influyen sobre el sustrato y reducen la energia de activacion.

“Enzimas” • Por lo general el sitio activo es una hendidura o grieta que conduce del medio acuoso a las profundidades de la proteina. • Al entrar el sustrato, al sitio activo, libera sus moleculas de agua y entra al medio hidrofobo, de la enzima. • La recatividad de las cadenas laterales, del sitio activo, puede ser mucho mayor en este ambiente protegido, que en el solvente acuoso de la celula. • La estructura del sitio activo no solo explica la actividad catalitica de la enzima, tambien su ‘especificidad’

“Enzimas” – “Mecanismos de Catalisis Enzimatica” • En donde reside la rapidez de catalisis de las enzimas? • En la formacion del complejo enzima-sustrato

“Enzimas” • Formado el complejo enzima-sustrato, las propiedades fisicas y quimicas del sustrato pueden modificarse de varias maneras:

– “Orientacion del Sustrato” • Los sustratos unidos

se aproximan en la orientacion apropiada para producir la reaccion.

“Enzimas” • En contraste, cuando los reactivos estan en solucion, estan libres para realizar movimientos de traslacion y rotacion.

– “Cambio de la reactividad del sustrato” • Las enzimas estan formadas por aminoacidos que tienen variados tipos de cadenas colaterales: poseen cargas elevadas y algunos son ‘apolares’. • Al unirse un sustrato con la superficie de la enzima, la distribucion de electrones dentro de la molecula de sustrato recibe la influencia de las cadenas laterales contiguas de la enzima.

“Enzimas” • Esta influencia, aumenta la reactividad del sustrato y estabiliza el complejo E/S en estado de transicion que se forma durante la reaccion. • Estos efectos se producen sin ingreso de energia externa, como calor.

“Enzimas” – Estos mecanismos incluyen modificaciones en las reacciones por los cambios del pH de su medio. – Aunque las enzimas no pueden cambiar este pH, contienen algunos aminoacidos con cadenas laterales acidas o basicas. – Estos grupos son capaces de donar o aceptar protones del sustrato, lo que altera el caracter electrostatico del sustrato y lo vuelve mas reactivo.

“Enzimas” – Los sitios activos de las enzimas, poseen cadenas laterales con una carga positiva o negativa parciales. – Estos grupos son capaces de reaccionar con un sustrato para producir un enlace covalente temporal entre la enzima y el sustrato.

“Enzimas” • La quimotripsina, una enzima que digiere proteinas de los alimentos en el intestino delgado: • La quimotripsina hidroliza un enlace peptidico en una proteina sustrato.

“Enzimas” • Tres aminoacidos dentro del sitio activo de la enzima –una serina, una histidina y un acido aspartico. • La reaccion comprende 2 pasos: -El atomo de oxigeno con carga negativa de la cadena lateral de la Serina de la enzima, ataca a un carbon del sustrato formand un enlace covalente entre la serina y el sustrato desplazando al resto del sustrato, como uno de los productos.

“Enzimas” • Para que la serina realice esta reaccion depende del residuo de Histidina cercano,el cual ataca el proton del grupo hidroxilo de la serina elevando la negatividad electrica del atomo de oxigeno. • En el 2o. paso el enlace covalente entre la E/S se parte por una molecula de H20 y regresa a la enzima a su estado original

“Enzimas” • “Induccion de tension en el sustrato”

– Una vez que se une el sustrato al sitio activo de la enzima hay cambios de colocacion relativa de ciertos atomos de la enzima. – Lo cual puede favorecer el ajuste complementario entre la enzima y el sustrato y los grupos reactivos apropiados de la enzima se colocan en su sitio; a esto se le llama un ajuste inducido.

• El ajuste inducido:

– Una vez capturada, por la enzima, ciertos enlaces de la molecula del sustrato pueden ponerse bajo tension fisica o electronica.

“Enzimas” – Comprender el mecanismo en el cual una enzima cataliza una reaccion, es conocer los muchos cambios electronicos y atomicos que suceden durante la reaccion catalitica – La cristalografia con rayos X revelan detalles de la molecula enzimatica grande, y se puede, con esta tecnica, estudiar el grado de actividad enzimatica – Actualmente estas tecnicas se usan para obervar los cambios estructurales fugaces que tienen lugar en el sitio activo, mientras una enzima cataliza un solo ciclo de reaccion.

“Enzimas” • Esta grafica presenta un ejemplo de “ajuste inducido”

“Enzimas” • “Cinetica enzimatica”

– Las enzimas varian en su capacidad para catalizar reacciones. – El estudio de su ‘cinetica’ revela su actividad catalitica, o la velocidad a la que cataliza una reaccion. – En 1913 Leonor Michaelis y Maud Menten describieron la relacion matematica entre la [sustrato] y la velocidad de las reacciones enzimaticas.

“Enzimas” – Esa relacion genera una curva ‘hiperbolica’. – Esta curva se puede obtener para cada enzima estudiada. – Para conocer la velocidad de una reaccion, se ajusta de incubacion a una temp., deseada que contenga todos los ingredientes necesarios, ‘menos uno’, que inicia la reaccion al agregarse.

“Enzimas” • Si no aparece el producto cuando se inicia la reaccion, entonces la cantidad de producto que aparezca con el tiempo, da una medida de la velocidad de la reaccion.

“Enzimas” • Este proceso tiene factores que lo complican:

– el tiempo de incubacion es prolongado, la [sustrato] se reduce notablemente. – Y conforme aparece el producto, puede convertirse en sustrato por la reaccion inversa que tambien esta catalizada por la misma enzima.

“Enzimas” – Lo ideal es conocer la ‘velocidad inicial’, o sea cuando aun no se ha formado el producto.Para generar una curva hiperbolica, se deterina la velocidad inicial para una serie de ‘mezclas de incubacion que tengan la misma cantidad de enzima, pero una concnetracion creciente de sustrato. – Resulta evidente que la velocidad inicial de la reaccion varia en relacion a la [sustrato]

“Enzimas” – Con concentraciones altas de sustrato, la velocidad de la reaccion se aproxima al estado de “saturacion” . – La medida mas simple de la actividad catalitica de una enzima se obtiene de su numero de recambio, que puede calcularse a partir de su ‘V max’. – El numero de recambio, es el numero maximo de moleculas de sustrato que puede convertirse en producto por una sola molecula de enzima por unidad de tiempo.

• El valor de Vmax es solo un termino util, otro es la constante de Michaelis, (KM), que es igual a [sustrato] (S), cuando la velocidad de la reaccion es la mitad de Vmax.

“Enzimas” – Km es la constante para una enzima determinada pero independiente de la concentracion de sustrato o enzima. – La relacion entre Vmax y KM se entiende mejor si se considera la ecuacion de Michaelis-Menten – V = Vmax S/[S] + KM

– O tambien, cuando la [sustrato] S seexpresa en un valor equivalente a la KM. – Casi siempre, el valor de Km informa de la afinidad de la enzima por el sustrato. – Otros factores con influencia en la cinetica: pH y Temperatura.

“Enzimas” • Para trazar la linea hiperbolica y hacer el calculo preciso de los valores Vmax y Km deben trazarse miles de puntos. Mas sencillo si se trazan ‘reciprocos de la velocidad contra la concentracion dio lugar a una linea recta (en lugar de la hiperbole) con una interseccion en ‘x’ igual a -1/Km, la interseccion de ‘y’ es igual a 1/Vmax, extrapolando esa linea con pocos puntos.

“Enzimas” • Inhibidores enzimaticos:

– Son moleculas que al unirse con la enzima disminuyen su actividad.– La celula depende de muchos de estos inhibidores para regular las actividades de la enzima. -Bioquimicos usan inhibidores paar estudiar la funcion de las enzimas. – Companias de bioquimicos, producen inhibidores enzimaticos que actuan como farmacos, antibioticos o pesticidas.

“Enzimas” – Los inhibidores enzimaticos pueden dividirse en dos tipos: • “Los inhibidores irreversibles”

– Se unen con firmeza a una enzima, a menudo mediante la formacion de un enlace ‘covalente’ con uno de sus residuos de aminoacidos. • El acido acetilsalicilico (aspirina) actua como inhibidor irreversible de las “ciclooxigenasas”, mediante la acetilacion de un residuo de ‘serina’ clave en el sitio activo de la enzima. • Varios gases nerviosos: ‘diisopropilfosfofluoridato’ y los pesticidas ‘organofosforados’, actuan como inhibidores irversibles de la ‘acetilcolinesterasa’.

“Enzimas” • La penicilina actua como inhibidor irreversible en una enzima clave para la formacion de la pared bacteriana. • Los inhibidores ‘reversibles’. • Son de dos tipos: ‘competitivos’ y ‘nocompetitivos’. • Los inhibidores competitivos: son reversibles y compiten con un sustrato, por el sitio activo de la enzima. El sustrato tiene una estructura complementaria con la enzima, el inhibidor debe tenre esa misma caracteristica, solo que no debe convertirse en producto.

“Enzimas”

“Enzimas” – La inhibicion enzimatica competitiva es la base de la actividad de multiples farmacos de uso frecuente.

• La enzima convertidora de angiotensina, es una enzima proteolitica que actua sobre un peptido de 10 residuos (decapeptido) ‘angiotensina I’ para producir un compuesto de 8 residuos, ‘angiotensina II’ -este residuo en altas concentraciones sanguineas produce hipertension.

“Enzimas” – Buscando compuestos que pudieran inhibir la enzima convertidora, encontraron en un crotalo brazileno un veneno que contenia un componente llamado ‘Teprotido’; era un inhibidor competitivo potente de la ECA. Con poca accion por ser un peptido, que se degradaba rapidamente. Ensayos posteriores dieron por resultado la formcacion del “Captopril”

“Enzimas” – La efectividad de un inhibidor competitivo depende de su afinidad relativa por la enzima. – La inhibicion competitiva puede superarse si el indice sustrato inhibidor es grande. • O sea, si el numero de colisiones entre la enzima y el inhibidor se vuelve insignificante en relacion con las colisiones entre la enzima y el sustrato, el efecto inhibidor se vuelve minimo.

“Enzimas” – En la inhibicion no-competitiva, el competidor y el sustrato no compiten por el sitio activo, el inhibidor ocupa un espacio distinto, fuera del sitio activo. – El nivel de inhibicion depende de la concentracion del inhibidor y la elevacion en la concentracion del sustrato no puede vencerlo.

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