Elektroforesis.pptx

elektroforesis FAKULTAS FARMASI 2016

Outline • Pendahuluan

• Mode dalam Elektroforesis • Media Elektroforesis • Elektroforesis Kapiler

• Review Jurnal

Pendahuluan • Ferdinan Freseric Reuss, 1807 → pergerakan partikel bermuatan akibat medan lisrtik • Michelis → istilah elektroforesis • 1950-an → elektroforesis mulai banyak digunakan, 1970-an → KCKT → elektroforesis : protein dan DNA

• Elektroforesis : metode analisis yang berdasarkan perbedaan mobilitas atau pergerakan dari dua atau lebih analit yang bermuatan atau partikel pada medium penghantar oleh adanya pengaruh medan listrik arus searah. • Pergerakan dalam elektroforesis akan mengarah pada elektroda dengan muatan yang berlawanan dari partikel atau ion yang akan dipisahkan. • Kation → katoda, anion → anoda, spesi netral tidak bergerak dengan adanya medan listrik, bergerak dengan berdifusi dan terbawa oleh aliran elektroosmotik.

• Laju pergerakan dari partikel yang bermuatan → resultan dari daya dorong dan gaya hambat. •Gaya dorong dalam elektroforesis, disebabkan oleh kekuatan medan listik, E, 𝐸=

𝑡𝑒𝑔𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑎𝑛𝑡𝑎𝑟𝑒𝑙𝑒𝑘𝑡𝑟𝑜𝑑𝑎

• Sedangkan gaya dorong yang dialami sebuah ion: 𝐹𝑒𝑓 = 𝑞𝐸 q : muatan total ion.

=

𝑉 𝐷

• Gaya hambat, 𝐹𝑒𝑓 , dinyatakan dengan hukum Stokes: 𝐹𝑓𝑟 = 6𝜋𝑟𝜐𝜂 di mana: 𝜂 : viskositas medium r : radius molekul 𝜐 : kecepatan. • Selain gaya gesek, gaya hambat dapat diakibatkan oleh : bentuk dan ukuran molekul, konsentrasi elektrolit, kelarutan, adsorpsi pada permukaan, dan adanya kompleksasi dengan spesi pada larutan elektrolit.

• Saat kesetimbangan : 𝐹𝑒𝑓 = 𝐹𝑓𝑟 Sehingga: 𝑞𝐸 = 6𝜋𝑟𝜐𝜂 𝜐=

𝑞𝐸 6𝜋𝑟𝜂

• Mobilitas μ, merupakan kecepatan rata-rata dari ion pada medan listrik tertentu, 𝜇=

𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑒𝑐𝑒𝑝𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑒𝑘𝑢𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑚𝑒𝑑𝑎𝑛 𝑙𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑘

=

𝜐 𝐸

• Mobilitas sebanding dengan rasio muatan-ukuran. • Spesi kecil, muatan yang besar, seperti ion → mobilitas tinggi • Senyawa terionisasi besar, seperti protein → mobilitas rendah. • Pada elektroforesis, berlaku hukum Ohm, yaitu 𝑉 = 𝑖𝑅, dan daya 𝑊 = 𝑖 2 𝑅, • W dapat digunakan untuk menyatakan kuantitas kalor yang dapat dihasilkan dari gaya listrik → aliran konveksi, perambatan termal, evaporasi, perubahan viskositas, terjadinya variasi pH, dan degradasi analit (terutama protein) dan matriks → pelebaran pita dan turunnya resolusi →digunakan larutan dapar yang encer dan konduktivitas rendah, tegangan yang rendah (100-500 V), arus atau daya yang konstan, atau dengan menggunakan sistem pendingin.

Mode dalam Elektroforesis • moving boundary electrophoresis

• elektroforesis zona • pemusatan isoelektrik atau isoelectric focusing • isotachophoresis.

Moving boundary electrophoresis Sampel dan dapar diletakkan dalam sebuah reservoir sampel (wadah elektrolit), dicelupkan elektroda pada kedua ujungnya. Larutan dapar akan

menghubungkan

dua

elektroda

dan

terpisahkan oleh matriks pemisahan. Ketika

potensial diberikan, analit dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan mobilitasnya. Saat ini, tenik tersebut jarang digunakan, kecuali mungkin untuk tujuan preparatif.

Elektroforesis Zona Sampel dimasukkan dalam sebuah cerukan atau lubang dalam media, umumnya gel, yang ada di

dalam larutan dapar elektrolit. Analit diletakkan di suatu titik di antara elektroda jika muatan analit tidak diketahui. Komponen sampel akan bermigrasi dengan kecepatam yang berbeda dan

mungkin ke arah yang berbeda tergantung mobilitas dan muatannya. Jadi setelah periode waktu

tertentu,

menjadi zona-zona.

komponen

akan

terpisah

Isoelectric focusing Merupakan elektroforesis pada gradien pH. Senyawa ionik akan bermigrasi ke titik pada gradien tersebut di mana senyawa tersebut memiliki muatan total nol dan tidak ada mobilitas. Gradien pH diperoleh dengan memberikan tegangan pada campuran senyawa amfoter (amfolit) yang memiliki nilai pI dengan rentang-rentang yang sempit. Secara umum, campuran protein dicampurkan dengan amfolit, dan ditempatkan di antara elektroda, untuk kemudian

dipisahkan.

Isotacophoresis Bentuk dari elektroforesis di mana gradien tegangan dihasilkan dengan menggunakan dapar dengan mobilititas

yang berbeda pada arus yang konstan. Elektroforesis berjalan hingga semua analit ionik bergerak dengan kecepatan yang sama. Sampel diletakkan di antara leading electrolyte, yang mana μbuffer ion>> μsampel, dan terminating electrolyte, yang mana μbuffer

ion<<

μsampel. Leading

electrolyte biasanya berupa ion kecil seperti klorida dan terminating electrolye biasanya ion yang lebih besar, seperti histidine. Ketika kondisi steady state tercapai, akan terbentuk lebar pita yang berbeda.

Media Pemisahan Elektroforesis • Elektroforesis dapat dilakukan pada medium larutan.

• Namun karena terjadinya percampuran termal dan difusional, resolusi yang memuaskan sering tidak dapat tercapai • Maka dari itu perlu sebuah penyangga, yang memuat elektrolit, sampel, dan yang dapat untuk mengurangi difusi. • Penggunaan penyangga sebagai medium penstabil telah banyak dikembangkan dari berbagai jenis material, mulai dari kertas, silika, serbuk selulosa, selulosa asetat, nitroselulosa, hingga gel.

Slab Gel Electrophoresis • Gel dari alam → awal : pemisahan protein plasma. Kini : gel kemurnian tinggi → protein • 1955, Smithies memodifikasi jenis gel → gel pati → dari pati kentang terhidrolisis, 5-10 mm → pemisahan lebih baik • Pada tahun 1955, Raymond dan Weintraub mengganti pati → gel polimer sintetik, dari monomer poliakrilamid → lebih kuat, fleksibel, jernih, dan inert • Gel akrilamid : hasil polimerisasi monomer akrilamid dengan adanya N,N— metilbisakrilamid (BIS). Digunakan katalis, yang umum : N,N,N,N’,N”tertrametiletilendiamin (TEMED).

SDS PAGE dan Elektroforesis DNA Sodium dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Protein memiliki rasio muatan-ukuran yang beragam → muatan dari protein akan bervariasi bergantung dari pH. SDS, yaitu sebuah surfaktan anionik yang dapat mensolubilisasi protein. Protein akan didenaturasi dengan SDS, dengan beikatan pada rangka protein. Protein yang telah didenaturasi kemudian dielektroforesis dengan PAGE dalam sistem dapar yang ditambahkan 0,1% SDS. Elektroforesis pada DNA

Elektroforesis gel agarosa merupakan metode untuk memisahkan fragmen restriksi DNA, di mana fragmen DNA akan berukuran 1000 hingga 23000 pasang basa.

Instrumentasi Dasar Elektroforesis • Generator tegangan DC : baterai 12 V hingga pensuplai tegangan 100 hingga 500 V DC.

• Tanki tempat larutan dapar : tahan air, dan bahan plastik yang tidak dapat menghantarkan listrik, dilapisi penutup untuk mencegah penguapan dan kontaminasi pada sistem, ukuran100 mm2 hingga 500 x 300 mm. • Di bagian luar : terhubung dengan elektroda. Elektroda : kawat platinum dan terhubung ke dinding tanki. • Wadah gel : untuk pemisahan, dapat berbentuk tube dengan ukuran diameter dalam 105 mm dan panjangnya 50-250 mm, atau gel dapat benebntuk lempengan, dapat dalam posisi horizontal atau vertikal.

Metode Deteksi • Sampel akan tidak berwarna dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang → metode deteksi, lokalisasi, dan kuantisasi dari pita atau bercak dari analit. • Pengamatan langsung : pita hemoglobin yang dipisahkan dengan elektroforesis pada membran nitroselulosa → UV

• Medium yang rapuh seperti gel → ekstraksi sebelum visualisasi → diperlukan blotting. • Blotting : mentrasfer pita atau bercak sampel dari gel ke membran menggunakan mekanisme fisik atau elektrik. Membran : nitroselulosa, nylon, atau poliviniliden difluorida (PVDF). • Southern blotting, dikembangkan pertama oleh Profesor Ed Southern, untuk sampel DNA. Northern blot untuk RNA, dan untuk protein disebut Western blot.

Blotting • Pada mekanisme fisik, analit akan berdifusi ke membran akibat adanya tekanan yang diberikan pada gel yang berkontak dengan membran. • Sedangkan dengan mekanisme elektrik, gel yang mengandung pita DNA, dilekatkan dengan membran,

lalu dicelupkan dalam dapar, di antara 2 elektroda. Kemudian

diberikan

tegangan

agar

terjadi

perpindahan ke membran. Jika tidak digunakan dapar, melainkan kertas saring yang dibasahi dengan dapar,

maka teknik tersebut disebut semi-dry blotting.

Metode deteksi Posisi analit pada lembaran dapat ditentukan dengan beberapa metode.: • Senyawa berlabel radioaktif dan telah terinkorporasi pada analit → autoradiografi. • Reaksi derivatisasi → derivat yang berwarna dan dapat dilihat. Misal : pada asam amino, peptida, dan protein → ninhidrin • Protein → Coomassie brilliant blue → 0,3 μg protein dalam satu bercak. • DNA → Ethidium bromida • Ion perak : untuk protein dan juga DNA → terbentuk endapan perak hitam. Sensitivitas hingga 2 ng protein. • Zimografi dan imunoelektroforesis. Setelah dilakukan blotting, protein yang terimobilisasi akan di-probe dengan antibodi spesifik dari protein tersebut. Lalu ditambahkan antibodi kedua yang terikat enzim yang akan menempel pada antibodi yang pertama.

Metode kuantitatif • Area dari pita yang telah terpisah dapat menunjukkan jumlah analit, dibandingkan dengan larutan standarnya. • Area dari pita atau bercak dapat diperoleh dengan densitometri atau dengan metode analisis digital.

Aplikasi • Saat ini, hanya sedikit pemanfaatan elektroforesis planar untuk pemisahan berbagai senyawa. • Saat ini, analisis banyak dilakukan dengan KCKT dan juga elektroforesis kapiler. • Hingga saat ini, hanya protein dan DNA yang masih banyak dianalisis menggunakan teknik elektroforesis planar ini.

Capillary Electrophoresis Elektrolisis kapiler merupakan metode analis yang didasari oleh migrasi yang terjadi di dalam kapiler berisi analit bermuatan yang terlarut dalam larutan elektrolit di bawah pengaruh medan listrik.

Kecepatan migrasi analit dipengaruhi oleh medan listrik, mobilitas elektroforetik analit dan mobilitas elektroosmotik kapiler.

Mobilitas Elektroforetik Mobilitas eletroforetik bergantung pada sifat analit dan dapar yang digunakan. Kation bergerak menuju anoda, anion menuju katoda, sementara molekul netral tidak terpengaruh. Mobilitas elektroforetik (VEP) analit dengan asumsi analit berbentuk sferis (bulat) ditentukan dengan persamaan:

Mobilitas Elektroosmotik Aliran ini berhubungan dengan migrasi molekul bermuatan dari elektrolit melalui pipa kapiler. Pada pH lebih dari 3, dinding dalam pipa kapiler silika bermuatan negatif yang disebabkan ionisasi silanol dipermukaan (Si-OH) sehingga kation berkumpul di dekat silanol untuk menjaga keseimbangan muatan. Ketika pipa kapiler diberikan medan listrik, kation akan tertarik menuju katoda dan membawa sebagian molekul bermuatan.

Mobilitas Elektroosmotik Mobilitas aliran elektroosmotik (μeo) dipengaruhi oleh densitas muatan dinding dalam pipa kapiler dan sifat dapar yang digunakan. Mobilitas elektroosmotik (Veo) ditentukan dengan persamaan:

Instrumentasi Injeksi sampel ◦ Elektrokinetik Ujung pipa kapiler dicelupkan kedalam larutan (elektrolit) yang berisi sampel kemudian dialirkan tegangan listrik yang menyebabkan sampel masuk kedalam kapiler dengan kombinasi migrasi ion dan aliran elektroosmotik. ◦ Hidrostatik Ujung pipa kapiler juga dicelupkan kedalam larutan (elektrolit) yang berisi sampel, perbedaan tekanan menyebabkan larutan masuk kedalam kapiler.

Instrumentasi Detektor ◦ UV/Vis Deteksi biasa dilakukan dengan UV-Vis menggunakan detektor diode-array. UV sensitif bila digunakan pada panjang gelombang yang rendah.

◦ Fluoresence Detektor ini mengimplikasikan pada derivatisasi dari analit, yang diberi label dengan flurophore secara kimia. Kemudian pemisahan dilakukan seperti biasa. Sensitifitas dari deteksi ini meningkat jika sumber laser digunakan sangat kuat.

◦ Spektrometri massa Spektrometri massa dihubungkan dengan elektroforesis kapiler sehingga memberikan informasi berat molekul zat terlarut. Untuk itu, dibutuhkan aliran cairan yang lebih pada kapiler elektroforesis untuk mendapatkan ion fase gas dari zat terlarut.

Capillary Zone Electroporesis (CZE) • Pada CZE, analit bergerak dalam aliran elektroosmotik, namun dipisahkan dalam pita-pita karena perbedaan mobilitas elektroforetik masing-masing analit. Perbedaan mobilitas elektroforetik masing-masing analit ini menyebabkan perbedaan kecepatan migrasi analit-analit secara keseluruhan dan dengan perbedaan kecepatan berarti terdapat pemisahan • Hal terpenting dalam CZE adalah pemilihan dapar yang sesuai untuk mencuci kapiler sebelum kapiler digunakan dan untuk melarutkan analit. Pemisahan terjadi karena interaksi yang relatif sederhana antara analit dengan pH dapar.

Micelar Electrokinetik Capillary Chromatography (MEKC) • Pada elektroforesis kapiler ini ditambahkan surfaktan ionik kedalam larutan penyangga yang mengalir pada konsentrasi misel kritis. • Misel ini bercampur dalam larutan, membentuk fase pseudo-statis seperti fase diam pada HPLC. • Misel menangkap senyawa netral melalui afinitas interaksi hidrofilik/hidrofobik.

Capillary Gel Electrophoresis (CGE) • Elektroforesis gel dalam kapiler. Kapiler diisi larutan elektrolit yang diserap oleh gel. • Hal ini menyebabkan efek filtrasi, yang menurunkan aliran elektroosmotik dan mengurangi fenomena konveksi dan difusi. • Oligonukleotida dapat dapat dipisahkan dengan metode ini. Teknik yang telah dimodifikasi dikenal dengan capillary array electrophoresis untuk pemisahan fragmen DNA atau RNA berdasarkan ukurannya.

Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) • Pemisahan berdasarkan pada perbedaan titik isoelektrik (pI) dari analit. • Pemisahan protein dalam CIEF tergantung pada panjang pipa kapiler dan migrasi analit. • Pipa kapiler diisi dengan larutan yang mengandung zwitterion atau ampholyte. • Analit (umumnya protein) akan bermigrasi melalui media hingga mencapai daerah yang pH nya sama sebagai titik isoelektriknya. Kemudian dengan mempertahankan medan listrik dan menggunakan tekanan hidrostatik, spesies yang terpisahkan ini akan bergerak menuju detektor.

Review Jurnal : 1

Sanli, S., C. Lunte, 2014, Determination of Eleven Flavonoid in Chamomile and Linden Extracts by Capillary

electrophoresis,

Anal. Methods, 6, 3858.

Pendahuluan • Tujuan : mengembangkan metode untuk penetapan kadar sebelas flavonoid dalam ekstrak chamomile dan linden • Senyawa flavonoid yang diteliti : apigetrin, naringin, neringenin, katekin, galangin, apigenin, luteolin, kuersetin, mirisetin, kaempferol, dan kaemferide • Analisis flavonoid banyak dilakukan dengan menggunakan KCKT dan kromatografi gas. • Elektroforesis kapiler dan kromatografi elektrokinetik miselar juga telah dilaporkan dapat digunakan dalam analisis dan pemisahan flavonoid

Prosedur dan sistem elektroforesis (1) •Pertama, kapiler diaktivasi dengan dialiri secara berturut-turut:      

metanol (5 menit), HCl 1,0 M (2 menit), air (2 menit), NaOH 1,0 M, air (2 menit) larutan dapar (20 menit).

•Kapiler lalu dikondisikan dengan dicuci dengan:  NaOH 1,0 M (20 menit),  air (2 menit), dan  dapar (20 menit).

Prosedur dan sistem elektroforesis (2) • Sebelum sampel setelahnya dianalisis, kapiler dialiri dahulu dengan  NaOH 1,0 M (3 menit)  air (2 menit)  dapar (3 menit).

• Tegangan : 24 kV • Tekanan injeksi :10 psi selama 5 detik

• Deteksi : 210 nm.

Preparasi sampel • Sampel chamomile dan linden dikumpulkan, dikeringkan di udara. • 0,5 gram dari tiap sampel digerus dan ditimbang. • Ditambahkan 25 mL metanol, 15 mL air, dan 0,04 gram BHT. • Untuk hidrolisis ditambahkan HCl 6 M sebanyak 10 mL. • Ekstraksi dengan refluks, 80 oC selama 1,5 jam, bebas cahaya.

• Setelah didinginkan, 5 mL larutan diambil, dikeringkan,residunya dilarutkan kembali dengan dapar. • Larutan disaring dengan membran 0,25 μm dan disuntikkan ke sistem.

Hasil dan Pembahasan • Molekul flavonoid : satu gugus hidroksi fenolik yang dapat terionisasi. Ionisasi → menentukan mobilitas. • pH pemisahan yang paling baik, antara 8,7 hingga 9,1. pH optimum : adalah 8,9 → hasil resolusi, selektivitas, dan bentuk puncak yang baik. • Konsentrasi borat ditingkatan, waktu migrasi meningkat. Resolusi yang baik dicapai dengan waktu pemisahan tersingkat : dapar borat 40 mM. • Tegangan tinggi → pemisahan cepat. Tegangan yang terlalu tinggi → meningkatkan baseline noise dan meneybabkan pelebaran puncak. Diketahui bahwa tegangan yang optimum adalah 24 kV.

Elektroforegram dari sebelas flavonoid pada kondisi optimum. Puncak ditandai dengan

nomor 1 hingga 11, bertutur-turut : 1. naringin,

2.

apigetrin,

3.

katekin,

4.

naringenin, 5. kaempferide, 6. galangin, 7.

kaempferol, 8. apigenin, 9. mirisetin, dan 10. luteolin

Hasil dan Pembahasan • Flavonoid → negatif → mobilitas elektroforetik berlawanan dengan aliran elektroosmotik. • Naringin → glikosida disakarida, ukuran besar, mobilitas elektroforetik rendah → terelusi pertama • Apigetrin → glikosida monosakarida → akan terlusi kedua. • Flavonoid aglikon lainnya akan terpisah berurutan sesuai dengan nilai pKa nya. • Katekin → bermuatan parsial pada pH pemisahan dan memiliki mobilitas elektroforetik paling rendah di antara aglikon lainnya → terelusi paling cepat. • Luteolin dan kuersetin → molekul dianion pada pH pemisahan, mobilitas elektroforetik tercepat → terelusi paling akhir • Senyawa lainnya akn terelusi di antra katekin dan luteolin, bersadarkan kombinasi nilai pKa dan ukurannya.

Elektroforegram dari ekstrak chamomile: 1. katekin, 2. kaempferol, 3. kuersetin.

Elektroforegram dari ekstrak linden : 1. katekin, 2. kaempferol, 3. apigenin, 4. mirisetin.

Daftar Pustaka Dadakova E, Prochazkova E and Krizek M, 2001, Application of Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography for Quantitative Analysis of Quercetin in Plant Materials, Electrophoresis, 22, 1573-1578.

H Thomas, Palaniyandi M, Kato T, Fleischmann P, Watzig H and Park E.Y, Characterization of Human Papillomavirus 6b L1 virus-like particles Isolated from Silkworms using Capillary Zone Electrophoresis, J Biosci Bioeng, vol 118 No. 3, 311- 314. Perrett, D.,I. D. Wilson (ed), 2000, Electrophoresis, in Encyclopedia of Separation Science, Academic Press, 103-117. Rouessac F. and A. Rouessac, 2007, Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd ed, Francis : John Wiley & Sons, Ltd, 145-158. Sanli, S., C. Lunte, 2014, Determination of Eleven Flavonoid in Chamomile and Linden Extracts by Capillary electrophoresis, Anal. Methods, 6, 3858. Shi Q, Sui L.Z, and Lu Y.Q., 2013, Research on Flavonoids Contents in Fructus sophoera with Capillary Zone Electrophoresis”. Pak. J. Pharm. Sci., Vol 26, No. 6 1131-1136. Skoog D.A, Holler F.J, and Crouch S.R. , 2007, Principles of Instrumental Analysis, 2nd ed. USA, Thomson: Brooks/Cole, 868-883. Zhang, L., R. Wang, Y. Zhang, Y. Yu, 2007, Application of High Performance Capillary Electrophoresis on Toxic Alkaloid Analysis, J. Sep. Sci, 30, 1357-1363.