Electroforesis_y_cromatografia.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Origen de la electroforesis La electroforesis es la separación de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Un físico Ruso Alexander Reuss hizo las primeras observaciones del principio de la electroforesis en 1807. En la aplicación del campo eléctrico a una suspensión de arcilla en agua, el observó que las partículas de arcilla se movían hacia el polo positivo. Las observaciones de que las partículas con carga positiva se movían hacia el polo negativo y las partículas con carga negativa se movían hacia el polo positivo fueron confirmadas por Michael Faraday en Inglaterra y E.H. Bosi-Raymond en Alemania. También se observó que la mayoría de las partículas son ubicadas con cargas son más rápidas en su movimiento y que el número de cargas en exceso en las partículas y el voltaje de la corriente aplicada también afecta la velocidad de su movimiento. Adicionando un ácido, base, sal o un electrolito a la solución se supera la dificulta de aumentar la conductividad eléctrica de la solución. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida: Introducción y técnica básica La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis'). La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pHs, temperatura y fuerza iónica.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Algunas características destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son: a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S2O8-) que se añade en forma de persulfato amónico. En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectro enfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean riboflavina y TEMED. b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel. c) La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) yTEMED (iniciador). d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bisacrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use. e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. Habitualmente los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño. f) En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes: 1) una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es el sodio dodecil sulfato o SDS, un detergente.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR 2) una electroforesis nativa es la que somete a las proteínas a migración sin desnaturalización. En esta situación las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. Además se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre proteínas, separándose los complejos. Los sistemas tampón (buffer) empleados en estos caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando sistemas de uno o más tampones, en estos casos se habla de sistemas tampón continuos o discontinuos. En los sistemas discontínuos el primer tampón asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocándose la acumulación de todas las que se han cargado en el pocillo. La separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón. En el esquema se muestran secuencialmente la situación en (a) al principio de la electroforesis, (b) durante el proceso de apilamiento ('stacking') y (c) durante la separación en el gel resolutivo. El primer gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel que es el que realmente separa las proteínas. Este sistema es especialmente adecuado para analizar muestras diluidas sin perder resolución.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Existen numerosos dispositivos en el mercado para hacer electroforesis en geles de acrilamida. En la imagen se muestra un ejemplo de sistema comercial de la empresa BioRad ampliamente utilizado.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR SDS-PAGE Es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. Su nombre significa la electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS ('SDSpolyacrilamide gel electrophoresis'). Fue descrito por Laemmli (Laemmli (1970), Nature, 277, p. 680). Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la proteína con cargas netas negativas), y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas. En general se emplean sistemas de dos tampones (discontinuos). Este sistema permite la separación de volúmenes relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking'). El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en el hecho de que los iones glicinato, relativamente cargados negativamente (en el depósito de tampón superior) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínasSDS que a su vez tienen menor movilidad que los iones Cl - de los tampones de carga en el gel de apilamiento ('stacking'). Cuando se conecta la diferencia de potencial todas las especies han de migrar a la misma velocidad para mantener el circuito eléctrico. Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl - si hay una región de 'field strenght'. 'Field strenght' es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración, El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl -] > [proteínaSDS] > [glicinato]. Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS las tres se concentran en una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato. Cuando el glicinato alcanza el borde del gel de separación adquiere una mayor carga en el nuevo medio, con un pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el glicinato y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad. El SDS es un detergente de acción desnaturalizante que se une a las cadenas polipeptídicas desnaturalizadas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, uniéndose aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Esta unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas acomplejadas con SDS viajen hacia el ánodo. La separación de los complejos SDS-proteína es proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

La figura ilustra diferentes formas de detectar proteínas.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR La grafica ilustra la relación lineal entre la distancia recorrida por la proteína en el gel y el logaritmo de su peso molecular. Resultados PREPARACIÓN DEL GEL Preparar la mezcla del gel de separación (sin el SDS) en un quitasato y desgasear durante 15 mins. Mientras, preparar el molde para cada gel y la solución de PSA. Una vez desgaseada la mezcla añadir el SDS correspondiente y mezclar con cuidado de no provocar burbujas. Marcar en el molde la altura del gel de separación: 2 cm desde el borde superior del cristal pequeño. Agregar PSA, mezclar, y a continuación añadir TEMED. Mezclar de nuevo y verter en el molde hasta un poco por encima de la marca. El resto de la mezcla ponerla en un tubillo eppendorf como testigo de la polimerización. Dejar polimerizar al menos 1 hora. Si el gel se va a correr el día siguiente, colocar una capa de overlay buffer y dejar en cámara fría tapado con papel de aluminio. Una vez polimerizado el gel de separación, lavar la superficie del gel con agua destilada y secar las paredes. Preparar la mezcla de stacking sin SDS en un kitasato y desgasearla 15 mins. Añadir el SDS correspondiente, PSA y TEMED (en este orden y mezclando cada vez). Verter en el molde hasta el tope y colocar el peine. Preparación de las muestras: Mezclar con el buffer de carga SB 2x (1:1) y hervir a 95º durante al menos 5 mins, junto con el estándar. Mientras, quitar el peine del gel con mucho cuidado y lavar los pocillos con buffer de electroforesis con el fin de eliminar las partículas no polimerizadas. Sacar el molde del portamoldes verde y adosarlo al porta electrodos (éste se ha untado con gel de sellado a lo largo de la gomilla verde), con el cristal pequeño hacia dentro. Colocarlo a su vez en el mortamoldes de electroforesis y todo junto dentro de

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR la cubeta. Marcar los geles como A y B. Llenar los compartimentos interior (125 ml) e inferior (200 ml) con b uffer de electroforesis (garrafa) y cargar las muestras con la punta blanca larga. Colocar la tapa portaelectrodos y correr la electroforesis a 200 v (constante) 35 mins. INMUNOTRANSFERENCIA Mientras corre la electroforesis se preparan los componentes del sándwich: Se sumergen en solución Transfer 6 trozos de papel de filtro grueso del tamaño del gel que se va a transferir, así como un trozo de papel de nitrocelulosa del mismo tamaño. Sacar el portamolde con el gel del aparato de electroforesis, separar los dos cristales con la espátula verde, generalmente el gel quedará adosado al cristal grande. Mientras, hacer el sándwich de transferencia en la cubeta correspondiente: colocar tres trozos de papel de filtro. Después de eliminar el stacking del gel, colocar encima el papel de nitrocelulosa y marcar en éste el primer pocillo cortando el borde. Dar la vuelta al cristal del molde y separar con cuidado el gel tirando desde un extremo. Colocar la membrana con el gel sobre los trozos de papel de filtro y encima del gel los otros dos trozos. Una vez concluida la transferencia, marcar las membranas. REVELADO DEL GEL Teñir el gel durante 1 h con sc de trabajo de coomassie en agitación. Descartar esta solución y añadir sc. desteñidora en agitación. Cambiarla con frecuencia hasta que el gel no tenga fondo azul. Esta solución se puede reciclar pasándola por carbono activo. Poner el gel en sc. Preservadora 10 mins con agitación y conservarlo en agua. INMUNOBLOTTING Incubar el papel de nitrocelulosa con solución de bloqueo durante 20-30 min con agitación. Diluir el primer anticuerpo en solución de bloqueo. Añadir al papel de nitrocelulosa e incubar toda la noche en un agitador de placas.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Lavar 3 veces 10 min cada vez con solución de lavado. Diluir el segundo anticuerpo y añadirlo a la membrana. Incubar de 4 a 6 horas. Lavar 3 veces 10 min cada vez con solución de lavado. Añadir solución de inmuno fijación hasta el desarrollo de las bandas. Parar la reacción con agua. Uso y Aplicación con gel de agarosa La electroforesis en gel es un método que separa (basado en el tamaño, carga eléctrica y otras propiedades físicas) macromoléculas tales como ácidos nucleídos y proteínas. El término electroforesis es usado para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Por tanto a lo que se refiere la electroforesis en gel es la técnica en la cual las moléculas son forzadas a través del gel ubicado en un espacio entre dos límites (extremos), motivado por una corriente eléctrica. En cada uno de los extremos del gel hay electrodos activados que suministran la fuerza de atracción. Por tanto unas propiedades de la molécula especialmente la posesión de grupo ionizables, determina como rápidamente un campo eléctrico puede mover la molécula a través de un medio gelatinoso. Una aplicación muy importante para la electroforesis en gel es en la tecnología del ADN. La electroforesis en gel es una de las más importantes herramientas en biología molecular y es de valor crítico en muchos aspectos de la manipulación y estudio genético. Un uso es la identificación de moléculas ADN particulares por los patrones de banda que ellos producen en la electroforesis en gel después se der cortado con varias enzimas de restricción. ADN viral, plasmídico y segmentos particulares de ADN cromosomal puede ser identificados por esta técnica. Otro uso es la separación y purificación de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los cuales pueden ser recuperados del gel con actividad biológica completa. La electroforesis en gel hace posible determinar la diferencia genética y la relación evolutiva entre especies y plantas y animales. Usando esta tecnología es posible separara e identificar las proteínas que difieren en por lo menos en un solo aminoácido.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Detección de ADN a través de electroforesis en gel Principio La electroforesis se refiere al movimiento de moléculas cargadas bajo un campo eléctrico. Usando geles de agarosa o poliacrilamida se lleva a cabo la electroforesis. Los geles de agarosa son más porosos (100-300nm) que los de acrilamida. Sin embargo, el tamaño del poro depende de la concentración de agarosa. Por tanto, la agarosa es usada para separar macromoléculas de tamaño grande como el ADN y ARN. La concentración del gel de agarosa depende del tamaño del ADN, y las moléculas del plásmido. Entre más grande sea el peso molecular del ADN, ARN o plásmido se requiere menos concentración de gel de agarosa. Las moléculas de ADN y ARN están cargadas negativamente y se mueve hacia el ánodo (con carga positiva) cuando un campo eléctrico es aplicado. Este movimiento depende del tamaño, es decir el peso molecular de los ácidos nucleídos. De manera similar, diferentes tipos de plásmidos son también separados por este método. Un colorante llamado bromuro de etidio es usado para detectar el ADN. Este se intercala con el ADN. Por tanto, la localización del ADN puede ser detectada y visualizada cuando estas producen fluorescencia cuando se ponen bajo la luz ultravioleta. Requerimientos para realizar la detección del ADN por electroforesis en gel de agarosa (i) Secuencia de DNA (ii) Gel de agarosa, ácido bórico, Tris1, EDTA o ácido etilendiaminotetraacético , sacarosa, agua destilada, bromuro de etidio, glicerol (iii) Azul de bromofenol, tubo Eppendorf (tubo pequño de base cónica para micentrífuda de aproximadamente 1.5 ml de capacidad empleado para almacenar pequeñas cantidades de líquido), micropipeta, horno microondas, agitador magnético. (iv) Aparato electroforético con fuente de energía. (v) Buffer [los dos buffer comúnmente usados son Tris-borato-EDTA (TBE) y Trisacetato-EDTA (TAE)]. Su preparación se muestra a continuación:

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Preparación del buffer para la detección de ADN por electroforesis en gel de agarosa 5X TBE titulación 1 con pH 8.0 se usa: 27.5g de ácido bórico, 54g de Tris y 20ml de EDTA 0.5M. 5X TAE titulación 1 con pH 8.0 se usa: base Tris (24.2g), acido glacial (5.7ml) y 10ml de EDTA 0.5M. EDTA (0.5M, pH 8.0, 100ml). Solución de bromuro de etidio (disolver 10mg/ml en agua, envolver con papel aluminio y almacenar a 4°C). Mientras usa el bromuro de etidio usar guantes ya que es mutagénico. 6X gel-bromuro con carga IX (90.15% de azul de bromofenol, 0.15% de cianol, 30% (v/v) de glicerol en agua). De manera alternativa preparar colorante de 10X (66mg de sacarosa, 4.2mg de azul de bromofenol y 1ml de búfer). Procedimiento (i) Disolver 0.8g de agarosa en 100 ml de TRE IX con calentamiento suave sobre un agitador magnético en un plato caliente (o microondas). Esto dará un gel de agarosa del 0.8%. (ii) Enfriar el contenido anterior hasta 60°C y adicionar bromuro de etidio hasta obtener una concentración final de 0.5 μg/ml, mezclando apropiadamente. (iii) Usar una cinta que tape o cubra ambos lados de la bandeja que mantendrá el gel. (iv) Inserte el aparato similar a un peine de tal manera que haga un espacio entre el diente y la superficie de la bandeja de 1mm. (v) Obtener un espesor del gel de 4-5mm, agregar la solución de agarosa en la bandeja. Cuidar de no generar burbujas en el gel. Mantenerlo por 30-40 minutos. (vi) Remover suavemente el peine cuando el gel se ha solidificado. Remover las cintas y mantener la bandeja en el tanque de electroforesis. (vii) Agregar TRE en las muestra de ADN en las ranuras del gel sumergido. Las muestras debe ponerse en el fondo de la ranura. (viii) Conectar la línea eléctrica de tal manera que el terminal negativo debe estar en el extremo donde la muestra se ha cargado. (ix) Iniciar la electroforesis a 60-100v hasta que el azul de bromofenol migre hasta el otro extremo del gel. (x) Apagar y desconectar las líneas eléctricas. Retirar el gel de agarosa del tanque de electroforesis. (xi) Observar este en un transiluminador ultravioleta. La secuencia de ADN separado como bandas son fluorescentes bajo la luz UV, el cual hace que se compruebe su presencia (detección).

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Resultado Mientras inicia la secuenciación del ADN en la agarosa, las bandas deben aparecer diferentes sin mancha. Al final del gel una notable contaminación de ARN es visualizado si el ADN no es tratado con RNasa o con tratamiento incompleto, el RNA se mueve más rápido que el ADN ya que tiene un tamaño pequeño. 1 Es el nombre abreviado del componente orgánico conocido como tris(hidroximetil) aminometano, de fórmula (HOCH2)3CNH2 utilizado en bioquímica ampliamente como un componente de soluciones buffer.

Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis en gel de agarosa es un método usado en bioquímica y biología molecular para separar molecular ADN, o ARN basado en el tamaño sin embargo las proteínas pueden también ser separadas en geles de agarosa. La separación de las moléculas es lograda por el movimiento de las moléculas de ácido nucleído cargadas negativamente a través de una matriz de agarosa en un campo eléctrico. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido y migran una distancia más larga que las moléculas más grandes. Aplicaciones de la electroforesis en gel de agarosa La electroforesis en gel de agarosa es principalmente usada en el análisis o separación de moléculas de ADN y ARN (aunque las proteínas pueden también ser separadas en

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR geles de agarosa), sin embargo la separación también permite la purificación de tamaños específicos de ADNs después de la digestión de la enzima de restricción. Esta es usualmente usada en clonación para obtener plásmidos cortado, en los cuales la electroforesis en gel de agarosa separa los vectores cortados de los no cortados. Por tanto los geles de agarosa permiten:

1. La separación de la enzima de restricción que digiere el ADN incluyendo la secuencia de ADN, antes de la transferencia al método de hibridación Souther. Este es también frecuentemente usado para separar ARN antes transferirlo a la hibridación Nothern. 2. Análisis de productos de PCR después de la reacción en cadena de polimerada para evaluar la amplificación del ADN objetivo. 3. Permitir la estimación del tamaño de las moléculas de ADN usando un marcador de ADN o “ladder” (que contiene varios fragmentos de ADN de diferentes bandas), el cual contiene los fragmente de ADN de varios tamaños conocidos. 4. Permite la estimación robusta de la cantidad de ADN y su calidad. 5. La cantidad de ADN es estimada usando un “ladder” lambda que contiene cantidad específicas de ADN de diferentes bandas. 6. La calidad del ADN es estimado por observación de la ausencia de rayas o fragmentos (o contaminación con bandas de ADN). 7. Otras técnicas depende de la electroforesis en gel de agarosa para la separación de ADN incluye la detección de características distintivas o “fingerprinting” de ADN. Ventajas y desventajas de la electroforesis en gel de agarosa Las ventajas son que el gel es fácilmente vertido, no desnaturalizas las muestras y las muestras pueden ser también recuperadas. Por otra parte, las desventajas son que los geles puede fundirse durante la electroforesis, el buffer puede agotarse, y diferentes formas de material genético pueden tratarse cuando su forma no es predecible. Migración en gel de agarosa El factor más importante es la longitud de la molécula de ADN, entre más pequeñas sean las moléculas viajan más distancia. Pero la conformación de la molécula de ADB

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR es también un factor importante. Para evitar este problema las moléculas lineales son usualmente separadas, tales como los fragmentos de ADN a partir de digestión por restricción, productos PCR a partir de ADN lineal, o ARNs. El aumento de la concentración de agarosa de un gel reduce la velocidad de migración y permite la separación de las moléculas de ADN más pequeñas. Entre más alto sea el voltaje, más rápido migra el ADN. Pero el voltaje es limitado por el hecho de que este calienta y al final puede causar que el gel de funda. Los altos voltajes también disminuyen la resolución (por encima de aproximadamente 5 a 8 V/cm). La conformación de un ADN de plásmido que no ha sido cortado con una enzima de restricción se moverá con diferentes velocidades (de la más lenta a la más rápida): ADN plasmídico cortado en partes o con muescas, circular abierto, linealizado, o superenrollado. Resolución de los límites de los geles de agarosa Los geles de agarosa puede ser usado para la separación de fragmentaos de ADN oscilando desde 50 pares de bases a varias megabases (millones de bases) por electroforesis. Sin embargo, más comúnmente la electroforesis en gel de agarosa es usada para separar ADN de PCR y clonación en el rango e 100bp a aproximadamente 15kb. Tiempo de operación son cerca de 30 minutos - 1 hora de tiempo. Los ADNs o ARNs pequeños (más pequeños que 100bp) son separación mejor por geles de poliacrilamida, sin embargo los geles de agarosa entre 2-3% puede ser adecuados para separadas aun los fragmente de 50bp a partir de ácidos nucleicos mucho más grandes. Recientemente sin embargo, se ha demostrado que hasta una diferencia de un par de base podría ser resuelta en un gel de agarosa al 3% con un medio con conductividad extremadamente bajo tales como 1mM de borato de litio (Brody, Calhoun, Gallmejer, Creavalle, Kern, 2004 citado por Ahmed, 2009). La electroforesis en gel de agarosa de ultra-rápida-alta-resolución de ADN y ARN usa un medio con conductividad de baja molaridad. Porcentaje de gel de agarosa y rango de eficiencia de separación Los geles de agarosa son mejores para la separación de moléculas grande de ADN, mientras que los altos porcentajes de los geles son mejores para los ADN pequeños. Purificación de ADN con extracción con gel de agarosa La electroforesis en gel de agarosa permite la separación y por tanto la purificación de ADN para clonación. Sin embargo, este por general requiere agarosa fundida de alta pureza si el DN es para ser extraído partir del gel.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Buffers usados en la electroforesis en gel de agarosa Dependiendo del tamaño y la aplicación del ADN a someterse a electroforesis, diferentes buffers puede ser usado para electroforesis en gel de agarosa. El buffer TAE (o Tris Acetato EDTA) es el más común usado en electroforesis en gel de agarosa. TAE tiene la capacidad buffer más baja de los buffer existentes, sin embargo TAE ofrece la mejor resolución para ADN más grandes. Sin embargo, TAE requiere un voltaje más bajo y más tiempo. No obstante, el buffer TAE (Tris/Borato/EDTA) es frecuentemente usado para los fragmentos de ADN pequeños (con menos de 500bp). El borato de sodio o buffer SB es un nuevo buffer, sin embargo este es ineficiente para resolver fragmentos más grandes a 5kb. El buffer SB tiene ventajas en su baja conductividad, permitiendo voltajes más altos (de hasta 35V/cm). Esto podría permitir un tiempo de análisis más corto para la rutina de electroforesis.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Electroforesis bidimensional (2D). El término “Proteoma” fue usado por primera vez por Wilkins et al. (1996) para describir el conjunto de proteínas que se expresan a partir de un genoma en un momento dado. El Proteoma es un elemento altamente dinámico, cuyos componentes varían en un organismo, tejido, célula o compartimento subcelular, como consecuencia de cambios en su entorno, situaciones de estrés, administración de drogas, señales bioquímicas o su estado fisiológico o patológico. La “Proteómica” se ha definido como la ciencia o conjunto de tecnologías que estudian el proteoma. La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico. La Separación de Proteínas mediante 2D PAGE pasa por las siguientes etapas: Preparación de la muestra: Es el paso más crítico y clave en el éxito del experimento. En él se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y agentes reductores. Los agentes caotrópicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro. Separación en la 1ª Dimensión (Isoelectroenfoque):

En primer lugar las proteínas se separan en base a su punto isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs).

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Equipo de Isoelectroenfoque: Protean IEF cell (BioRad)

Separación en la 2ª Dimensión (SDS-PAGE): Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedades eléctricas, pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS). Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”).

Equipo de Electroforesis Bidimensional: Mini Protean System (BioRad)

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Equipo de Electroforesis Bidimensional: Protean Plus Dodeca Cell (BioRad)

Tinción: Para visualizar las proteínas en el gel, éstas deben ser teñidas de alguna manera. La elección del método de tinción viene determinada por diferentes factores, como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de adquisición de imagen disponible. Los métodos más usados son la tinción con Coomassie Blue, la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la tinción con Plata, aunque esta última no es del todo compatible con el análisis posterior de las proteínas por espectrometría de masas.

Gel Bidimensional: Tinción Coomassie Blue

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Adquisición y Análisis de Imagen: La habilidad para adquirir datos en formato digital es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un práctico medio para recoger información sobre un proteoma. Antes de que los geles donde hemos separado las proteínas puedan ser analizados con un sistema de evaluación de imágenes, éstos deben ser digitalizados. Los instrumentos de adquisición de imágenes más comúnmente usados son los densitómetros (GS800) y los escáneres de fluorescencia (FX ProPlus). Todos ellos funcionan con softwares de análisis diseñados para detectar y cuantificar “spots” en las imágenes digitales así como para comparar y analizar estadísticamente los geles de interés. El software de análisis usado en el Servicio es el PDQuest de BioRad. Se ofrece la opción de usar el software Decyder de GE para análisis de imágenes DIGE.

Escáner de Fluorescencia: FX ProPlus (BioRad)

Densitómetro : GS-800 (BioRad)

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR

Software de análisis PDQuest (Bio Rad)

Software de análisis DeCyder v6.5, GH Healtcare (GE)

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Cromatografías de columna Introducción: Las cromatografías son un grupo de técnicas de separación selectiva de moléculas, en las que los componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados. Existen varios tipos de cromatografías, según los criterios que se usan para hacer los análisis, pero todas consisten de una fase estacionaria y una móvil. En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A. Existen muchos tipos de cromatografía de columna. En el laboratorio de hoy veremos tres tipos de ellas. Filtración en gel: En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de igual o menor tamaño que el poro entra a las esferas mientras que las moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas de tamaño intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras,podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las moléculas más grandes salen inmediatamente después. El material que se escoja para la fase estacionaria dependerá del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamaño. En nuestro caso usaremos Sephadex G-75, que separa moléculas entre 3,000 y 70,000 daltons. Moleculas mayores de 70,000 no estrarán a los poros de las esferas.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Intercambio iónico: Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende. La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catiónico) o positiva (intercambio aniónico). El tipo de empaque dependerá de qué queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la carga de la columna. En nuestro caso usaremos una mezcla de dos proteínas en una columna de intercambio catiónico y la eluiremos en un solo paso, con 1M KCl. Fase inversa: Esta es una cromatografía de interacción en la que la fase estacionaria, con moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra. La matriz conciste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerán a las moléculas hidrofóbicas de la muestra mientras que las hidrofílicas salen con el amortiguador. Las moléculas son eluídas de la columna lavando con soluciones de distinta concentración de alcohol o cualquier otro solvente no polar.Nosotros usaremos unos cartuchos con C18 e isopropanol como solvente de elución. Materiales: Columna con sephadex G-75 Muestra, 300 μl 75 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0) Vasos de precipitado Tubos de ensayo Soporte

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Pipetas de transferencia Columna con carboximetil celulosa (CM) 30 ml loading buffer (0.05 M imidazol pH 6.0) 15 ml elution buffer (0.05 M imidazol pH 6.0, 1M KCl) Fracción 2 del primer experimento Tubos y soportes Cartucho Sep-Pac C-18 Jeringa de 3 cc 50 ml de agua 15 ml isopropanol al 8% 15 ml isopropanol al 35% 3 ml de refresco de uva sin gas Vasos Clinistix Procedimiento: Filtración en gel 1. Colocar la columna en forma vertical en el soporte. Colocar un vaso o un matraz debajo. Abra la columna y quite el tapón. 2. Echar 1 ml loading buffer a la columna y dejarla gotear hasta que casi no quede buffer en la superficie del gel. 3.

Echar sobre la columna 300 μl de la muestra.

4.

Deje que la muestra penetre el empaque, hasta que la columna deje de gotear.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR 5. Añada 0.5 ml de loading buffer a la columna tratando de no perturbar la superficie y deje gotear. Continúe echando buffer hasta que la primera banda de color esté a punto de salir. 6.

Coloque el primer tubo para recolectar la primera fracción coloreada.

7. colocar de nuevo el vaso para recoger el buffer lasta que la siguiente fracción coloreada esté por salir. 8. Continúe eluyendo las fracciones hasta obtener tres fracciones de distintos colores. 9.

Cuando termine, lave la columna, echando tres volúmenes de loading buffer.

10. Sin que seque la columna tápela colocando el tapón inferior y la tapa superior. 11. Remuévala del estante y guarde. Intercambio iónico. Esta columna gotea mucho más rápido que la de gel. Debe trabajar rápido y con todo a la mano**** 1. Colocar la columna de CM-celulosa en el soporte, colocar el vaso bajo la columna y abrirla. 2.

Déjela gotear hasta que casi no quede buffer sobre el empaque.

3. Añada la fracción 2 que guardó de la primera parte del lab y deje que penetre el empaque. 4. Lave dos veces con 0.5 ml de loading buffer, colocando el primer tubo de ensayo para recolectar la primera banda de color. 5. Una vez colecte la muestra, coloque el vaso bajo la columna y lave con loading buffer hasta que salga incoloro. 6. Coloque el segundo tubo y eche 10 gotas de elution buffer. Se supone que el color que se veía en la columna comienze a bajar. 7.

Siga añadiendo elution buffer hasta que remueva todo el color de la columna.

8.

Cuando termine lave la columna 5 veces con loading buffer.

Gerardo Cuenca Nevárez

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS BIOLOGÍA MOLECULAR Fase inversa 1.

Marque cuatro vasos o tubos como W, 1.2 y 3.

2.

Abra una jeringa y llene con isopropanol al 35%.

3. Conecte la jeringa al cartucho de C18 e inyecte el alcohol a través de la columna hacia el vaso con W. 4. Equilibre la columna inyectando 3 volúmenes de agua. Lave y use la misma jeringa para esto. 5. Inyecte 2 ml de refresco de uva colectando las gotas en el tubo 1. Debe salir claro. 6. Eluya el colorante rojo inyectando tres volúmenes de isopropanol al 8%. Recoja las gotas en el tubo #2. Si sigue viéndose color rosado en la columna añada más alcohol. 7. Eluya el colorante azul con tres volúmenes de isopropanol al 35%. Recoja las gotas en el tubo 3. Continúe eluyendo hasta que no se vea más azul en la columna. 8.

Coloque un clinistix en las fracciones 1 a 3 para determinar presencia de azúcar.

Bibliografía 

Dabrio, M. V., Blanch, G. P., & Matas, M. G. (1999). Cromatografía y electroforesis en columna. Springer-Verlag Ibérica.



Facio, M. L., Madalena, L., Fraind, S., Alejandre, M., Bresciani, P., & Pizzolato, M. (2013). Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico. Acta bioquímica clínica latinoamericana, 47(1), 37-46.



Pérez, H. M. G. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. Universo Diagnóstico, 1(2), 31-4.



Rompf, R., & Kahl, G. (1997). mRNA differential display in agarose gels. BioTechniques, 23(1), 28-32.

Gerardo Cuenca Nevárez