Electroforesis.pptx

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA GENOMICA

BIOLOGIA MOLECULAR GRUPO 2-2 DRA. ELIAKYM ÁRAMBULA MERAZ. ELABORADO POR:

CERVANTES OSUNA ANA ROCIO, CUEVAS GAMBOA DANIEL HUMBERTO, MEDINA ORTIZ DANIEL ALONSO Y ROJO SOLORZANO MANUEL.

ELECTROFORESIS Migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico. La mayoría de las biomoléculas poseen carga eléctrica. Ácidos Proteínas: Nucleicos: carga + o – carga – Separación por tamaño.

En la electroforesis los Ac. Nucleicos migraran siempre hacia el polo positivo. (ánodo +)

Tipos de electroforesis

Electroforesis de frente móvil

Electroforesis Zonal

Electroforesis Continua

El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones. En donde están presentes las moléculas (Arne Tiselius 1937).

El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante y la muestra se deposita en una zona reducida del mismo.

La muestra se aplica también en una zona, pero se añade continuamente a lo largo del proceso.

Determinación de movilidades y puntos isoeléctricos

Analizar mezclas, determinar pureza, cambios de movilidad o conformación y purificación.

Separación de proteínas, péptidos, Aa, iones inorgánicos.

• Cámara de electroforesis: dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Este campo se genera dentro de una solución amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras. La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.

Agarosa

Gel:

• ADN y Proteínas

Acrilamida • Solo Proteínas

Compuesto por polímeros que forman una especie de malla o microporos tridimensionales a través de los cuales avanzan las moléculas, según el peso molecular, lo que permite la separación por tamaño de los diferentes componentes de la muestra.

La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente en temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifica cuando se enfría formando un gel altamente poroso.

El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta.

A. No es un componente toxico. B. Permite realizar análisis de Ac. Nucleicos con pesos moleculares variados. (según las concentración que se emplee). C. Poder de resolución menor que la Poliacrilamida

La agarosa es un polvo que para disolverse requiere calentarse hasta la ebullición del solvente.

Una vez obtenido el líquido de agarosa, antes de que se enfrié a menos de 50°C se coloca en una cámara para formar el gel.

El gel se coloca de manera que los pocillos queden en el extremo donde se localiza en polo negativo de la cámara de electroforesis, para permitir que la muestra corra a lo largo del gel.

Los ácidos nucleicos lineales con un peso molecular alto migran al ánodo más lentamente que los de menor peso molecular. La migración no sólo depende del peso molecular sino también del grado de empaquetamiento que presenten. La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.

La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. • NEUROTOXINA • Soporta mayores voltajes

• Teñir y desteñir • Siempre se realiza en cámaras verticales

- El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. - El tamaño de poro de un gel de acrilamida está determinado por la concentración total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida), que generalmente se maneja en .

- Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta, con el resultado de que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. La formación del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo que se consigue con la bisacrilamida). - La bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la acrilamida y establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, con lo que se evita su deslizamiento y conduce a la formación del gel. - También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hidrólisis.

Migración:

• El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. • Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. • En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento.

El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2.

El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.

El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3.

• El TAE es mejor para el análisis electroforético de fragmentos grandes de ADN (900 – 2000bp) ya que corren más rápido y tiene mayor capacidad de discriminación en un gel de agarosa a 0.8%. Mientras que en TBE para fragmentos pequeños de ADN (100 – 500bp) corren más rápido y tiene mayor capacidad de discriminación en gel de agarosa al 2%. Capacidad tamponante:

• El TBE es más estable y tiene una capacidad tampón más alta que el TAE. Reciclaje: • El TAE no aguanta más de 3 corridas de electroforesis seguidas sin alterar sus propiedades, mientras que el TBE dura 3 o 4 días independientemente de las corridas de electroforesis realizadas. Recuperación del ADN: • El TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa, lo que provoca una recuperación baja del ADN.

Moléculas de ADN o proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis. Para ADN Fagos o plásmidos sometidos a corte con enzimas de restricción que generan fragmentos de tamaño. (Fago Phi X174/Hae III) Escaleras (moléculas sintéticas de ADN) ej.1 Kbase plus ladder

Para Proteínas Proteinas de peso conocido (10 hasta los 300 kDa) teñidas o coloreadas

Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear el corrimiento de la muestra en el gel.

Buffer de carga

Se emplea en relación1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra.

Proteínas

Ac. Nucleicos

En el caso de que se deseen condiciones desnaturalizantes y reductoras, deberá añadirse betamercaptoetanol a este buffer y habrá que calentar las muestras a 95°C por 5 minutos

Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de bromofenol

Contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol

TRASLUMINADOR VIOLETA El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla. En general emiten energía a una longitud de onda a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365 nm; y suelen contar con un botón para baja/alta intensidades por si se requiere una menor exposición de la muestra a la luz ultravioleta. Algunos también permiten la selección de entre dos longitudes de onda, lo que los hace más flexibles. Los epitransiluminadores (365, 480 nm) generan la emisión visible por fluorescencia igual que el transiluminador pero, a diferencia de éste, la fuente de energía se encuentra reflejada y no pasa a través de la muestra. El epi-iluminador es efectivo en geles muy densos.

Electroforesis horizontal

Electroforesis Vertical

• Se lleva a cabo en gel de agarosa para Ac. Nucleicos • El buffer debe cubrir el gel para evitar que se seque por el calentamiento inducido por el paso de la corriente eléctrica • Al momento de cargar las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en seco • Electroforesis submarina, la totalidad del gel se cubre con buffer de corrimiento

• Exclusivamente con gel de poliacrilamida • Proteínas o Ac. Nucleicos con bajo tamaño • El gel debe estar contenido entre dos placas rectangulares de vidrio donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo.

En esta técnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y se llama submarina cuando la muestra se coloca con el gel sumergido en el buffer. La muestra se coloca después de haber vertido el buffer de corrimiento y retirado el peine que sirve de molde para la formación de los pocillos.

En esta cámara se aprecia cómo el gel de acrilamida ha quedado embebido en buffer de corrimiento en su extremo superior gracias a la colocación de amortiguador en la parte interna de la cámara. El buffer de la parte externa permite que el polo positivo cuente con la misma solución buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.

Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.

Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.

Cargar las muestras en el gel

Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente

Visualizar los ácidos nucleicos

Electroforesis de ADN • El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentración de 0.5 a 2%. • La movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas. • El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento. • Si los fragmentos de ADN son pequeños (menos de 50 pb) o bien se requiere discernir entre fragmentos de ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolución. • Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la preparación de geles a elevadas concentraciones y se aconseja para obtener una buena separación de moléculas de ADN con < 1000 pb. • Son ideales para preparar geles analíticos de productos procedentes de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb.

Estandarizar la concentración de agarosa mas adecuada.

Marcador de peso molecular en, por lo menos, uno de los carriles.

Transmisión de la corriente eléctrica. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb), voltajes entre 75 y 100 V. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (> 2 kb) valores 25 y 75 V

El volumen de agarosa depende del tamaño de la cámara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para las dimensiones más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5 cm (L × A × A)

Las muestras se mezclan con el buffer de carga y se depositan cuidadosamente en los pocillos, evitando que se salgan y puedan entrar en otros pozos contaminando el pocillo contiguo.

Estandarizar el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución posible.

Inmediatamente después de vaciar la agarosa a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios.

Una vez solidificado el gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a concentración 1×, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm por encima del gel) y se retiran los peines.

La electroforesis se detiene cuando se considera que la muestra se localiza en la posición deseada, o bien cuando la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes del gel.

Bromuro de etidio: • Colorante fluorescente que tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. • AGENTE MUTAGENICO. TERATOGENICO Y CANCERIGENO. • Se incorpora a la agarosa (0.5 mg/ml) antes de permitir la solidificación, o puede incorporarse luego del corrimiento. • Fluorece de color naranja cuando se expone a la luz ultravioleta (absorción de 254 nm, con longitud de emisión de 366 nm). SYBR® Safe • Se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos. • Fluorescencia a 280, una excitación máxima a 502 nm y una emisión máxima a 530 nm. • Se une con gran afinidad al surco menor del ADN bicatenario • 25 veces más fluorescente que el bromuro de etidio.

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis) permite la separación de moléculas de ADN de tamaño muy elevado. Las principales diferencias con la electroforesis convencional se encuentran en la preparación de las muestras, el equipo de electroforesis y la elección de los parámetros (tiempo de pulsos, voltaje, etc.) en función del rango de tamaños que se pretende separar. Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un sistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron separar cromosomas de levadura de varios cientos de kpb

Parámetros que afectan: Tiempo de pulsos Intensidad de campo (voltaje) Tiempo total de electroforesis Concentración de agarosa Ángulo de separación de los campos eléctricos alternantes. Temperatura.

La acrilamida se prepara a partir de una solución al 30% de acrilamida-bisacrilamida 19:1

Ésta se mezcla con el buffer correspondiente y una solución de SDS

Se añade persulfato de amonio APS), tetrametiletilenodiamina (TEMED) como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a 10 mM

El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento dentro de la cámara vertical de electroforesis

Asegurar que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.

La muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con cuidado en los pocillos, evitando la contaminación del pocillo contiguo

Marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la muestra

Se conectan los cables correspondientes de los electrodos a la fuente de energía, con la selección de voltaje o amperaje adecuados

La electroforesis se realiza hasta que el colorante, visualizado como una línea azul, haya llegado a los límites de la parte inferior del gel

Azul brillante de Coomasie: • puede detectar bandas de proteína de 50 ng

• El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínas sobre grupos de ácido sulfónico, que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica

Tinción de plata. • Mas sensible

Algunas veces, el gel se seca para conservarlo.

Analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción (mapa de restricción),

Comparar los tamaños de distintos tipos de ADN

Aislar y recuperar fragmentos de ADN purificados para clonaciones

Analizar productos de PCR

Proceso previo a las técnicas de hibridación (Southern blot o Northern blot)

Identificación de fracciones proteicas o proteínas particulares por tamaño.

Identificación de moléculas particulares empleando posteriormente una reacción antígenoanticuerpo específica en la técnica de Western blot.

Es crucial en técnicas como la secuenciación.

Determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos

ACTIVIDAD Basándose en la imagen de una electroforesis de agarosa para fragmentos de ADN representada en la imagen, indique: 1. De qué peso molecular es la banda de menor tamaño del carril C. 2. 2. De qué peso molecular es la banda de mayor tamaño del carril D. 3. En qué carril y qué peso molecular presenta la banda que tiene mayor concentración. 4. En qué carril y qué peso tiene la banda de menor concentración. 5. En qué carril se localiza el marcador de peso molecular. 6. El sentido de corrimiento de las muestras