El Microscopio Estereoscópico.docx

El microscopio estereoscópico El microscopio estereoscópico es un tipo de microscopio óptico que permite observar la muestra generando una imagen en tres dimensiones. Esta es su característica principal que lo distingue del resto de microscopios donde la muestra siempre es observada en dos dimensiones.

Microcopio estereoscópico En los microscopios binoculares convencionales la muestra es siempre observada a través de un solo objetivo. Esto implica que la imagen que llega a los dos ojos es exactamente la misma y, por lo tanto, no puede generarse una visión tridimensional. Los microscopios estereoscópicos, en cambio, observan la muestra a través de dos lentes distintas. Esto permite que la imagen que llega a cada ojo sea ligeramente distinta. La combinación de estas dos imágenes mediante nuestros ojos produce el efecto tridimensional. Los microscopios estereoscópicos son en general microscopios de luz reflejada. Es decir, un foco ilumina la muestra y la luz reflejada por la muestra es observada a través de los objetivos y oculares. De este modo se pueden observar muestras sin necesidad de laminarlas como en el caso de los microscopios de luz transmitida, donde la luz atraviesa la muestra antes de llegar al objetivo. Este es el motivo por el cual generalmente los microscopios estereoscópicos tampoco tienen ni condensador ni diafragma.

Este tipo de microscopio es por lo tanto adecuado para observar de forma aumentada todo tipo de objetos sin necesidad de llevar a cabo un proceso de preparado de la muestra. Esto los hace muy útiles en todo tipo de campos y aplicaciones incluyendo el control de calidad de materiales, la construcción de microcircuitos, el montaje de relojes o procedimientos de microcirugía. En general, los microscopios estereoscópicos son muy utilizados en campos donde debe manipularse la muestra mientras se observa. Los microscopios estereoscópicos destacan por su versatilidad. Son un gran instrumento para todas aquellas personas que se inician en el mundo de la microscopía ya que no requieren ningún tipo de preparación de la muestra.

Aumento del microscopio estereoscópico El aumento que puede alcanzar un microscopio estereoscópico es siempre menor que el que se consigue con los microscopios ópticos convencionales. Esto es debido a las aberraciones ópticas introducidas en este tipo de microscopios. Los microscopios estereoscópicos más habituales tienen objetivos de 2 o 4 aumentos, combinados con lentes oculares de entre 5 y 20 aumentos. En consecuencia, el aumento total está comprendido entre 10 y 80 aumentos. Es verdad que existen microscopios estereoscópicos que pueden proporcionar un aumento de hasta 300x. Sin embargo, esto es poco habitual ya que tampoco existen muchas aplicaciones para las cuales sea necesario este poder de aumento en un microscopio estereoscópico.

Tabla de aumentos habituales de un microscopio estereoscópico

Tipos de microscopio estereoscópico

Según la tecnología utilizada en este tipo de microscopio puede distinguirse entre dos tipos de familias: el microscopio Greenough y el microscopio de objetivo principal común. En el microscopio estereoscópico Greenough los dos objetivos tienen una cierta inclinación entre ellos, normalmente de entre 10 y 12 grados. Esto es suficiente para crear dos imágenes ligeramente distintas que proporcionan el efecto tridimensional. Este diseño fue desarrollado por el americano Horatio S. Greenough y fue el primer tipo de microscopio estereoscópico que funcionó correctamente. Actualmente es el más usado para tareas cotidianas, su diseño robusto requiere de poco mantenimiento y suelen ser más económicos que los microscopios estereoscópicos de objetivo principal común. En el microscopio estereoscópico de objetivo principal común la imagen es observada con un objetivo de gran tamaño. El haz de luz proveniente de la parte izquierda del objetivo es dirigido hacia un ocular mientras que el haz correspondiente a la parte derecha es dirigido hacia el otro ocular. De este modo, las dos imágenes observadas en cada ocular no son las mismas y es posible generar el efecto tridimensional. Este tipo de microscopio estereoscópico suele ser utilizado para aplicaciones complejas que requieren sistemas adicionales de iluminación o accesorios ópticos avanzados.

Esquema de los dos tipos de microscopio estereoscópico

Historia del microscopio estereoscópico

El primer instrumento parecido a un microscopio estereoscópico del que se tiene conocimiento fue construido por el fraile capuchino Chérubin d’Orléans en 1671. Este microscopio observaba la muestra con dos objetivos distintos pero la imagen obtenida mostraba los relieves de la muestra de forma invertida (esto se conoce como imagen pseudoscópica). No fue hasta dos siglos más tarde que Charles Wheatstone escribió un tratado describiendo las bases teóricas para construir un microscopio estereoscópico. Poco después, a mitades del siglo XIX Francis Herbert Wenham consiguió construir el primer microscopio estereoscópico utilizando un prisma para dividir el haz de luz proveniente de un solo objetivo. A pesar del sistema de prismas en este microscopio, la imagen obtenida carecía de la calidad suficiente para competir con los microscopios monoculares del momento. Estos primeros microscopios estereoscópicos eran conocidos como microscopios de disección. Su desarrollo tardío es consecuencia de que en sus inicios no había una necesidad clara para este tipo de instrumentos. Muchas de las aplicaciones en las que se utiliza actualmente el microscopio estereoscópico han sido campos desarrollados durante el siglo XX (cirugía, producción de circuitos y procesos industriales de alta precisión). El primer microscopio estereoescópico plenamente funcional fue diseñado por Horatio S. Greenough a finales del siglo XIX. Greenough presentó su diseño a la empresa alemana fabricante de microscopios Carl Zeiss. Esta empresa introdujo algunas mejoras en el diseño presentado por Greenough y decidió comercializar el nuevo microscopio. Más tarde, nuevos tipos de microscopios estereoscópicos fueron desarrollados pero el diseño inicial de Greenough sigue siendo utilizados actualmente por todos los fabricantes de microscopios estereoscópicos.

Microscopio estereoscópico Olympus SZIII En 1957, la American Optical Company introdujo el microscopio estereoscópico de objetivo principal común (conocido por sus siglas en inglés CMO: Common Main Objective). Este microscopio está basado en un diseño modular que le permite añadir accesorios ópticos resultando así en una mayor versatilidad que el diseño Greenough. Este nuevo concepto fue también adoptado por todos los fabricantes de microscopios estereoscópicos. Actualmente la mayoría de fabricantes construyen microscopios estereoscópicos con los dos principios. La decisión entre uno u otro depende sobretodo de la aplicación para la que vayan a ser utilizados y del presupuesto ya que los microscopios de objetivo principal común suelen ser más caros debido a su mayor complejidad.

Diferencia entre el microscopio estereoscópico y el microscopio binocular Ocurre a menudo que se utilizan indistintamente los términos estereoscópico y binocular. Esto es en general un error ya que estereoscópico y binocular no son necesariamente sinónimos. Para evitar confusiones, es importante conocer las similitudes y diferencias entre un microscopio estereoscópico y un microscopio binocular. La principal diferencia es que en un microscopio estereoscópico la muestra es observada en tres dimensiones mientras que en el microscopio binocular la imagen observada es bidimensional. Esto es así porque en el microscopio estereoscópico las imágenes que llegan a cada uno de los dos oculares son ligeramente distintas mientras que en el microscopio binocular la imagen es exactamente la misma en los dos oculares. La confusión existe porque los microscopios estereoscópicos tienen siempre dos oculares y, por lo tanto, no es incorrecto decir que un microscopio estereoscópico es binocular. Sin embargo, la afirmación inversa es falsa ya que un microscopio binocular no es necesariamente estereoscópico.

PHmetro Un pHmetro o medidor de pH es un instrumento científico que mide la actividad del ion hidrógeno en soluciones acuosas, indicando su grado de acidez o alcalinidad expresada como pH. El medidor de pH mide la diferencia de potencial eléctrico entre un electrodo de pH y un electrodo de referencia. Esta diferencia de potencial eléctrico se relaciona con la acidez o el pH de la solución. El medidor de pH se utiliza en muchas aplicaciones que van desde la experimentación de laboratorio hasta control de calidad.

Espectrofotómetro El espectrofotómetro es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometríapara medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra.

ESPECTROFOTÓMETRO

Con el espectrofotometro, la cantidad de una sustancia química conocida (concentraciones) también puede determinarse midiendo la intensidad de la luz detectada. Dependiendo del rango de longitud de onda de la fuente de luz, se puede clasificar en dos tipos diferentes:  Espectrofotómetro UV-Vis: utiliza luz en el rango ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) de espectro de radiación electromagnética.  Espectrofotómetro de infrarrojos: utiliza luz en el espectro de infrarrojos (700 – 15,000 nm) del espectro de radiación electromagnética. La estructura básica de los espectrofotómetros consiste en una fuente de luz, un colimador, un monocromador, un selector de longitud de onda, una cubeta para la solución muestra, un detector fotoeléctrico y una pantalla digital o un medidor.

PARTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

El espectrofotómetro, en general, consta de dos dispositivos; un espectrómetro y un fotómetro. Un espectrómetro es un dispositivo que produce, dispersa y mide la luz. Un fotómetro tiene un detector fotoeléctrico que mide la intensidad de la luz.  o

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Espectrómetro: Produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero un colimador (lente) transmite un haz recto de luz (fotones) que pasa a través de un monocromador (prisma) para dividirlo en varias componentes de longitudes de onda (espectro). Entonces un selector de longitud de onda (ranura) transmite sólo las longitudes de onda deseadas. Fotómetro: Después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a través de la solución muestra en la cubeta, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que se absorbe y luego envía una señal a un galvanómetro o una pantalla digital.

Colorímetro El colorímetro es un aparato que permite realizar esa labor, pues este tiene como objetivo ayudarnos a identificar los colores y sus matices, con los cuales podemos conseguir las medidas exactas o el valor numérico de los colores, además el colorímetro nos permite recoger mediciones de colores para hacer comparaciones con otras medidas recogidas. Pos su parte, la colorimetría es la ciencia que estudia los colores para tener una escala de valores numéricos.

COLORÍMETRO Las sustancias químicas absorben diferentes frecuencias de luz, por lo que el colorímetro basa sus funciones en la ley de absorción comúnmente conocida como ¨Lambert-Beer¨ esta teoría indica que la absorbancia de una sustancia es ajustable a su concentración y por eso las sustancias más concentradas reflejan una lectura de absorbancia elevada.

¿Cómo funciona el colorímetro?

El colorímetro usa filtros (tres filtros de color rojo, verde y azul) para elegir el color de luz que mas absorberá el soluto, para asegurar la exactitud de la lectura, el color de luz absorbida es lo opuesto al color de la muestra. Los sensores miden la cantidad de luz que traspasó la solución y compara la cantidad que entró y el resultado de la cantidad absorbida. Luego se pasa a realizar una serie de soluciones de concentración conocidas de las sustancias químicas en análisis y se mide la absorbancia para cada concentración. La medición del color en forma de tres variable, L, a y b.

El microscopio electrónico

Microscopio electrónico en la universidad de Regensburg (Fuente: High Contrast, Licencia: CC-BY-3.0-DE) El microscopio electrónico es un instrumento de gran utilidad en la investigación científica gracias a su gran poder de aumento. Mediante este tipo de microscopio es posible aumentar imágenes de muestras hasta niveles muy superiores a los del microscopio óptico. Para entender cómo funciona un microscopio electrónico es necesario definir algunos conceptos físicos. Uno de estos conceptos es la longitud de onda. Dada una onda periódica, la longitud de onda es la distancia entre dos ciclos consecutivos. En el caso de la luz visible, cada onda de un determinado color tiene una longitud de onda específica. Este concepto es importante en el campo de la

microscopía óptica porque está relacionado con el máximo aumento que puede alcanzarse. El máximo aumento de un microscopio es proporcional a la longitud de onda del medio con el que se observa. A menores longitudes de onda, mayor resolución puede obtenerse. Por este motivo, el máximo aumento que se puede obtener con un microscopio óptico difícilmente supera los 1500 aumentos.

El principio de funcionamiento de un microscopio electrónico se basa en utilizar electrones en lugar de luz visible. La longitud de onda con la que se mueve un electrón es inversamente proporcional a su velocidad. Esto significa que si los electrones son acelerados a altas velocidades pueden obtenerse longitudes de onda muy cortas. Un microscopio electrónico utiliza esta idea para observar las muestras. A un nivel muy básico consiste en una fuente de electrones que son acelerados a gran velocidad. Estos electrones impactan con la muestra de modo equivalente a como la luz podría iluminarla. Algunos de estos electrones son reflejados por la muestra y otros la atraviesan. Mediante la detección estos electrones es posible reconstruir una imagen de la muestra. Los microscopios ópticos pueden clasificarse entre microscopios de luz transmitida y microscopios de luz reflejada. De un modo similar, dependiendo de la técnica utilizada en los microscopios electrónicos, puede distinguirse entre microscopios electrónicos de transmisión y microscopios electrónicos de barrido. A continuación presentamos los elementos principales de este tipo de microscopio. También presentamos brevemente la historia de este invento y una explicación en detalle de los distintos tipos de microscopio electrónico.

Partes del microscopio electrónico Las partes principales de un microscopio electrónico incluyen aquellos elementos utilizados para generar electrones y dirigirlos hacia la muestra. Esto incluye:

Fuente de electrones Es equivalente a la fuente de luz en un microscopio óptico. En este caso es necesario disponer de un emisor de electrones. En general se utiliza un filamento de tungsteno. Este filamento es calentado de modo que la energía de sus átomos y electrones aumenta. A partir de un cierto nivel energético los electrones poseen suficiente energía para escapar de sus átomos. Estos electrones libres son a continuación dirigidos hacia la muestra.

Lentes electromagnéticas

Los microscopios ópticos utilizan lentes convergentes y divergentes para desviar los rayos de luz y aumentar así la imagen de la muestra. Este mismo procedimiento no puede ser aplicado para desviar la trayectoria de los electrones. En lugar de utilizar lentes de vidrio, los microscopios electrónicos utilizan lentes electromagnéticas. Estas lentes generan campos eléctricos y magnéticos de modo que su interacción con los electrones hace que sus trayectorias diverjan o converjan en un punto.

Cámara de vacío El procedimiento expuesto anteriormente debe llevarse a cabo dentro de una cámara de vacío. De lo contrario, los electrones interactuarían con las moléculas del aire y no sería posible determinar sus trayectorias adecuadamente. La muestra que se observa debe colocarse también dentro de la cámara de vacío. Este es uno de los motivos por el cual no es posible observar muestras vivas con un microscopio electrónico.

Detector (Pantalla fluorescente) Una vez los electrones han impactado contra la muestra es necesario medir algún tipo de información para poder reconstruir la imagen de la muestra. Una opción consiste en utilizar una pantalla fluorescente. Esta pantalla reacciona de modo distinto según cual sea el número de electrones que impactan en ella. De este modo es posible detectar las zonas donde impactan más o menos electrones y deducir así la imagen de la muestra. Existen alternativas a las pantallas fluorescentes, por ejemplo, sensores CCD. A continuación, la información capturada por la pantalla fluorescente es transmitida a un ordenador que puede asignar colores artificiales a la imagen obtenida. En los microscopios ópticos estos componentes no son necesarios porque la luz proveniente de la muestra es directamente observada con el ojo humano. Dado que nuestros ojos no están preparados para detectar electrones debemos incorporar este elemento detector en un microscopio electrónico.

Partes del microscopio electrónico

Tipos de microscopios electrónicos Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos. Los microscopios electrónicos de transmisión y los microscopios electrónicos de barrido. A continuación presentamos sus detalles:

Microscopio electrónico de transmisión (MET) La principal característica del microscopio electrónico de transmisión es que se utilizan los electrones que atraviesan la muestra. En primer lugar los electrones son conducidos hacia la muestra mediante las lentes electromagnéticas. Cuando los electrones impactan contra la muestra, algunos de ellos consiguen atravesarla y otros son dispersados. Los electrones que pueden pasar al otro lado de la muestra son capturados por un detector dando lugar así a una imagen. La cantidad de electrones que atraviesa la muestra sin desviarse varía en función de las características internas de la muestra. Dicho de otro modo, hay partes de la muestra que presentan más transparencia a los electrones que otras. Esto da lugar a zonas más oscuras (menos electrones atraviesan la muestra y llegan al detector) y zonas más claras (más electrones atraviesan la muestra y llegan al detector).

Para utilizar esta técnica es necesario preparar la muestra para que sea muy delgada (espesor inferior a 2000 ángstroms). De lo contrario, demasiado espesor impide que los electrones puedan atravesarla.

Leucocito (Glóbulo blanco) observado con un microscopio electrónico de transmisión Esta técnica de microscopía es muy útil para visualizar los detalles internos de una muestra, por ejemplo, estructuras cristalinas. A nivel conceptual esta técnica es similar a realizar una radiografía de la muestra. La principal limitación que tiene esta técnica es que no permite extraer información de la superficie de la muestra. Es decir, no permite observar detalles como la forma o rugosidad de la muestra que se observa. Para observar este tipo de características es necesario utilizar la microscopía electrónica de barrido. Video explicativo del microscopio electrónico de transmisión: (Subtítulos disponibles en español) / Autor: Jubobroff / Licencia: CC-BY-SA 4.0

Microscopio electrónico de barrido (MEB) En el microscopio electrónico de barrido también es necesario que los electrones impacten contra la muestra. En este caso, los electrones no iluminan toda la muestra simultáneamente sino que se hace un escaneado recorriendo los distintos puntos de la muestra. Cuando los electrones impactan con la muestra estos pierden parte de su energía debido a distintas interacciones. Parte de su energía inicial se transforma en calor o en emisiones de rayos X. Además, se produce también la emisión de electrones que se desprenden de la superficie de la muestra. Estos electrones se conocen como electrones secundarios. El principio de funcionamiento de los microscopios electrónicos de barrido se basa en medir alguna de estas propiedades para extraer información de la muestra

observada. Generalmente, esto consiste en medir la cantidad de electrones secundarios que emite la superficie cuando es bombardeada con electrones.

Grano de polen observado con un microscopio electrónico de barrido Esta técnica de microscopía es muy útil para observar los detalles de la superficie de microorganismos. Es habitual realizar una preparación de la muestra depositando primero una capa de metal sobre la muestra. De esta forma, existen más electrones secundarios que pueden desprenderse cuando se aplica el haz principal de electrones. Este proceso de preparación es en general más sencillo que el que se debe realizar para la microscopía electrónica de transmisión. El aumento que alcanzan este tipo de microscopios es menor que el que se puede obtener con un microscopio electrónico de transmisión. Sin embargo, la información tridimensional que proporciona esta técnica lo convierte en un instrumento muy útil para determinados tipos de muestras. Video explicativo del microscopio electrónico de barrido: (Subtítulos disponibles en español) / Autor: Jubobroff / Licencia: CC-BY-SA 4.0

Historia del microscopio electrónico El microscopio electrónico es un invento del siglo XX que fue posible gracias a los avances en el campo de la física de las partículas. Uno de los avances importantes fue el descubrimiento de la naturaleza ondulatoria del electrón por parte de LouisVictor de Broglie. Esto le valió el premio Nobel en 1929. Los ingenieros alemanes Ernst Ruska y Max Knoll se dieron cuenta de que estos conocimientos justificaban la viabilidad del microscopio electrónico. En seguida se pusieron a construir el primer prototipo con la intención de alcanzar aumentos a un nivel sin precedentes. En 1931 presentaron su primer prototipo funcional. Esto demostró que era posible construir un microscopio electrónico. No obstante, el aumento obtenido con este primer prototipo estaba lejos del que se podía obtener

con un microscopio convencional. Mientras que un microscopio óptico puede alcanzar aumentos cerca de 1500x, este primer prototipo solo alcanzaba los 400x. Los resultados fueron, sin embargo, muy prometedores y solo dos años más tarde fueron capaces de construir un microscopio electrónico con mayor aumento que el de un microscopio óptico. En 1938 Siemens empezó a comercializar el primer microscopio electrónico. Los microscopios electrónicos construidos por Ernst Ruska eran microscopios electrónicos de transmisión. Esto significa que los electrones atraviesan la muestra y a continuación impactan contra un detector que reconstruye la imagen. Este principio es el mismo que se utiliza en los microscopios electrónicos de transmisión actuales, llegando a alcanzar aumentos de 2000000x. A finales de los años treinta, Manfred von Ardenne empezó a desarrollar un nuevo tipo de microscopio electrónico: el microscopio electrónico de barrido. En este microscopio los electrones no atraviesan la muestra sino que son parcialmente reflejados. Con los procedimientos adecuados resulta posible también reconstruir la imagen de la muestra. El microscopio electrónico resultó ser de gran utilidad una vez alcanzó la madurez tecnológica. Ernst Ruska recibió en 1989 el premio Nobel de física por sus aportaciones en este campo. En el año 2010 el centro de investigación Jülich de Alemania empezó a construir el microscopio electrónico más potente del mundo. Su construcción costó 15 millones de euros y duró dos años. Este microscopio, conocido con el nombre PICO, puede alcanzar una resolución de 50 picómetros.

Resumen   

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El microscopio electrónico es un tipo de microscopio con una capacidad de aumento muy superior a la del microscopio óptico. Su principio de funcionamiento se basa en utilizar electrones en lugar de luz para obtener una imagen de la muestra. Las partes principales del microscopio electrónico son: una fuente de electrones, un conjunto de lentes electromagnéticas, una cámara de vacío y una pantalla fluorescente. Adicionalmente es necesario un ordenador para operar el microscopio y procesar las imágenes obtenidas. Los dos principales tipos de microscopio electrónico son el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido. El microscopio electrónico de transmisión es utilizado para observar las estructuras internas de una muestra. En cierto modo, es similar a hacer una radiografía de la muestra con un gran aumento. El microscopio electrónico de barrido se utiliza para visualizar la forma tridimensional o topografía de una muestra.