Ekstraksi Dan Analisis Terpen.docx

Ekstraksi dan Analisis Terpen / Terpenoid Abstrak: Terpen / terpenoid merupakan salah satu kelas terbesar dari produk alami, ini disebabkan oleh keanekaragaman kimia yang luar biasa yang dapat timbul dari transformasi biokimia dari unit starter prenyl diphosphate yang relatif sederhana. Semua terpena / terpenoid terdiri dari tulang punggung hidrokarbon yang dihasilkan dari berbagai prenil difosfat panjang (rantai polimer unit prenil). Setelah ionisasi (penghilangan) dari gugus difosfat, intermediet karbokation alilik yang tersisa dapat dibujuk ke kaskade kimia kompleks yang mengarah ke beragam tulang punggung hidrokarbon linier dan siklisasi, yang kemudian dapat dimodifikasi lebih lanjut dengan berbagai gugus fungsi (misalnya alkohol, keton, dll) dan penambahan substituen (misalnya gula, asam lemak). Karena keanekaragaman kimia ini, terpene / terpenoid memiliki kegunaan industri yang besar sebagai rasa, wewangian, pelumas bermutu tinggi, biofuel, bahan kimia pertanian dan obat-obatan. Protokol yang disajikan di sini fokus pada ekstraksi terpen / terpenoid dari berbagai sumber tanaman dan telah dibagi menjadi metode ekstraksi untuk terpen / terpenoid dengan berbagai tingkat dekorasi bahan kimia, dari hidrokarbon yang relatif kecil, nonpolar, mudah menguap hingga molekul yang besar secara substansial dengan fisik yang lebih besar kompleksitas karena modifikasi kimianya. Kata kunci: Terpene, terpenoid, isoprenoid, hidrokarbon, kelompok substituen, volatil, polaritas PENGANTAR Terpen dan isoprenoid secara umum telah mengumpulkan banyak perhatian karena peran fisiologis penting mereka (yaitu hormon, jangkar membran alifatik, mempertahankan struktur membran), peran ekologis (yaitu senyawa pertahanan, penarik serangga / hewan) (Kempinski et al., 2015), dan penggunaannya yang luas dalam aplikasi farmasi dan industri mulai dari rasa dan wewangian (Schwab et al., 2008) hingga obat-obatan (Dewick, 2009; Niehaus et al., 2011; Shelar 2011). Biosintesis semua isoprenoid dimulai dari dua prekursor universal lima karbon (C5): isopentenyl diphosphate (IPP) dan dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Unit-unit prenil awal ini dapat digunakan secara langsung untuk membentuk hemiterpen atau dipolimerisasi dalam penambahan lima unit karbon melalui penambahan IPP berturut-turut untuk menghasilkan prenil difosfat dengan panjang rantai yang berbeda-beda. Prenil difosfat ini adalah prekursor universal untuk semua terpena utama yang ditemukan pada tanaman, seperti monoterpen (terdiri dari 10 atom karbon, C10), sesquiterpen (C15), diterpen (C20), triterpen (C30), karotenoid (C40) dan poliprenol (> 45) (Gambar 1). Demi diskusi ini, masing-masing kelas terpena dapat dibedakan lebih lanjut berdasarkan protokol yang diperlukan untuk mengekstraksi dan mengukur berbagai bentuk: 1) ionisasi prekursor prenil mengarah ke perancah hidrokarbon linier dan siklik (lihat senyawa yang disorot dengan warna hijau di Gambar 1 yang sebagian besar akan jatuh di bawah protokol 1); 2) Dekorasi primer dapat mencakup penambahan gugus metil atau hidroksil yang menghasilkan sebagian besar senyawa non-polar (highlight merah pada Gambar 1, senyawa yang tunduk pada protokol 2); dan 3) modifikasi lebih lanjut termasuk asilasi, aroylasi, glikosilasi dan kelompok substituen lainnya dapat mengubah sifat fisik terpenoid yang dihasilkan secara dramatis, sehingga mengharuskan penggunaan protokol ekstraksi lainnya (lihat senyawa yang disorot dengan warna biru pada Gambar 1, yang kemungkinan besar memerlukan protokol) 2 dan 3 untuk ekstraksi dan pengukurannya). Susunan tak terbatas bentuk perancah dan modifikasi telah menjadikan ekstraksi dan pengukuran terpene / terpenoid sebagai salah satu bidang analisis kimia yang paling menantang dan bermanfaat selama lebih dari 300 tahun dan fondasi lebih dari 20 hadiah Nobel (dimulai dengan Otto Wallach pada tahun 1910 dan Leopold Ruzicka pada tahun 1939), yang menjanjikan untuk dikembangkan, tidak tertahan, di masa depan. Gambar 1 Penggambaran skematis metabolisme terpene yang menekankan biosintesis berbagai kelas senyawa dan sifat fisiknya (volatilitas dan polaritas). DMAPP dan IPP adalah blok bangunan dasar yang digunakan untuk menghasilkan prekursor allylic diphosphate khusus untuk setiap kelas terpene: GPP untuk monoterpen; FPP untuk sesquiterpen dan triterpen; dan GGPP untuk diterpen dan tetraterpen. Ionisasi prekursor terfosforilasi 1

menghasilkan bentuk hidrokarbon linier, sedangkan reaksi ionisasi / siklisasi yang dikatalisasi oleh sintase / siklase menghasilkan serangkaian hidrokarbon siklisasi yang sangat kaya. Perancah hidrokarbon linier dan siklik ini umumnya nonpolar atau mono-hidroksilasi, dan volatilitasnya berkorelasi dengan massa molekulnya. Semakin kecil senyawa, semakin volatile mereka. Tetapi semua perancah terpene ini juga tunduk pada lapisan modifikasi tambahan termasuk hidroksilasi, glikosilasi, asilasi, dan aroilasi, yang mengubah ukuran fisik dan sifat molekul terpene, dan dapat meningkatkan polaritasnya. Gambar ini juga diberi kode warna mengacu pada protokol yang dibahas di sini yang mungkin paling efisien untuk ekstraksi, kuantisasi, dan identifikasi struktural molekul terpene individu. Protokol 1 dirancang untuk sebagian besar senyawa nonpolar dan disorot dalam warna hijau; Protokol 2 adalah untuk molekul-molekul yang memiliki sifat lebih polar (merah); dan terpena yang memiliki polaritas terbesar mungkin paling baik diekstraksi, dikuantifikasi, dan dikualifikasikan oleh Protokol 3 (biru).

Karena rentang luar biasa dari struktur yang dapat terdiri dari terpene, metode pemurniannya akan berbedabeda, tergantung pada sifat kimia dari target atau diduga terpene, sifat fisik dan jumlah bahan tanaman awal, dan ketersediaan alat dan reagen. Karena ekstraksi optimal terpene tertentu akan tergantung pada sifat-sifatnya, dalam unit ini kami akan fokus pada beberapa metode standar untuk ekstraksi terpene dari jaringan tanaman di mana senyawa dapat hadir dalam jumlah nanogram sesedikit, menggunakan teknik yang akan cocok untuk sebagian besar laboratorium. Secara umum, metode ini meliputi langkah-langkah berikut: 1) memecah sel tanaman untuk melepaskan konstituen kimianya; 2) mengekstraksi sampel menggunakan pelarut yang sesuai (atau melalui distilasi atau perangkap senyawa); 3) memisahkan terpene yang diinginkan dari kandungan ekstrak yang tidak diinginkan lainnya yang mengacaukan analisis dan kuantifikasi; dan 4) menggunakan metode analisis yang sesuai (mis. kromatografi lapis tipis [KLT], kromatografi gas [GC], atau kromatografi cair [LC]). Biasanya, tiga langkah terakhir akan bervariasi tergantung pada polaritas dan ukuran target terpenoid. Protokol Dasar 1 akan menjelaskan metode yang dapat digunakan untuk ekstraksi terpene non-polar yang paling utama. Protokol Dasar 2 akan fokus pada metode lain yang berlaku untuk terpenoid dengan polaritas rendah (tetapi lebih tinggi daripada hidrokarbon murni), dan Protokol Dasar 3 akan menjelaskan metode yang cocok untuk terpenoid yang lebih polar. Penting untuk menekankan bahwa kombinasi protokol dasar ini dapat digunakan untuk mengoptimalkan ekstraksi terpenoid yang diinginkan, dan bahwa mencampur dan mencocokkan langkah-langkah spesifik dari masing-masing protokol mungkin diperlukan dan akibatnya mungkin memerlukan validasi empiris. PROTOKOL DASAR 1 EKSTRAKSI DAN ANALISA PERSETUJUAN NON-POLAR Sebagian besar primer (terpena linier dan terpene siklis tanpa dekorasi) secara eksklusif terdiri dari hidrokarbon, sehingga molekul-molekul ini sangat non-polar. Terpena dengan 15 karbon atau kurang mungkin mudah menguap karena ukurannya yang kecil dan polaritas rendah yang memungkinkan emisi ke atmosfer. Metode ekstraksi dan analitik untuk terpena yang mudah menguap akan dibahas dalam protokol alternatif 1. terpene yang tidak mudah menguap dapat diekstraksi menggunakan pelarut organik yang sangat nonpolar seperti heksana. Menggunakan silika sebagai fase diam dalam kromatografi adalah alat lain yang sempurna untuk memisahkan terpena ini dari senyawa lain dalam ekstrak. Biasanya, terpena dengan lebih banyak karbon akan terelusi lebih lambat daripada senyawa dengan berat molekul lebih rendah, tetapi terpene yang didaur ulang dapat terelusi lebih cepat daripada terpene yang tidak disikluskan dengan nomor karbon yang sama karena ukurannya yang lebih kompak. Dalam protokol ini, kami akan menjelaskan cara mengekstrak molekul hidrokarbon linier, squalene, dari tanaman. Senyawa ini memiliki 30 karbon, dan merupakan prekursor linier untuk semua triterpen, termasuk sterol tetracylic dan saponin pentasiklik.

2

Materi Bahan tanaman (mis., Daun tembakau) Hexane Etil asetat 85:15 (v / v) heksana: etil asetat (-) - α-cedrene (Sigma-Aldrich, kucing no. 22133) Hexadecane (Sigma-Aldrich, kucing. No. 442679) Silica gel, ukuran pori 60 ˚, 230-400 mesh (Sigma-Aldrich, cat. No. 227196) Skala dengan akurasi ± 0,1 mg Nitrogen cair Botol kaca dengan tutup bersegel PTFE (Kimble-Chase, cat. No. 60940A24) Lesung dan alu Pipet Kaca Pasteur (Fisherbrand, cat. No. 13-678-20A) Pipa serologis gelas Benang halus dari kaca Nitrogen berbentuk gas GC-MS, mis., Agilent 6890a GC dilengkapi dengan kolom HP5-MS (30-m × 0,250-mm × 0,25-μm) yang digabungkan ke Detektor Spektrum Massa Agilent 5975C atau Detektor Ionisasi Api (FID) HPLC, mis., Waters 2695 dilengkapi dengan kolom Nomura Chemical Develosil 60-3 250 × 20-mm dan detektor array fotodioda Waters 2696 Siapkan ekstrak kasar menggunakan pelarut organik 1. Ukur antara 100 mg dan 1 g bahan tanaman. Jumlah bahan tanaman yang Anda butuhkan tergantung pada tujuan ekstraksi Anda. Tingkat squalene pada tanaman tembakau jenis liar biasanya antara 0,5 μg / g Berat segar (FW) hingga 10 μg / g FW. Dengan demikian, setidaknya 50 mg bahan daun tembakau harus digunakan untuk deteksi hilir yang sesuai. 2. Menggiling bahan tanaman menjadi bubuk dalam nitrogen cair dalam botol gelas menggunakan alu teh atau menggunakan mortar dan alu. Memutar pestisida di sekitar tepi bagian dalam botol kaca harus menyebabkan bahan beku pecah dan jatuh ke bawah, di mana ia akan lebih lanjut ditumbuk oleh ujung alu. Atau, giling jaringan beku dengan mortar dan alu dan pindahkan jaringan bubuk (bubuk) ke botol kaca. Pastikan sampel berada dalam wadah kaca sebelum menambahkan pelarut, karena wadah plastik akan melepaskan komponen ke pelarut organik, yang dapat mengacaukan analisis analitis dan merusak kolom dan peralatan GC dan HPLC. 3. Segera setelah menggiling bahan tanaman, tambahkan 1 ml 85:15 (v / v) heksana: etil asetat (pelarut ekstraksi) per 50 mg bahan tanaman, pindahkan ekstrak kasar ke botol gelas atau tumbuk, dan kocok pada suhu kamar selama 3 hingga 4 jam atau semalam. Rasio heksana: etil asetat dapat diubah tergantung pada polaritas terpene yang dicari. Biasanya proporsi heksana yang lebih tinggi akan mengekstraksi lebih banyak terpena non-polar, sedangkan proporsi etil asetat yang lebih tinggi akan mengekstraksi lebih banyak terpena polar.

3

Sertakan standar internal (mis., Α-cedrene atau hexadecane) dalam pelarut ekstraksi untuk membantu kuantifikasi dan perhitungan pemulihan. Idealnya, standar internal akan memiliki komposisi kimia yang mirip dengan target terpene. Jumlah standar internal yang digunakan akan tergantung pada konsentrasi akhir yang diinginkan. Secara umum, untuk analisis GC, konsentrasi akhir 50 ng / μl sesuai. Jadi, jika volume akhirnya adalah 100 μl, tambahkan 5 μl dari standar 1μg / μl. Untuk mengekstrak dan mengukur terpene dari sejumlah kecil jaringan 4a. Konsentrasikan ekstrak heksana menjadi 500 μl di bawah aliran gas nitrogen yang lembut tanpa mengeringkan sampel. 5a. Siapkan kolom silika dengan menancapkan pipet Pasteur kaca dengan wol kaca dan melapisi wol kaca dengan gel silika 500 mg (lihat Gambar 2). Muat sampel terkonsentrasi ke kolom silika kecil, dan biarkan sampel menyerap ke dalam kolom. 6a. Tambahkan 1 hingga 3 ml heksana, dan kumpulkan kolom eluat. Untuk menentukan jumlah pelarut yang dibutuhkan untuk berhasil mengelusi senyawa Anda, tambahkan heksana ke kolom dalam penambahan 1-ml, kumpulkan setiap fraksi 1-ml dalam botol terpisah. Setiap fraksi dapat dianalisis dengan GC (lihat langkah 9a). Fraksi terakhir yang mengandung senyawa menunjukkan volume pelarut yang diperlukan untuk mengelusi senyawa sepenuhnya dari kolom. Gambar 2 kolom kromatografi silika disiapkan untuk mengisolasi terpena dan terpenoid dalam skala kecil (kolom kiri, ng ke jumlah μg) dan skala besar (kolom kanan, jumlah μg ke mg). Kolom-kolomnya dihubungkan dengan wol kaca, dan dapat dilapisi dengan sejumlah kecil natrium sulfat (Na2SO4) untuk menyerap air yang terkontaminasi yang akan mengacaukan pemisahan kromatografi. Squalene dan senyawa polar lainnya dapat dielusi lebih cepat dengan 85:15 (v / v) heksana: etil asetat daripada dengan heksana. Ini memiliki keuntungan menghemat pelarut, tetapi ia juga dapat mengeliminasi senyawa lain yang tidak diinginkan. 7a. Evaporasi sampel hingga benar-benar kering di bawah aliran nitrogen gas. Residu atau film yang tersisa di bagian dalam vial diharapkan dan akan berbeda tergantung pada jenis jaringan. 8a. Tangguhkan dalam 100 hingga 200 μl heksana. 9a. Transfer suspensi ke botol yang sesuai dan lakukan analisis GC. Jika menggunakan pengaturan GC yang dijelaskan dalam daftar bahan, sampel dapat dianalisis menggunakan suhu injektor 250 ° C dengan suhu oven 150 ° C selama 1:00 menit, kemudian 10 ° C / menit hingga 280 ° C diikuti oleh 5 ° C / menit hingga 310 ° C dan ditahan selama 1 menit (memastikan penghapusan semua bahan yang disuntikkan ke kolom); 0,9 ml / mnt Tingkat aliran. Jika GC digabungkan ke detektor MS, spektra dapat dideteksi dalam mode ionisasi positif, 70 eV, pemindaian 50 hingga 500 m / z. Jika GC digabungkan ke Flame Ionization Detector (FID), maka seseorang harus menjalankan standar terverifikasi untuk mengetahui waktu retensi squalene yang tepat. Jika terpene mudah menguap, maka semua langkah konsentrasi dan pengeringan harus dilakukan di bawah aliran gas nitrogen yang sangat lembut dengan botol sampel berada di dalam es. Juga, langkah kromatografi skala kecil menggunakan pipet kaca Pasteur dengan sejumlah kecil silika — mungkin tidak cukup untuk 4

memisahkan dan memurnikan semua senyawa dalam campuran, dan eluat akan mengandung campuran senyawa. Namun, langkah kromatografi ini dapat mengecualikan pigmen (molekul ukuran besar) dan konstituen kimia lainnya, yang dapat mengotori dan mengurangi kinerja port injektor atau jarum suntik injektor peralatan analitik. Untuk mengekstrak dan mengukur terpene dari sejumlah besar jaringan 4b. Konsentrasikan ekstrak ke volume sekecil mungkin (0,5 hingga 1 ml), tetapi pertahankan volume yang cukup agar semua komponen kimia dalam ekstrak tetap larut (termasuk beberapa serpihan daun atau jaringan) dan dapat dengan mudah dimuat ke dalam kolom di kolom berikutnya langkah. 5b. Siapkan kolom silika dengan menancapkan pipet serologis gelas dengan wol kaca dan menapis wol kaca dengan 500 mg silika gel (lihat Gambar 2). Muatkan volume pelarut ke dalam kolom yang sama dengan setidaknya dua volume silika. Pastikan silika sepenuhnya jenuh dengan pelarut (mis., Heksana). Sangat mudah untuk mengisi setengah kolom dengan silika, sehingga jumlah pelarut yang sama dapat ditambahkan ke atas tanpa perlu mengukur setiap waktu. 6b. Muat ekstrak terkonsentrasi ke bagian atas kolom, dan biarkan ekstrak masuk sepenuhnya ke dalam kolom. Mengkonsentrasikan ekstrak ke volume sekecil mungkin memastikan bahwa sampel akan memasuki kolom sebagai pita yang tajam dan akan mencegah penyebaran senyawa pada fraksi yang lebih banyak dari yang diperlukan. 7b. Tambahkan volume heksana yang sama dengan volume silika (volume setengah kolom dalam pengaturan yang disarankan di atas), dan biarkan masuk ke kolom. Ulangi beberapa kali (mis., Elusi squalene membutuhkan sekitar 10 volume heksana). Jangan tambahkan heksana sampai semua ekstrak telah sepenuhnya memasuki kolom, atau heksana yang dimasukkan akan mengencerkan sampel pekat. Berapa lama seluruh elusi akan tergantung pada afinitas molekul target terpene dengan gel silika. Biasanya molekul yang kurang polar dan lebih kecil akan membutuhkan waktu lebih sedikit untuk mengelusi. Misalnya, squalene mungkin memerlukan beberapa volume kolom untuk dielusi sepenuhnya. Yang terbaik adalah memeriksa secara empiris menggunakan standar yang telah dimurnikan jika memungkinkan. Jika suatu standar tidak dapat diperoleh, suatu senyawa dengan komposisi kimia yang sama dapat menggantikan sebagai titik awal. 8b. Untuk setiap volume kolom heksana yang ditambahkan, kumpulkan seluruh eluat atau fraksi berukuran sama di botol kaca bersih, dengan hati-hati melacak fraksi atau urutan eluat. CATATAN: Gunakan botol koleksi / cairan yang menampung dua kali volume koleksi yang diharapkan. 9b. Transfer alikuot 100 hingga 200 μl dari setiap fraksi ke dalam botol GC, dan analisis sampel menggunakan GC yang digabungkan dengan detektor MS atau FID (lihat langkah 9a) untuk menentukan fraksi mana yang mengandung squalene. Pada langkah ini, jika tanaman memiliki konsentrasi terpene yang relatif tinggi yang diinginkan, Kromatografi Lapis Tipis, TLC (lihat Protokol Dasar 2) dapat digunakan untuk secara langsung mengidentifikasi fraksi dengan jumlah terpene yang diinginkan paling tinggi. Namun, kadar squalene pada tanaman biasanya rendah, dan TLC tidak cukup sensitif untuk mendeteksinya. 5

10b. Gabungkan fraksi yang mengandung squalene atau terpenoid yang menarik, dan konsentrasikan fraksi tersebut di bawah aliran nitrogen gas. 11b. Sampel terkonsentrasi harus mengandung sebagian besar squalene. Kuantitas dan kemurnian squalene dapat ditentukan dengan menganalisis sebagian kecil sampel oleh GC. Sampel mungkin mengandung molekul lain yang berkombinasi dengan squalene, dan ini akan mengurangi kemurnian sampel. HPLC dapat digunakan untuk pemurnian lebih lanjut. Bersihkan squalene menggunakan HPLC 12. Transfer ekstrak pekat ke botol yang sesuai untuk pemisahan HPLC. 13. Suntikkan seluruh sampel, dan jalankan dalam mode isokratik (100% n-heksana) pada 8 ml / menit. 14. Elusi Squalene dapat dideteksi dengan mengikuti serapan maksimum UV pada 200 hingga 215 nm. HPLC digabungkan ke array dioda foto umumnya bukan metode yang sangat sensitif untuk mendeteksi terpena, karena mereka tidak menyerap panjang gelombang UV tertentu. Namun, ketika dimurnikan dalam skala besar, konsentrasi terpene akan cukup tinggi sehingga menggunakan panjang gelombang 200 nm akan mencukupi. Menggunakan panjang gelombang 200 hingga 215 nm tidak terlalu spesifik untuk fitur kimia apa pun, sehingga dapat juga digunakan untuk melacak kotoran. 15. Kumpulkan fraksi eluat, dan analisis fraksi individual dengan GC atau TLC untuk mengidentifikasi fraksi yang mengandung jumlah squalene tertinggi. Analisis GC adalah metode yang lebih disukai untuk ini, tetapi TLC juga dapat digunakan. 16. Gabungkan semua fraksi yang mengandung squalene murni dan singkirkan pelarut dengan penguapan di bawah aliran gas nitrogen yang lembut. Setelah pelarut telah sepenuhnya dihapus, squalene murni akan tetap (minyak transparan lebih kental dari pelarut). Upaya kromatografi berulang dapat digunakan untuk meningkatkan kemurnian terpenoid yang diinginkan, dalam hal ini squalene. ALTERNATE PROTOCOL 1 EKSTRAKSI DAN ANALISIS TERPENA YANG VOLATILE Banyak monoterpen dan sesquiterpen dapat berubah-ubah, dan walaupun ini berperan penting dalam interaksi tanaman dengan lingkungannya, mereka memerlukan metode khusus untuk analisisnya. Terena yang mudah menguap hadir dalam jaringan tanaman tertentu dapat dipelajari secara langsung melalui teknik ekstraksi tradisional (misalnya hidrodistilasi, ekstraksi dengan pelarut organik) dan teknik yang lebih baru, seperti ekstraksi mikro fase padat (untuk tinjauan lihat [Pawliszyn, 2012)) atau microwave Ekstraksi berbantuan (Chemat et al., 2012). Namun, terpene yang dipancarkan ke atmosfer terakumulasi hanya sementara di fase daun dan lipid, dan dengan demikian hanya hadir dalam konsentrasi kecil dalam sampel jaringan (Wu et al., 2006). Oleh karena itu, mempelajari biosintesis dan emisi dari emisi terpene memerlukan teknik perangkap molekuler. Dalam protokol alternatif ini, kami menjelaskan cara menjebak sesquiterpen yang mudah menguap, seperti patchoulol, yang dipancarkan dari tanaman tembakau transgenik yang dihasilkan oleh Wu et al. (2006). Materi Tambahan (lihat juga Protokol Dasar 1) Pabrik tembakau transgenik yang mengeluarkan seskuiterpin yang mudah menguap (Wu et al., 2006) Tenax resin 20-35 mesh, 150 mg (Sigma-Aldrich, kucing no. 11049-U) Gas ketat, ruang kaca dengan dua port yang mampu memasang tubing Kompres atau rumah disediakan udara 300 hingga 500 ml / menit Jalur vakum, 300 hingga 500 ml / menit

6

Kumpulkan terpenoid yang mudah menguap 1. Masukkan tanaman ke dalam ruang yang dapat disegel dengan dua port (Gbr. 3). Hubungkan satu port ke tangki udara tekan (atau sumber udara in-house), dan hubungkan yang lain ke saluran vakum dengan kecepatan aliran gas yang cocok sekitar 300 hingga 500 ml / menit. Pastikan untuk membungkus pot tanaman dengan bungkus plastik, menutupi semua tanah dan melilitkan batang tanaman. Ini harus meninggalkan hanya bagian udara dari tanaman yang terpapar ke udara yang bersirkulasi dan menghindari pengumpulan volatil yang dipancarkan dari tanah. 2. Kemas pipet kaca Pasteur dengan 150 mg resin tenax (mirip dengan kolom silika pada Gambar. 2) dan tempelkan ke jalur input sebelum udara memasuki ruangan. Resin tenax akan mencegah udara memasuki ruangan. Gunakan konektor sederhana untuk memudahkan pertukaran jebakan. Masukkan garis input gas ke bagian bawah bilik. 3. Kemas pipet kaca Pasteur kedua dengan 150 mg resin tenax, dan masukkan ke saluran gas keluaran untuk mengumpulkan (menjebak) senyawa volatil. PROTOKOL DASAR 2 EKSTRAKSI DAN ANALISA TERTENSI DENGAN MODIFIKASI Adalah umum untuk terpene untuk dimodifikasi dengan penambahan gugus substituen yang meningkatkan polaritasnya, misalnya dengan penambahan gugus hidroksil atau oksidasi gugus metil ke fungsi asam karboksilat yang sesuai. Namun, penting untuk diingat bahwa jumlah dan jenis modifikasi dapat menambah atau mengurangi polaritas produk terpene akhir. Selain itu, sementara penambahan sejumlah kecil modifikasi polar dapat memungkinkan untuk analisis dengan GC, penambahan sejumlah besar modifikasi tersebut atau kelompok yang sangat polar (misalnya mono atau seskuiterpen dengan gugus asam atau glikosilasi) akan memerlukan analisis LC daripada GC, atau setidaknya derivatisasi untuk memastikan senyawa dapat diselesaikan dengan GC. Protokol ini akan menggunakan ekstraksi seskuiterpenoid, capsidiol, dari kultur sel tembakau sebagai demonstrasi cara mengekstrak terpenoid polar sedang. Senyawa ini dapat diekstraksi dari media kultur sel dan ekstrak metanol sel menggunakan metode partisi kloroform. bahan Khloroform Kultur sel tanaman tembakau Hexane Sikloheksana Aseton Reagen indikator vanilin (lihat resep) Koleksi berbentuk pir bertanya Corong pemisah Rotoevaporator Pipa serologis gelas Pipet Kaca Pasteur (Fisherbrand, cat. No. 13-678-20A) Lembaran TLC, gel silika 60 F254 (Millipore, kucing no. 105735) Tangki kromatografi TLC Alat penyemprot kaca (harus terhubung ke udara terkompresi atau nitrogen) Kotak semprot (untuk menangkap reagen indikator TLC berlebih) 7

gambar 3. Analisis gas ruang kepala untuk terpena yang mudah menguap. Untuk secara efisien mengumpulkan terpena volatil yang dipancarkan dari bagian udara tanaman, bagian pot dan tanah tanaman dibungkus rapat dengan plastik dan ditempatkan dalam kedap gas, ruang kaca seperti ruang pengeringan. Sistem pertukaran gas dimasukkan ke dalam bilik untuk memfasilitasi pertukaran udara yang efisien (300 hingga 500 ml / mnt) dengan perangkap tenax yang dipasang di jalur keluaran untuk mengumpulkan senyawa yang mudah menguap. Senyawa tenax yang terperangkap selanjutnya dielusi dari resin menggunakan pelarut organik yang sesuai dan dipekatkan sesuai kebutuhan sebelum analisis GC. Ekstrak terpenoid dari kultur sel dan media cair 1. Bilas bulu pengumpulan dan corong pemisah dengan kloroform. 2. Tuangkan seluruh sampel kultur sel (10 ml) ke dalam corong pemisah dengan sumbat tertutup. 3. Tambahkan 20 ml kloroform, tutup kaca pengaman, corong balikkan, buka tutup botol, dan kocok perlahan selama 15 detik. Membuka stopcock menjaga keseimbangan tekanan dengan atmosfer selama bergetar. 4. Tutup stopcock, balikkan corong, lepaskan sumbat kaca, dan diamkan selama 1 hingga 2 menit, atau sampai fase terpisah dan bentuk antarmuka yang tajam. 5. Kuras fase kloroform bagian bawah ke dalam kumpulan koleksi. 6. Ulangi langkah ekstraksi 3 hingga 5, dan gabungkan ekstrak menjadi satu permintaan. 7. Amankan fluida pengumpulan ke rotoevaporator, mulai rotasi fluida (50 hingga 100 rpm), rendam fluida pengumpulan ke dalam penangas air (40 ° hingga 50 ° C), dan menguap hingga kering. Suhu rotoevaporator harus disesuaikan mengingat labilitas panas relatif terpene target Anda. 8. Tangguhkan ekstrak kering dalam 100 hingga 200 μl heksana, dan transfer ke botol GC. Lakukan analisis TLC pada capsidiol yang diekstraksi 9. Dengan menggunakan pensil, tandai tempat pengisian pada pelat TLC 1,5 cm ke atas dari bawah, dan jarak 1,5 cm di antara bintik-bintik. 10. Cari 20-μl alikuot dari setiap sampel, dan biarkan sampel mengering. 11. Kembangkan pelat TLC dalam tangki kromatografi yang mengandung 1: 1 sikloheksana: aseton hingga pelarut bergerak 7 cm melewati zona aplikasi sampel. Angkat piring dan keringkan. 12. Tempatkan pelat TLC dalam kotak semprot, semprotkan pelat TLC dengan reagen indikator vanillin, dan kembangkan warnanya menggunakan panas — gunakan pengaturan terpanas dari pengering rambut konvensional atau inkubator 100 ° C. Terpenoid dapat dilihat dengan jelas pada pelat TLC sebagai pita merah terang sampai biru. Keuntungan menggunakan reagen indikator vanillin adalah bahwa ia akan menghasilkan pita berwarna tertentu tergantung pada terpene yang berinteraksi dengannya, sehingga menambah lapisan spesifik untuk menentukan keberadaan senyawa. Pewarna indikator lain juga dimungkinkan. protokol alternatif 2 EKSTRAKSI DAN ANALISA TERPENSI YANG DEKORASI DENGAN KELOMPOK BESAR Analisis terpena terkonjugasi dengan asam lemak atau turunan asil lainnya menggunakan ikatan ester dapat dipecah menggunakan saponifikasi. Ikatan ester ini meninggalkan gugus hidroksil yang ada pada tulang punggung terpenoid yang dapat di sililasi menggunakan agen derivatisasi untuk memungkinkan volatilitas yang lebih baik dan analisis menggunakan GC. Protokol yang disajikan di bawah ini menunjukkan cara mengekstrak dan menganalisis pitosterol. Penting untuk dicatat bahwa saponifikasi tidak diperlukan untuk menganalisis sterol bebas, karena mereka akan dipartisi ke dalam fase organik menggunakan metode seperti yang dijelaskan dalam protokol 1. Derivatisasi pada akhirnya masih dapat digunakan bahkan jika saponifikasi tidak, karena itu akan memungkinkan sensitivitas yang lebih baik dalam deteksi menggunakan GC. Saponifikasi akan 8

memungkinkan ekstraksi dan analisis total populasi fitosterol dari jaringan yang dianalisis. Protokol ini mencakup elemen yang dimodifikasi dari yang disajikan oleh Du dan Ahn (2002). Materi Tambahan (lihat juga Protokol Dasar 1 dan 2) 20 hingga 100 mg jaringan tanaman Etanol 33% (b / v) kalium hidroksida, dalam air 1 μg / μl5-α-cholestane (Sigma-Aldrich, kucing. No. C8003) Air terdeionisasi Hexane Piridin MSTFA – 1% TMCS (Thermo Scientific, cat. No. TS-48915) Skala akurat hingga dalam ± 0,1 mg Blok panas diatur pada 50 ° C Botol kaca, 14 ml, dengan tutup PTFE (mis., Kimble Chase, kucing no. 60940A24) Pipa serologis gelas Pipet Kaca Pasteur (Fisherbrand, cat. No. 13-678-20A) Botol GC Sisipan tabung gelas GC Saponifikasi dan ekstrak fitosterol 1. Kumpulkan dan timbang bahan tanaman. 2. Menghomogenkan sampel dalam nitrogen cair dalam botol kaca (lihat Protokol Dasar 1, langkah 2). 3. Tambahkan 5 ml etanol 94: 6 (v / v): 33% KOH ke dalam sampel. Gunakan pipet kaca untuk mentransfer semua cairan dan mencegah pencucian plasticizer ke dalam larutan. 4. Tambahkan 10 μlof1μg / μl5-α-cholestane ke sampel, campur, dan inkubasi 1 jam pada 50 ° C, lalu dinginkan di atas es selama 10 menit. 5. Tambahkan 7,5 ml air deionisasi dan 7,5 ml heksana. 6. Kocok perlahan campuran setidaknya selama 30 detik, lalu biarkan semua fase terpisah. 7. Transfer fase heksana atas ke vial bersih. Ulangi ekstraksi fase air dengan 7,5 ml heksana, dan gabungkan ekstrak heksana ini dengan yang pertama. 8. Konsentrasikan ekstrak heksana menjadi 100 μl di bawah aliran nitrogen, dan pindahkan sampel ke botol GC (dengan botol insert berukuran tepat jika perlu). 9. Keringkan sampel di bawah aliran nitrogen. 10. Tambahkan 100 μl piridin dan 100 μl MSTFA – 1% TMCS, dan derivatisasi pada suhu kamar semalam atau pada 50 ° C selama 1 jam dengan sesekali vortexing. Pyridine dan MSTFA – 1% TMCS hanya boleh digunakan dalam lemari asam yang memakai peralatan pelindung pribadi yang benar. Pyridine memiliki bau busuk, dan MSTFA-1% TMCS beracun dan kaustik, menyebabkan luka bakar kimia jika terkena kulit, dan berpotensi fatal jika terhirup. Tidaklah penting untuk mempertahankan rasio pyridine: MSTFA-1% TMCS 1: 1. Volume setiap komponen dapat diperkecil hingga masing-masing 50 μl. Adalah penting bahwa suatu agen derivatisasi yang berlebih dipertahankan, jika tidak, senyawa-senyawa tersebut tidak semuanya akan sililasi, yang akan muncul dalam jejak GC-MS sebagai puncak yang kurang tepat dalam hubungannya dengan puncak TMS-eter yang sesuai.

9

11. Analisis 1 μl menggunakan GC-MS. Jika menggunakan kolom HP-5MS seperti dalam Protokol Dasar 1, gunakan suhu injektor 250 ° C, dengan suhu oven awal 200 ° C selama 0,5 menit, diikuti dengan tanjakan ke 270 ° Cat10 ° C / mnt, kemudian untuk 320 ° Cat3 ° C / mnt, dan tahan selama 10 mnt. PROTOKOL DASAR 3 EKSTRAKSI DAN ANALISA TERPENOID POLAR Di alam, banyak terpenoid yang menarik akan didekorasi dengan satu atau beberapa kelompok atau molekul polar, yang secara signifikan meningkatkan ukuran dan polaritas molekul terpenoid. Ekstraksi menggunakan pelarut non-polar (yaitu heksana) dan analisis oleh GC-MS tidak dapat digunakan untuk jenis terpenoid ini karena ketidakmampuan umum untuk mempartisi ke dalam fase organik serta ketidakmampuan senyawa untuk diuapkan secara efisien untuk analisis menggunakan GC. Oleh karena itu, pelarut yang lebih polar harus digunakan untuk ekstraksi (mis. Metanol) dan sistem LC-MS akan lebih cocok untuk analisis. Dalam protokol ini, kami akan menjelaskan secara singkat metode yang disederhanakan untuk ekstraksi dan analisis artemisinin, yang merupakan salah satu terpenoid obat yang paling penting. Lapkin et al. (2006) mengevaluasi metode ekstraksi yang berbeda untuk artemisinin dari Artemisia annua memeriksa parameter seperti biaya operasi, toksisitas, risiko dan keselamatan, emisi gas rumah kaca, dan biaya modal. Para penulis ini menyimpulkan bahwa beberapa teknologi yang muncul (mis. Ekstraksi cairan ionik) akan dapat bersaing dengan ekstraksi tradisional (mis. Heksana), tetapi dalam hal parameter yang dipertimbangkan, heksana lebih baik daripada etanol. Namun, protokol yang disajikan di bawah ini adalah metode yang direproduksi menggunakan HPLC electrospray (ESI) quadrupole waktu penerbangan tandem spektrometri massa (Q-TOF MS / MS) untuk ekstraksi artemisinin dari jaringan tanaman, yang diambil dari Van Nieuwerburgh et al. (2006), dan sesuai untuk ekstraksi skala lab di mana throughput tinggi dan pemulihan tinggi diutamakan daripada pertimbangan skala komersial / industri. Materi Khloroform Metanol 1 mM amonium asetat, pH 5,5 β-artemether (Sigma-Aldrich, cat. no. A9361) HPLC, misalnya, Waters Alliance 2695 dilengkapi dengan dua pompa (pompa 1: 1 mM buffer amonium asetat, pH 5,5; pompa 2: metanol) dan kolom penjaga Waters XTerra MS C18 5 μm (10-mm × 2.1-mm) digabungkan ke Alltech Ultrasphere C18 IP 5 μm kolom (150-mm × 2.1-mm) dengan LC Packings ACUrate ICP-04-20 post kolom splitter mengirimkan seperempat kolom eluate ke dalam LC-MS ESI Q-TOF MS / MS, mis., Ultima MS dengan sumber ESI yang beroperasi dalam mode positif dengan tegangan kapiler 2,7 kV, suhu sumber 130 ° C, dan suhu desolvasi 300 ° C; nitrogen sebagai gas desolvasi dengan laju aliran 500 liter / jam; MS / MS dilakukan dengan menggunakan argon (0,9 bar) untuk tabrakan; tegangan kerucut diatur untuk 40 V dan energi tabrakan 7 eV optimal untuk artemisinin Ekstrak dan analisis artemisinin 1. Celupkan 1 g bahan daun dalam 6 ml kloroform selama 1 menit. 2. Transfer 10-μl aliquot ke dalam 1 ml metanol 1: 1 (v / v): larutan ammonium asetat.

10

Larutan metanol: amonium asetat dapat mengandung 0,4 mg / ml standar internal, β-artemeter. Ekstraksi singkat ini diyakini dimungkinkan karena fakta bahwa mayoritas artemisinin dalam A. annua berada di kelenjar subkutikular, yang mudah diakses oleh pelarut. Perhatikan bahwa homogenisasi jaringan sebelum ekstraksi mungkin diperlukan untuk sebagian besar metode ekstraksi lainnya. 3. Suntikkan 100 μl sampel ke sistem HPLC dan pisahkan komponen menggunakan aliran gradien elusi 0,2 ml / mnt, dimulai dengan 1: 1 (v / v) metanol: larutan amonium asetat selama 1 mnt diikuti dengan peningkatan linear dalam konsentrasi metanol 80% selama 6 menit dan kemudian dipertahankan selama 18 menit. Setarakan kolom selama 10 menit antar sampel. 4. Analisis kandungan artemisinin menggunakan sinyal MS / MS sebagai jumlah dari intensitas puncak m / z dari 219, 229, 247, dan 265 terfragmentasi dari induk m / z 283. REAGEN DAN SOLUSI Gunakan air suling dan deionisasi dalam semua resep dan langkah protokol. Reagen indikator vanilin untuk TLC 1,4 g vanilin (Sigma-Aldrich, kucing. No. V1104) 40 ml metanol 250 μl asam sulfat Simpan pada 4 ° C Informasi latar belakang Terpenoid terdiri dari sekelompok besar metabolit alami yang berbeda, banyak di antaranya ditemukan pada tanaman. Terpen yang ditemukan dan diisolasi dari tanaman telah digunakan secara luas dalam makanan, kosmetik, obat-obatan dan dalam berbagai aplikasi bioteknologi. Kemampuan untuk mengisolasi dan memurnikan molekul-molekul berharga ini dari tanaman adalah kunci untuk menjelaskan aplikasi potensial mereka. Sebagai contoh, obat anti-kanker, paclitaxel, yang awalnya diekstraksi dari kulit kayu dari pohon cemara Pasifik, terus memiliki upaya yang dikembangkan untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi dari kultur sel tanaman (Theodoridis et al., 1998; Kawamura et al., 1999; Oh et al., 2012; Taura et al., 2013; Kim dan Kim, 2015). Ini menegaskan kembali poin-poin yang dibuat dalam pendahuluan, bahwa semakin kompleks target terpene menjadi, semakin kompleks prosedur ekstraksi untuk mengoptimalkan pemulihan, sepenuhnya. Di alam, suatu terpenoid dapat mengandung banyak struktur siklisasi dan berbagai jenis kelompok (mis. Kelompok hidroksil, asam lemak, gula, cincin benzil). Dekorasi ini akan meningkatkan polaritas molekul secara signifikan. Polaritas molekul adalah fitur paling penting untuk dipertimbangkan saat menentukan cara memurnikan terpenoid yang diinginkan. Selain itu, volatilitas dan ukuran merupakan faktor penting, yang akan menentukan aspek penting dari metode ini serta jenis peralatan analitis yang harus digunakan. Metode yang dijelaskan dalam protokol dasar 1 dan 2 akan cocok untuk sebagian besar terpenoid non-polar, sedangkan metode yang dijelaskan dalam protokol dasar 3 dan protokol alternatif 2 dapat digunakan untuk terpenoid polar. Sekali lagi, Gambar 1 dapat digunakan sebagai panduan umum - Anda dapat melihat terpene mana yang paling cocok dengan struktur Anda (yang diantisipasi), dan wilayah yang diarsir yang jatuh harus menjadi panduan umum tentang protokol mana yang dapat digunakan untuk ekstraksi: Molekul terbaik diekstraksi dan dianalisis 11

menggunakan protokol yang mirip dengan yang disajikan dalam 1, 2, atau 3 masing-masing disorot dalam warna hijau, merah, atau biru. Namun, ekstraksi salah satu terpenoid secara efisien dan ekonomis biasanya membutuhkan metode yang lebih spesifik dan optimal. Karena batasan panjang dari laporan ini dan prospek bahwa prosedur ekstraksi yang dioptimalkan dapat dikembangkan untuk masing-masing dan setiap senyawa terpene berdasarkan pada sifatsifatnya dan jaringan nenek moyang, protokol ini harus dipertimbangkan hanya sebagai titik awal awal untuk ekstraksi dari setiap spesifik senyawa terpene / terpenoid. Satu juga akan dilayani dengan baik untuk berkonsultasi dengan bahan referensi lain seperti yang menggambarkan protokol ekstraksi spesifik untuk karotenoid (Rodriguez, 2001; Taylor et al., 2006), lakton terpenoid (seperti yang digunakan untuk Ginkgo biloba; Ding et al., 2004; Sun et al., 2005; Croom et al., 2008) dan glikosida terpene (Kodama et al., 1981). Banyak artikel penelitian utama saat ini terus melaporkan penyempurnaan dalam metode ekstraksi yang memungkinkan keuntungan signifikan dibandingkan metode konvensional (mis. Pengurangan penggunaan pelarut organik, penghindaran degradasi sampel, dan penghapusan langkah-langkah tambahan dalam pembersihan dan konsentrasi sampel sebelum analisis kromatografi.) Parameter Kritis dan Pemecahan Masalah Protokol yang disajikan dalam unit ini didasarkan pada prosedur standar yang telah diuji secara menyeluruh di laboratorium kami atau berasal dari literatur yang diterbitkan oleh rekan sejawat. Namun, ekstraksi optimal dari terpene / terpenoid spesifik yang diinginkan akan membutuhkan perubahan spesifik dan penyempurnaan protokol ini. Pertimbangan penting lainnya yang harus diperhitungkan selama ekstraksi adalah integritas dan kemurnian senyawa target, yang dapat terdegradasi oleh oksidasi karena terpapar ke atmosfer atau degradasi karena perlakuan keras yang digunakan selama ekstraksi atau proses analitik (yaitu meliofilisasi, pemanasan selama saponifikasi atau suhu tinggi digunakan selama analisis GC). Sebagaimana dinyatakan dalam protokol pertama, indikator terbaik untuk memahami dan memperkirakan kerugian adalah dimasukkannya standar eksternal yang memiliki sifat kimia yang mirip dengan senyawa target sebelum ekstraksi. Idealnya, seseorang ingin menggunakan standar yang dimurnikan yang memiliki fitur kimia yang mirip dengan senyawa target, yang kemudian dapat digunakan untuk menentukan efisiensi ekstraksi secara keseluruhan. Ini kemudian akan memberikan panduan berharga untuk menilai pemulihan persentase aktual, yang dapat dikurangi dengan partisi yang buruk antara pelarut ekstraksi, degradasi, dan faktor mitigasi lainnya. Hasil yang Diharapkan Mengikuti protokol yang dijelaskan di atas sebagai pedoman harus memungkinkan seseorang untuk mendeteksi terpene yang diinginkan menggunakan metode analitik yang disarankan. Sangat penting untuk memahami batas deteksi untuk metode analitis yang diinginkan dan efisiensi pemulihan metode untuk menentukan jumlah jaringan yang diperlukan untuk ekstraksi awal. Setelah ini diverifikasi, volume protokol dapat dengan mudah diskalakan sesuai dengan kebutuhan seseorang. Sebagai contoh, minimum ~ 20 mg jaringan FW akan diperlukan dalam protokol alternatif 2 dengan pemulihan 30-60% dari standar eksternal (5-α-kolestana), untuk mendeteksi dan mengukur komponen phytosterol utama yang andal (yaitu sitosterol, campesterol, dan stigmasterol). Pertimbangan waktu Proses ekstraksi lengkap akan memakan waktu 1 hingga 2 hari tergantung pada protokol ekstraksi yang dipilih. Ekstraksi dengan pelarut organik biasanya memakan waktu satu setengah hingga satu hari penuh, sementara pemasukan pemurnian menambah, minimal, satu atau dua hari lagi.

12