Doc8888.pdf

  • Uploaded by: yin frits
  • 0
  • 0
  • December 2019
  • PDF

This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA


Overview

Download & View Doc8888.pdf as PDF for free.

More details

  • Words: 5,157
  • Pages: 11
Una breve historia de la proteína G Receptores acoplados

La idea de los receptores ha fascinado a los científicos durante más de un siglo y, desde luego, nos ha fascinado a mí ya Brian en todas nuestras carreras de investigación. Hoy sabemos que los receptores acoplados a la proteína G, también conocidos como siete receptores transmembrana, representan con mucho el más grande, el más versátil y el más ubicuo de las varias familias de receptores de membrana plasmática. Comprenden casi mil genes que regulan prácticamente todos los procesos fisiológicos conocidos en los seres humanos, incluidas las modalidades sensoriales de la visión, el gusto y el olfato. Además, estos receptores son los objetivos de los medicamentos que representan más de la mitad de todas las ventas de medicamentos recetados en el mundo (1). A pesar del papel central que desempeña el estudio de los receptores en la investigación biomédica actual, es solo en los últimos treinta años que ha habido una aceptación general de que existan. Antes de ese momento, la noción de receptores celulares era muy controvertida y se asociaba con un gran escepticismo. Quizás la primera afirmación explícita sobre la existencia de receptores fue hecha por el farmacólogo británico, J.N. Langley. En 1905 escribió lo siguiente: “Entonces, podemos suponer que en todas las células se deben distinguir dos constituyentes, al menos. La sustancia principal que se refiere a la función principal de la célula como la contracción y la secreción y las sustancias receptivas sobre las que actúa la sustancia química. Cuerpos y en ciertos casos por estímulos nerviosos. La sustancia receptiva afecta o es capaz de afectar el metabolismo de la sustancia principal” (2). Por lo tanto, la declaración de Langley postula explícitamente las dos funciones interrelacionadas de estas hipotéticas estructuras de receptores: primero, interactúan con químicos y estímulos, presumiblemente al unirlos de una manera específica, y segundo, actúan sobre los efectores dentro de la célula para alterar su función. Sin embargo, la idea de Langley fue generalmente ignorada o ridiculizada. Un ejemplo de esto es la siguiente declaración escrita unos cuarenta años después, irónicamente por su alumno Henry Dale, quien ganó el Premio Nobel por sus estudios sobre la neurotransmisión colinérgica. Sin embargo, en 1943 tuvo esto para decir sobre la idea del receptor de su mentor: "Es una mera afirmación de hecho decir que la acción de la adrenalina capta ciertas células efectoras y deja otras no afectadas; es una simple deducción de que las células afectadas tienen una afinidad especial de algún tipo por la adrenalina, pero dudo que la atribución a tales células de "receptores de adrenalina" haga más que reafirmar esta deducción en otra forma "(3).

Figura 1. Unión de radioligandos al receptor β2-adrenérgico de las membranas de eritrocitos de rana.

. A. Ajuste de curva computarizada de los datos de unión del desplazamiento de [3H] dihidroalprenolol por el antagonista (-) alprenolol. B. Desplazamiento por el agonista (-) isoproterenol en presencia (□ - □) o ausencia (○ - ○) de 10–4 M GTP. C. El modelo complejo ternario. A y B se reproducen con permiso de la referencia 11, C se reproduce de la referencia 12. Quizás aún más irónico sea la próxima cita de Raymond Ahlquist. Fue un distinguido farmacólogo clásico de mediados del siglo XX que ganó el Premio Lasker por su trabajo en 1948, afirmando que había dos tipos de receptores para la adrenalina, a los que denominó α y β en función de las diferentes capacidades de los diversos agentes adrenérgicos para Estimular varios procesos fisiológicos (4). No obstante, unos veinticinco años más tarde escribió lo siguiente: "Esto sería cierto si fuera tan presuntuoso como para creer que los receptores α y β realmente existían. Hay quienes lo piensan e incluso proponen describir su estructura íntima. Para mí, son un concepto abstracto concebido para explicar las respuestas observadas de los tejidos producidos por sustancias químicas de diversas estructuras ”(5). Entonces, fue en este contexto de escepticismo que aquellos de nosotros que estábamos interesados en tratar de darles vida a estos receptores míticos, empezamos el trabajo hace unos cuarenta años. De inmediato quedó claro que si teníamos éxito, sería necesario desarrollar un conjunto completo de nuevas tecnologías que no existían en ese momento y que el primero de ellos tendría que ser métodos de unión de radioligandos para estudiar los receptores directamente. Y así, junto con el estudiante Rusty Williams y el postdoctor Marc Caron, me propuse desarrollar tales métodos, inicialmente para el receptor β-adrenérgico (6) y luego el receptor α-adrenérgico (7). Las técnicas de unión de radioligandos que desarrollamos a principios de los años 70 nos permitieron estudiar la regulación de los receptores por numerosos factores (8), descubrir subtipos de receptores previamente insospechados (9) y desarrollar teorías sobre los mecanismos de acción del receptor.

Por ejemplo, encontramos que las curvas de competición de unión para antagonistas como el alprenolol, antagonista adrenérgico β, son empinadas y monofásicas; mientras que los de los agonistas, como el isoproterenol o la epinefrina, son superficiales (10) que muestran dos estados de unión distintos, uno de alta y otro de baja afinidad (11) (Fig. 1A). Los dos estados podrían interconvertirse mediante la adición de nucleótidos de guanina que conducen a una única población de receptores en el estado de baja afinidad (Fig. 1B). Junto con Andre DeLean, desarrollamos el modelo complejo ternario para explicar este comportamiento (Fig. 1C) (12). Postuló que la forma de baja afinidad del receptor, mostrada aquí como AR, es un complejo del agonista con el receptor libre, mientras que la forma de alta afinidad es un complejo ternario de agonista, receptor y algún otro componente de membrana. El papel modulador de los nucleótidos en la afinidad del agonista por el receptor sugirió inmediatamente que el componente X en el esquema era, en ese momento, la proteína reguladora de nucleótidos de guanina (proteína G) recientemente descubierta. La capacidad de un agonista para dirigir la interacción del receptor con la proteína reguladora del nucleótido guanina para formar el complejo ternario es esencialmente una medida de su eficacia para estimular la adenilato ciclasa. Se puede aproximar simplemente por la relación de afinidades del agonista para las formas de afinidad baja (binaria) y alta (ternaria) del receptor que se pueden obtener fácilmente a partir de estas curvas de competición. Estos hallazgos representan quizás la demostración directa más temprana de las interacciones alostéricas del receptor con los agonistas y las proteínas efectoras G, la unión de cada uno al receptor mejora de manera alostérica la afinidad de unión del otro. Este enfoque para analizar dichos datos de unión de ligandos ha sido universalmente aplicable a la gran familia de GPCR. Sin lugar a dudas, una de las aplicaciones más importantes de nuestras técnicas de unión de ligandos fue ayudarnos a etiquetar las supuestas moléculas receptoras a través de varias etapas de purificación, para que podamos aislarlas. Purificar el receptor β-adrenérgico y otros receptores adrenérgicos fue verdaderamente una tarea desalentadora. Las moléculas son prácticamente contaminantes de las membranas plasmáticas y requieren una purificación de 100.000 veces. Además, primero tuvimos que descubrir cómo solubilizarlas de las membranas antes de que pudiéramos comenzar el trabajo de purificación. En última instancia, la clave de nuestro éxito fue nuestro desarrollo de matrices de cromatografía de afinidad en las que pudimos acoplar varios antagonistas β adrenérgicos y luego α-adrenérgicos a soportes sólidos (13–15) (Fig. 2A). La adsorción y elución bioespecífica de dichas columnas con ligandos adrenérgicos seguidas de otras etapas cromatográficas más convencionales condujeron finalmente a nuestro aislamiento de preparaciones homogéneas de cada uno de los cuatro receptores adrenérgicos conocidos entonces, α1, α2, β1 y β2 (revisado en 16). En este gel de poliacrilamida SDS se muestran tales preparaciones para tres de esos cuatro

receptores adrenérgicos (Fig. 2B). Esta cifra representa aproximadamente una década de trabajo de varios estudiantes devotos y postdoctorados, entre los que destacan Marc Caron y Jeff Benovic, entre otros. Cada una de las moléculas receptoras putativas aisladas es una glicoproteína de aproximadamente 60,000 a 65,000 daltons de peso molecular que se unía a ligandos adrenérgicos alfa y β específicos con la especificidad y la estereoespecificidad apropiadas que coinciden con lo que se esperaría de los experimentos farmacológicos clásicos (16).

Figura 2. Aislamiento de los receptores adrenérgicos mediante cromatografía de afinidad. Sin embargo, el escepticismo persistió en cuanto a si estas moléculas aisladas también podrían realizar la función compañera de un receptor, es decir, la capacidad de activar procesos biológicos específicos. Que este fue, de hecho, el caso fue demostrado por un talentoso postdoctorado, Rick Cerione. Inicialmente, reconstituyó nuestras proteínas de receptor β purificadas en vesículas de fosfolípidos y luego las fusionó con eritrocitos de Xenopus laevis, el sapo de garras africanas (17). Estas células, aunque poseían el sistema enzimático adenilato ciclasa y otros GPCR como el receptor de prostaglandina, no contenían receptores β y, por lo tanto, los agonistas adrenérgicos β no estimulaban la actividad del adenilato ciclasa. Una vez que las vesículas que contenían el receptor se fusionaron con las células, llevando así los receptores a la membrana celular, el adenilato ciclasa adquirió capacidad de respuesta a los fármacos β-adrenérgicos. En el transcurso de un año, y en colaboración con Lutz Birnbaumer y la difunta Eva Neer, pudimos lograr una reconstitución completa de un adenilato ciclasa sensible a catecolamina a partir de tres proteínas, el receptor β-adrenérgico purificado, la proteína reguladora del nucleótido guanina (Gs) y La unidad catalítica del adenilato ciclasa (18). Estos resultados demostraron de manera concluyente que las proteínas aisladas eran en realidad el receptor β-adrenérgico y eran capaces de llevar a cabo ambas funciones de un receptor verdadero. Con las proteínas receptoras validadas y altamente purificadas en la mano, pudimos obtener tramos cortos de secuencia de aminoácidos a partir de fragmentos de bromuro de cianógeno del receptor β2-adrenérgico y usarlos para diseñar sondas de oligonucleótidos para clonar el ADNc y el gen para el receptor β2adrenérgico (19). Este exitoso esfuerzo se realizó en colaboración con un equipo de Merck y mi laboratorio, y representó el primer esfuerzo de investigación exitoso de un joven cardiólogo que había estado trabajando en mi laboratorio durante varios años. Su nombre era Brian Kobilka. En esta primera secuencia clonada de un GPCR de unión a ligando podríamos observar todas las características que ahora se consideran canónicas para la familia (Fig. 3): siete dominios hidrofóbicos que abarcan transmembrana aparentes, sitios para la fosforilación reguladora en dominios citoplásmicos y secuencias de consenso para glicosilación en el

término amino. En lo que en ese momento era una sorprendente sorpresa, observamos una homología de secuencia, que se muestra aquí en azul (Fig. 3), con la proteína de detección de luz visual rodopsina. Hoy, veinticinco años después, a las personas les resulta difícil entender por qué esto sería una sorpresa. Esto se debió a que la rodopsina, cuya secuencia se había determinado un par de años antes por la secuenciación de proteínas convencional (20,21), y la bacteriorrodopsina (22), una bomba de protones sensible a la luz de archebacteria, eran en ese momento las únicas dos proteínas de extensión de membrana. conocido. Y, dado que ambas eran proteínas sensibles a la luz, se había especulado que siete tramos de membrana deben ser una característica distintiva de las moléculas sensibles a la luz (20,21). Solo con la clonación del receptor β2-adrenérgico comenzó a surgir que era, en cambio, la característica distintiva de los receptores acoplados a la proteína G. En un año habíamos clonado el receptor α2-adrenérgico altamente homólogo (23) y en varios años un total de ocho receptores adrenérgicos (24), tres de los cuales se basaban en la secuenciación de proteínas de las moléculas aisladas (19,23,25) y Un receptor de serotonina (26). Todos mostraron la conservada organización 7TM.

Figura 3. Clonación del receptor β2-adrenérgico. Los residuos sombreados en azul son homólogos a la rodopsina; naranja son sitios de fosforilación de PKA de consenso; rojo, sitios de fosforilación de GRK; Sitios de consenso verdes para la glicosilación ligada a N. Reproducido con permiso de la referencia 65. Así que para 1987 estábamos bastante convencidos de que todos los receptores acoplados a la proteína G conocidos en ese momento serían probablemente miembros de la superfamilia de siete receptores transmembrana (27). Durante los siguientes años, la familia creció rápidamente a medida que muchos laboratorios clonaban GPCRs casi invariablemente mediante técnicas de homología, como el cribado de baja rigurosidad y luego la PCR. De hecho, posteriormente casi ningún otro GPCR se purificó antes de su clonación. Por lo tanto, siempre nos sentimos bien con respecto a la muy difícil década o más de trabajo que se llevó a cabo en la purificación de los cuatro receptores adrenérgicos que proporcionaron las primeras secuencias, la Piedra de Rosetta, si así lo desea, sobre la cual podría construirse una superfamilia mucho más grande. A continuación, utilizamos varias técnicas para tratar de comprender cómo la estructura única y altamente conservada de siete receptores transmembrana que se extienden determina las dos funciones básicas de la unión del ligando y la activación de la proteína G. Nos basamos principalmente en la mutagénesis dirigida (28) y en la creación de los primeros receptores quiméricos, en este caso, quimeras del receptor α2 y β2adrenérgico (29). Una vez más, Brian tomó la iniciativa en este trabajo. Aunque están estrechamente relacionados en su estructura (estos dos receptores mostraron una identidad de secuencia del 50%) realizan funciones bioquímicas y fisiológicas diametralmente opuestas con el receptor α2 inhibidor de la adenilato ciclasa a través de Gi y el receptor β2-adrenérgico que lo estimula a través de Gs (Fig. 4A) Al crear estas quimeras pudimos demostrar que la especificidad de acoplamiento de la proteína G y, por lo tanto, la función del receptor α2 se podría convertir de inhibidor de Gi a estimulante de Gs simplemente reemplazando su tercer bucle citoplasmático con el del receptor adrenérgico β2 (Fig. 4B). Estos y muchos otros estudios similares confirmarían que la amplitud de la membrana y los bucles extracelulares fueron

responsables de la especificidad de unión a los ligandos de los receptores, mientras que las regiones mostradas en azul aquí en el citosol fueron responsables de determinar la especificidad del acoplamiento de la proteína G (30,31) (Fig. 4C).

Figura 4. Receptores α2-β2-adrenérgicos quiméricos. Adaptado de las referencias 29 y 65.

Figura 5. Receptores adrenérgicos mutantes constitutivamente activos. En el curso de realizar una mutagénesis adicional, Susanna Cotecchia, una compañera en el laboratorio, descubrió por casualidad, para nuestra sorpresa, que algunas mutaciones en la parte distal del tercer bucle citoplasmático de varios receptores adrenérgicos condujeron a receptores mutantes constitutivamente activos. Estos son receptores que están activos incluso en ausencia de ligando (32-34) (Fig. 5A). En el momento en que conceptualizamos esto como debido a su abrogación de ciertas interacciones intramoleculares cruciales que normalmente mantendrían al receptor en su conformación inactiva, se muestra como R y por lo tanto imitan los cambios conformacionales normalmente producidos por los agonistas que conducen a la forma activa del receptor. para acoplar a G se muestra como R * (Fig. 5A). En breve, Brian Kobilka explicará cómo las estructuras cristalinas de rayos X de los receptores han revelado la naturaleza de las restricciones intramoleculares que se rompen por la activación de los receptores inducida por agonistas. Curiosamente, ahora se ha demostrado que una creciente lista de enfermedades humanas se debe a tales mutaciones activadoras de varios GPCR (Fig. 5B) (35).

Contemporáneo con este trabajo sobre la estructura de los receptores, mi laboratorio se había centrado en tratar de entender el fenómeno virtualmente universal de la desensibilización del receptor. Este fenómeno se ilustra en la Fig. 6 para el receptor β-adrenérgico expresado en un sistema celular cultivado. Cuando se agrega a las células un agonista, como el isoproterenol, que es un congénero sintético de epinefrina, estimula los receptores y el cAMP se eleva en respuesta. Pero dentro de unos minutos, los niveles vuelven esencialmente al estado no estimulado a pesar de la presencia continua del fármaco (36). Desde los primeros días de mi carrera, siempre me había fascinado este fenómeno, tal vez porque representa un ejemplo tan claro de lo que es uno de los principios más generalizados de la fisiología, denominado homeostasis. Por lo tanto, las células y los tejidos, cuando se estimulan de cualquier forma, tienen innumerables mecanismos que tienden a devolverlos a su estado basal no estimulado.

Figura 6. Desensibilización de la producción de cAMP después de la estimulación del receptor β2adrenérgico. Reproducido con permiso de la referencia 36. Estado basal no estimulado. Déjenme contarles cómo llegamos a descubrir el principal mecanismo bioquímico responsable de dicha desensibilización. Aproximadamente en 1980, cuando acabábamos de desarrollar sondas de fotoafinidad para el receptor β-adrenérgico (37), Jeff Stadel, un compañero en el laboratorio utilizó esta sonda para marcar los receptores β-adrenérgicos en células que habían sido desensibilizadas por exposición previa al agonista. isoproterenol (38). Cuando sometimos estos receptores desensibilizados marcados con fotoafinidad a SDS Page, observamos que su movilidad en los geles se retrasó (Fig. 7). Recientemente se había descrito que la fosforilación de proteínas de membrana a menudo conducía a tales cambios en la movilidad electroforética. En consecuencia, etiquetamos las células con fosfato inorgánico y pudimos demostrar que la desensibilización inducida por catecolamina se asoció con la fosforilación del receptor β-adrenérgico (38). Durante los siguientes años, un talentoso estudiante graduado, Jeff Benovic, pudo primero identificar la nueva quinasa responsable de la fosforilación (39), purificarla hasta homogeneizarla en el cerebro bovino (40) y clonar su ADNc (41). Fue una nueva quinasa independiente de cAMP que llamamos βARK, para el receptor adrenérgico quinasa β. Ahora se conoce como receptor kinasa 2 acoplado a proteína G o GRK2. Al mismo tiempo, se había encontrado que la rodopsina estaba fosforilada por una nueva quinasa denominada rodopsina quinasa, cuando era blanqueada por la luz (42). Del mismo modo, esto parecía estar asociado con una reducción en su función. Pudimos clonar el cDNA para la rodopsina quinasa (42) y mostrar que él y βARK fueron los primeros dos miembros de una nueva subfamilia de quinasa, ahora conocida como quinasas receptoras acopladas a proteína G. Hoy sabemos que esta familia contiene siete enzimas, dos, los GRK 1 y 7 están limitados a la retina. Los GRK 2, 3, 5 y 6 se expresan de forma ubicua (43) (Fig. 8). Gracias al trabajo del laboratorio de John Tesmer, se dispone de estructuras de cristal para varias de ellas, la primera es la estructura que resolvió en colaboración con mi laboratorio hace unos 10 años para GRK2 en complejo con las subunidades βγ de las proteínas G, con las que interactúa en el citosol para facilitar su translocación a los receptores unidos a la membrana plasmática (44) (Fig. 8). Todos los miembros de la familia comparten una estructura de dominio tripartita conservada con un dominio de quinasa catalítica central conservada flanqueada por dos dominios reguladores más divergentes.

Figura 7. La desensibilización implica la fosforilación del receptor. SDS-PAGE de los receptores adrenérgicos β2 de las membranas de eritrocitos de pavo marcadas covalentemente con la sonda de fotoafinidad [125I] -p azidobencilcarazolol. Carril 2, células incubadas con isoproterenol, 1 µM; carril 3, isoproterenol, 1 µM en presencia de propanolol 10 µM (un antagonista); carril 4, células de control incubadas con tampón solo. Reproducido con permiso de la referencia 38.

Figura 8. Quinasas receptoras acopladas a la proteína G. Reimpreso con permiso de la referencia 44. Pero resultó que había más en la historia que solo estos GRK que fosforilan el receptor. En el curso de la purificación de GRK2, encontramos que incluso a medida que aumentaba su actividad específica para fosforilar las preparaciones de receptores, su capacidad para desensibilizar el receptor aislado, ensayado en un sistema reconstituido, disminuyó. Esto nos sugirió que podríamos estar perdiendo algún otro elemento o cofactor requerido (45). Aproximadamente en esta época, el difunto Hermann Kuhn describió su observación de que una proteína retiniana abundante, conocida entonces como proteína 48K o antígeno S, de alguna manera funcionó junto con la rodopsina quinasa para desactivar la rodopsina (46). En consecuencia, la proteína pasó a llamarse arrestina, porque "detuvo" la función de la rodopsina. Inmediatamente especulamos que esta proteína podría ser similar a lo que estábamos perdiendo durante nuestra purificación GRK2. Por supuesto, su expresión restringida solo a la retina significaba que no podía ser la proteína que buscábamos. Llamando a Kuhn, hice los arreglos para que nos enviara algo de esta proteína 48K, que Benovic pudo demostrar rápidamente restaurando la capacidad de βARK o GRK2 para desensibilizar el receptor β in vitro, aunque en altas concentraciones (45). Poco después, Toshimichi Shinohara en el NIH clonó el ADNc de esta proteína retiniana (47). Razonando que lo que podríamos estar perdiendo durante nuestras preparaciones de enzimas no solo podría ser funcionalmente análogo con la arrestina retiniana o la proteína 48K, sino que, de hecho, estructuralmente homólogo con él, obtuvimos el clon de Shinohara y, usando técnicas de detección de baja rigurosidad, Martin Lohse, luego En el laboratorio, fue capaz de clonar el cDNA para una secuencia idéntica al 70% de la molécula que denominamos β-arrestin (48). Un año o dos más tarde, otro compañero, Håvard Attramadal, pudo clonar otra molécula similar que denominamos β-arrestin2 (49). Ahora, con las tres auténticas moléculas de arrestina recombinante en la mano, la arrestina visual y las dos β-arrestinas 1 y 2, podríamos comparar sus capacidades para desensibilizar la rodopsina y el receptor β in vitro en sistemas reconstituidos (Fig. 9). Cuando utilizamos rodopsina fosforilada en rodopsina quinasa, la arrestina visual fue bastante potente en la inactivación de la señalización, mientras que las dos β-arrestinas fueron bastante débiles (Fig. 9A). A la inversa, para el receptor β fosforilado de GRK2, las dos β-arrestinas eran muy potentes y la

arrestina era muy débil (Fig. 9B). Estos hallazgos establecieron la similitud de los mecanismos de desensibilización tanto para la rodopsina como para el receptor β, aunque con gran especificidad para la molécula de arrestina involucrada (49). Figura 9. Inhibición del receptor β2-adrenérgico y la función de la rodopsina por la β arrestina 1, la β-arrestina 2 y la arrestina en sistemas reconstituidos. (A) La rodopsina se fosforiló con la rodopsina quinasa. (B) los receptores β2adrenérgicos se fosforilaron con GRK2. La transducina GTPasa estimulada por rodopsina fue inhibida de forma más potente por la arrestina visual (). En contraste, la Gsasa G2 estimulada por el receptor adrenérgico β2 fue mucho más potentemente inhibida por la β-arrestina 1 (●) o la β arrestina 2 (▲). Reproducido con permiso de la referencia 49.

Hoy sabemos que hay cuatro arrestos. Dos de ellos, arrestin1 y X arrestin, se limitan a la retina. Las β Arrestinas 1 y 2, también conocidas como arrestina 2 y 3, se expresan de manera ubicua. Todas las estructuras cristalinas se han resuelto y muestran, en cada caso, una proteína de dos dominios que consiste casi en su totalidad en hojas β antiparalelas conectadas por una región bisagra y estabilizadas por un núcleo polar (50) (Fig. 10).

Figura 10. Las arrestinas. Adaptado de la referencia 50 con permiso. Entonces, donde todo esto nos llevó a mediados de los 90, se ilustra en la Fig. 11. Ilustra los dos paradigmas universales que gobiernan la función de los GPCR y se basa en el entendimiento de que tres familias de proteínas comparten la propiedad notable de poder para interactuar de manera casi universal con los receptores de una forma totalmente agonista o dependiente de estímulos. Estas proteínas son las proteínas G heterotriméricas, las quinasas receptoras acopladas a la proteína G y las β-arrestinas. Después de la estimulación, los receptores activados interactúan con las proteínas G para conducir a la señalización celular a través de una cascada de fosforilaciones. Sin embargo, los receptores activados son reconocidos y fosforilados por los GRK, lo que conduce a la unión de una segunda proteína, la β-arrestina, que luego interrumpe estéricamente la estimulación de la proteína G por el receptor, lo que conduce a la desensibilización y disminución de las respuestas fisiológicas (51). También descubrimos otros mecanismos de retroalimentación que operan para reducir la actividad de señalización del receptor, como la fosforilación de los receptores por quinasas de segundo mensajero como la PKA y la PKC. Pero generalmente no son específicos del receptor (52). Sin embargo, durante los últimos diez años, ha surgido un nuevo paradigma, ya que nos hemos dado cuenta de que el sistema β arrestin-GRK es en realidad multifuncional (Fig. 12). Por lo tanto, no solo desensibiliza la señalización mediada por la proteína G sino que también sirve como un sistema de transducción de

señales por derecho propio. Las β-Arrestinas actúan como adaptadores o andamios que unen los receptores a un número cada vez mayor de moléculas intracelulares (53,54). Aquí se muestran algunas de las vías que se han demostrado en los últimos años, así como las consecuencias fisiológicas celulares resultantes. Los más estudiados a fondo han sido las enzimas MAP quinasas. Las β-arrestinas también median la endocitosis del hoyo recubierta de clatrina al interactuar con una lista creciente de elementos de la maquinaria endocítica (55). Así, las β arrestinas median tres tipos de función, desensibilización, internalización del receptor y señalización.

Figura 11. Activación y desensibilización de GPCRs

Figura 12. Nuevo paradigma para múltiples funciones mediadas por la β-arrestina. Reproducido con permiso de referencia 65.

En el curso del estudio de la señalización mediada por la β-arrestina, hicimos un descubrimiento interesante que ha facilitado enormemente este trabajo y que también puede tener importantes implicaciones terapéuticas. Esto fue de los llamados agonistas sesgados (revisado en 56). Un agonista sesgado es un ligando que estabiliza una conformación activa particular de un receptor, estimulando así algunas respuestas pero no otras. Siete ligandos del receptor transmembrana, por ejemplo, pueden estar sesgados hacia una proteína G particular o una β-arrestina. Los receptores mutados también pueden estar sesgados. En el modelo clásico de dos estados de activación del receptor, los receptores pueden existir como un receptor R inactivo o un receptor R * activo, con agonistas que estabilizan la conformación activa que promueve los efectos celulares. En este modelo, todos los efectos del receptor son una consecuencia de la forma R * activada única del receptor. Sin embargo, la existencia de agonistas sesgados que pueden conducir a la estimulación de la señalización mediada exclusivamente por la proteína G-arrestina o β implica que debe haber múltiples conformaciones activas del receptor (57).

A modo de ilustración, la Fig. 13 muestra algunos datos que comparan la capacidad de tres ligandos para promover la interacción del receptor AT1A de angiotensina con proteínas G (Gq)

o β-arrestina en una línea celular que expresa el receptor (58). La activación de la proteína G se está evaluando mediante un ensayo típico de segundo mensajero y se muestra en rojo, y el reclutamiento de β-arrestina se muestra en negro. El primer panel muestra las curvas de respuesta a la dosis para un agonista completo imparcial típico, la angiotensina en sí misma. Se puede ver que las curvas para la interacción de la proteína G y la β-arrestina son muy similares. Este panel central muestra la situación de un antagonista competitivo clásico que no tiene actividad en ninguno de los ensayos. El tercer panel muestra los datos de un ligando con polarización de β-arrestina completamente, en este caso TRV120027, que es un análogo de octapéptido de la angiotensina. Como puede ver, este ligando no tiene absolutamente ninguna capacidad para activar la señalización de la proteína G, por lo que es un antagonista competitivo clásico para la activación de la proteína G, pero tiene una actividad sustancial para el reclutamiento de la β-arrestina.

Figura 13. Activación de Gq y β arrestina por el receptor de angiotensina AT1a estimulada por varios ligandos. Vea el texto para más detalles. Reproducido con permiso de la referencia 58.

Como señalé, una consecuencia de este reclutamiento de la β arrestina es estimular las vías de señalización, como la kinasa del mapa ERK, de forma paralela y, en algunos casos, completamente independiente de las proteínas G. Con el fin de obtener una visión más global de las consecuencias de la señalización mediada por la β-arrestina, hemos utilizado la espectrometría de masas para cuantificar todos los sitios de fosforilación presentes en las células antes y después de la estimulación del receptor de angiotensina con un agonista sesgado por la β-arrestina que no Activar las proteínas G (59). Como se muestra en la Fig. 14, varias redes de señalización se iluminaron con fosforilación cuando la βarrestina, pero no la proteína G, la señalización mediada se activó de esta manera. Estos incluyeron varios elementos de señalización de MAP quinasa, señalización de PI3 quinasa-AKT, mecanismos de reparación de ADN, ciclo celular y vías de desarrollo y una extensa red de moléculas involucradas en la reorganización del citoesqueleto y la dinámica de la actina. Estos resultados sugieren que la señalización mediada por la β-arrestina es extremadamente diversa e implica la activación de muchas de las mismas vías que pueden activarse a través de las proteínas G. Sin embargo, a menudo con consecuencias celulares muy distintas. Resultados como estos probablemente tengan implicaciones para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Déjame darte varios ejemplos. La angiotensina que actúa a través de los efectos mediados por la proteína G es uno de los vasoconstrictores más potentes conocidos y puede provocar un aumento de la presión arterial. Por el contrario, sus efectos mediados por el arresto β incluyen varios efectos potencialmente beneficiosos, como la citoprotección y los efectos antiapoptóticos (60). Los bloqueadores de los receptores de angiotensina, llamados ARB, se encuentran entre los medicamentos más importantes utilizados en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, específicamente porque bloquean los efectos

hipertensivos de la angiotensina mediados por proteínas G potencialmente dañinos. Sin embargo, también bloquean los efectos mediados por la β-arrestina potencialmente beneficiosos. Supusimos que un ligando del receptor de angiotensina sesgado por β-arrestina que bloquea la señalización mediada por la proteína G al mismo tiempo que estimula los efectos potencialmente beneficiosos de β-arrestin mediated podría representar un tipo novedoso y excepcionalmente eficaz de agente terapéutico. De hecho, un compuesto con tales propiedades, Trevena 120027, retarda la progresión de la insuficiencia cardíaca en animales, disminuye la presión arterial (61) y es antiapoptótico (62). Los ligandos también pueden estar sesgados hacia una proteína G y tales agentes también pueden tener potencial terapéutico. Por ejemplo, la utilidad terapéutica de los opiáceos, los medicamentos más potentes para aliviar el dolor disponibles, está mediada a través de la estimulación de las proteínas Gi a través del receptor opioide μ (63,64), mientras que los efectos secundarios angustiantes del estreñimiento, la depresión respiratoria y la tolerancia, requieren dosis mayores y mayores, están todas mediadas a través de la señalización mediada por β-arrestin2 y se pierden en ratones knockout β-arrestin2 (63,64). Por lo tanto, los ligandos sesgados de la proteína G para el receptor opioide μ deberían aliviar el dolor mientras tienen efectos adversos notablemente reducidos Estos ejemplos de ligandos sesgados de β-arrestina y proteína G demuestran cómo nuestra nueva comprensión de estos dos tipos de vías de señalización, adquirida inicialmente a nivel bioquímico, puede ser potencialmente aprovechada para beneficio terapéutico

More Documents from "yin frits"

Doc2.pdf
December 2019 11
0222222222222222.docx
December 2019 8
Doc8888.pdf
December 2019 11
Malu.docx
December 2019 23
Heart Of Buddha
April 2020 22