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Señalización Celular Por Tirosina Cinasas Receptoras Un gran grupo de genes en todos los eucariotas codifican proteínas que funcionan como receptores de la superficie celular de la membrana. Los receptores de membrana se pueden clasificar en familias distintas en función de los ligandos que reconocen, las respuestas biológicas que inducen y, más recientemente, de acuerdo con sus estructuras primarias. Una gran variedad de ligandos se une y regulan la actividad de los receptores de la superficie celular, incluidas las pequeñas moléculas orgánicas, lípidos, carbohidratos, péptidos y proteínas. Una gran familia de receptores de la superficie celular está dotada de actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa. Estos receptores tirosina quinasas (RTK) catalizan la transferencia del fosfato γ de ATP a los grupos hidroxilo de tirosinas en proteínas diana (Cazador 1998). Los RTK desempeñan un papel importante en el control de la mayoría de los procesos celulares fundamentales, incluido el ciclo celular, la migración celular, el metabolismo celular y la supervivencia, así como la proliferación y diferenciación celular. Todas las tirosinas quinasas receptoras contienen un dominio de unión a ligando extracelular que generalmente está glicosilado. El dominio de unión al ligando está conectado al dominio citoplásmico por una única hélice transmembrana. El dominio citoplásmico contiene un núcleo de proteína tirosina quinasa (PTK) conservada y secuencias reguladoras adicionales que se someten a autofosforilación y fosforilación por proteínas quinasas heterólogas (40, 39). Las linfocinas, como la eritropoyetina y el interferón, también median sus respuestas mediante la fosforilación de la tirosina. Sin embargo, en lugar de contener una actividad de proteína tirosina quinasa intrínseca, los dominios citoplásmicos relativamente cortos de estos receptores interactúan a través de interacciones no covalentes con miembros de la familia Jak de tirosina quinasas no receptoras (14, 43). Aparte de la falta de enlace covalente a una quinasa, el mecanismo de activación de estos receptores binarios se asemeja en gran medida al de las tirosina quinasas receptoras (60, 33, 45). El propósito de esta revisión es describir los conceptos generales que subyacen al mecanismo de acción de los RTK y las vías de señalización que regulan, al tiempo que intentan arrojar luz sobre la cuestión de cómo se define la especificidad por la acción de los RTK y cómo una respuesta biológica específica puede ser generado por la diversidad de vías de señalización activadas por todos los RTK.

Paradigmas para la activación del receptor Con la excepción de la familia de receptores de insulina (IR) de RTK, todos los RTK conocidos (por ejemplo, receptor de EGF, receptor de PDGF) son monómeros en la membrana celular. La unión del ligando induce la dimerización de estos receptores dando como resultado la autofosforilación de sus dominios citoplásmicos (84, 60, 45). Los miembros de la familia IR son dímeros unidos por enlaces disulfuro de dos cadenas polipeptídicas que forman un heterodímero α 2 β 2 (Van-Obberghen 1994). La unión de la insulina al dominio extracelular del IR induce un reordenamiento en la estructura heterotetramérica cuaternaria que conduce a un aumento de la autofosforilación del dominio citoplásmico. Como las formas activas del receptor de insulina y las RTK monoméricas son ambas diméricas, es probable que los mecanismos de señalización de los dos tipos de receptores sean muy similares (Hubbard et al. 1998). Activación por Dimerización Aunque todos los RTK se activan por dimerización, diferentes ligandos emplean diferentes estrategias para inducir el estado dimérico activo. Los estudios estructurales de la hormona del crecimiento (GH) en complejo con receptor de GH (GHR) y eritropoyetina (EPO) en complejo con receptor de EPO (EPOR) muestran que estas citoquinas son bivalentes, y un ligando se une simultáneamente a dos moléculas receptoras para formar un 1: 2 (ligando: receptor) complejo(55, 45). La dimerización del receptor se estabiliza aún más mediante interacciones adicionales receptor: receptor. varios factores de crecimiento son homodímeros (por ejemplo, VEGF, PDGF) que proporcionan el mecanismo más simple para la dimerización del receptor inducida por ligando. Los receptores

de VEGF (VEGFR) contienen siete dominios similares a inmunoglobulina (Ig) en su dominio extracelular, de los cuales solo se requieren los dominios de Ig 2 y 3 para la unión al ligando. La estructura cristalina de VEGF en complejo con el dominio 2 similar a Ig del VEGFR flt1 proporciona una vista de la dimerización del receptor inducida por ligando (Wiesmann et al. 1997). La estructura muestra que una molécula receptora se une en cada una de las dos uniones entre los protómeros de VEGF para producir un complejo que es casi 2 veces simétrico, y contiene dos protómeros de VEGF más los dos dominios similares a Ig. La familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) consta de al menos 21 factores de crecimiento relacionados (Maski y Ornitz1998). Los FGF no pueden activar los receptores de FGF (FGFR) sin la cooperación de la molécula accesoria proteoglicano sulfato de heparina (HSPG) ( Yayon et al. 1991). Las estructuras cristalinas de FGF en complejo con el dominio de unión a ligando de FGFR (que consiste en los dominios de tipo Ig-2 [D2] y -3 [D3]) proporcionan una vista molecular de la dimerización de FGFR (78, 86) y la activación e ilustran los determinantes que rigen la especificidad de FGF: FGFR (Plotnikov et al. 2000). Cada estructura muestra un complejo 2: 2 FGF: FGFR, en el que FGF interactúa ampliamente con D2, D3 y con el enlazador que conecta estos dos dominios dentro de un receptor (el sitio de unión primario). El dímero se estabiliza por un sitio de unión secundario que involucra interacciones entre FGF y D2 del segundo receptor en el complejo, así como también por interacciones receptor: receptor. En contraste con el homodímero de VEGF unido por disulfuro, las dos moléculas de FGF en el complejo 2: 2 FGF: FGFR no hacen ningún contacto. De hecho, las interacciones entre FGF y FGFR por sí solas no son suficientes para estabilizar los dímeros de FGFR en la superficie celular en condiciones fisiológicas normales. Los proteoglicanos de heparina o sulfato de heparano son esenciales para la dimerización estable de los complejos FGF: FGFR (Spivak-Kroizman et al. 1994). Se ha demostrado que la heparina se une a un cañón cargado positivamente formado por un grupo de residuos de Lys y Arg expuestos que se extienden a través de los dominios D2 de los dos receptores en el dímero y las moléculas de FGF unidas adyacentes (Schlessinger et al.2000). El FGFR de longitud completa contiene un dominio similar a Ig (D1) y un tramo de residuos ácidos o "caja de ácido" en el enlazador entre D1 y D2. Ni D1 ni la caja de ácido se requieren para la unión de FGF a FGFR. De hecho, la eliminación de D1 y la caja de ácido mejora la unión del receptor a FGF y heparina (Wang et al. 1995). Estudios recientes que hemos llevado a cabo nos llevan a proponer que D1 y la caja de ácido en el FGFR de longitud completa tienen una función autoinhibitoria (Plotnikov et al. 1999). Se cree que la caja de ácido puede unirse intramolecularmente al sitio de unión a heparina en D2, compitiendo con la heparina por la unión a este sitio. De manera similar, D1 puede interactuar intramolecularmente con el dominio de unión a ligando en D2 y D3 y, por lo tanto, interferir con la unión de FGF a FGFR. Esta autoinhibición evitaría la activación accidental de FGFR independiente de FGF por HSPG que son abundantes en la matriz extracelular y en las superficies celulares. Según este punto de vista, el dominio extracelular de FGFR tiene una función autorreguladora además de sus funciones en el reconocimiento de ligandos y la dimerización del receptor. Un mecanismo similar de autoinhibición puede solicitar otras RTK que contienen múltiples dominios similares a Ig en sus dominios extracelulares (por ejemplo, PDGFR, VEGFR). Como solo 2 de los 5 dominios similares a Ig de PDGFR, y solo 2 de los 7 dominios de señal tipo Ig de VEGFR son esenciales para la unión a ligandos, es posible que los dominios similares a Ig no involucrados en la unión a ligandos puedan desempeñar un papel autorregulador en estos receptores. El control de la estimulación de FGFR por dos ligandos, FGF y heparina, puede proporcionar un mecanismo para la activación localizada de FGFR y la estimulación vectorial de la proliferación o diferenciación celular. La biosíntesis de HSPG en áreas restringidas de la matriz extracelular de diferentes tejidos puede proporcionar un andamio al cual las células que expresan FGFR migrarán y en las cuales estas células sobrevivirán, proliferarán o experimentarán diferenciación cuando se les suministre una molécula de FGF específica. De hecho, se demostró que FGF8 y FGFR1 son esenciales para la migración celular y el patrón mesodérmico durante la gastrulación (106, 92). Recientes estudios bioquímicos y estructurales y experimentos anteriores con anticuerpos antireceptores monoclonales han demostrado que solo ciertas formas de dímeros de receptores con configuraciones únicas de los dominios extracelular y citoplásmico de los RTK y los receptores de citoquinas conducen a la autofosforilación trans y a la estimulación de PTK (60, 45). La Figura 1 muestra un modelo de cómo las RTK monoméricas ( Figura 1A ) (por ejemplo, EGFR, VEGFR)

o las RTK heterotetraméricas con puentes disulfuro ( Figura 1B)) (por ejemplo, IR, IGF1R) están activados. Se cree que los monómeros del receptor están en equilibrio con los dímeros del receptor. Existe una población limitada de dímeros receptores con estructuras cuaternarias de sus dominios extracelular y citoplásmico en configuraciones que son compatibles con transautofosforilación y estimulación de la actividad de PTK (dímero activo). La unión del ligando al dominio extracelular estabiliza la formación de dímeros activos y, en consecuencia, la estimulación con PTK. Proponemos que los dímeros activos existen incluso en ausencia de unión al ligando, ya que la autofosforilación de RTK puede potenciarse mediante inhibidores de la proteína tirosina fosfatasas o por sobreexpresión del receptor incluso en ausencia de unión del ligando. Figura 1. Unión de ligandos estabiliza la formación de dímeros activados (A) Los monómeros de receptores inactivos (verdes) están en equilibrio con los dímeros de receptores inactivos (verdes) o activos (azules). Los dímeros de receptores activos existen en una conformación compatible con la autofosforilación trans y la estimulación de la actividad de PTK (azul). La unión de ligandos estabiliza la formación de dímeros activos y, por tanto, la activación de PTK. (B) Los dímeros del receptor de insulina (IR) con puente disulfuro inactivo (verde) están en equilibrio con los dímeros activos (azul). La unión a la insulina estabiliza el estado dimérico activo que conduce a la activación de PTK.

Figura 1: La unión de ligandos estabiliza la formación de dímeros activados El papel del receptor de heterooligomerización La familia EGFR consta de cuatro RTK, EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 y ErbB4. Mientras que EGFR tiene numerosos ligandos (por ejemplo, EGF, TGFα, HB-EGF), no se ha identificado un ligando para ErbB2. Los ligandos para ErbB3 y ErbB4, los otros dos miembros de esta familia RTK, son las diversas isoformas de las neuregulinas (NRG). Hace más de una década se demostró que la estimulación de EGFR inducida por EGF conduce a la activación de ErbB2 por transducción a través de heterooligomerización (52, 90, 100). Posteriormente, numerosos estudios han demostrado que la estimulación con EGF o NRG induce una hetero-oligomerización combinatoria de diferentes pares de miembros de la familia EGFR (10, 60, 74). En ausencia de un ligando específico para ErbB2, se propuso que este RTK puede funcionar como un socio heterodimérico de los otros miembros de la familia y podría proporcionar una plataforma adicional

para el reclutamiento de vías de señalización intracelular en respuesta a la estimulación con EGF o NRG. Además, dado que la secuencia del dominio catalítico ErbB3 sugiere que este receptor no tiene actividad PTK, se cree que ErbB3 puede funcionar como una plataforma para expandir el repertorio de proteínas de señalización intracelular reclutadas después de su transfosforilación por otros miembros del EGFR. familia (Carraway y Cantley 1994). En ausencia de información estructural sobre EGFR, es difícil presentar una imagen molecular clara con respecto al mecanismo de dimerización del receptor y heterooligomerización. Los estudios biofísicos han sugerido que EGF es bivalente hacia EGFR y demostraron que EGF puede conducir a la dimerización del dominio extracelular de EGFR que termina con una estequiometría de 2: 2 EGF: EGFR (63, 25). Se ha propuesto que la bivalencia de EGF o NRG es la fuerza impulsora para la heterodimerización de ErbB2 con otros miembros de la familia EGFR (Tzahar et al. 1997). Sin embargo, en la actualidad no hay evidencia de unión de EGF o NRG al dominio extracelular de ErbB2 (Ferguson et al. 2000). El mecanismo exacto de dimerización dependiente de ligando de los miembros de la familia EGFR debe esperar la determinación de las estructuras tridimensionales de estos complejos. Un mecanismo alternativo es que dos homodímeros receptores forman un heterodímero. Figura 2muestra un mecanismo potencial para la formación de heterotetrámero inducida por EGF entre EGFR y ErbB2. De acuerdo con este escenario, los homodímeros inducidos por EGF forman un complejo tetramérico con homodímeros no ocupados de ErbB2 por interacciones receptor-receptor. Las interacciones entre los dos homodímeros en el contexto de un heterotetrámero podrían servir para estabilizar la formación de un dímero indirectamente por la unión del factor de crecimiento. Por ejemplo, la unión de dos proteínas ErbB2 monoméricas a un homodímero de EGFR inducido por EGF puede causar la homodimerización de las moléculas de ErbB2 seguida de su autofosforilación trans y la consiguiente activación (35, 80, 29, 36). El mecanismo de formación de heterotetrámero entre ErbB3 y ErbB4 puede ser diferente, ya que ambos receptores se unen a NRG y pueden experimentar homodimerización dependiente de NRG ( Figura 2). En este caso, los homodímeros de ErbB3 pueden interactuar con los homodímeros de ErbB4 inducidos por NRG, que a su vez fosforilarán los dominios citoplásmicos de las proteínas ErbB3 por trans-fosforilación. En otras palabras, los homodímeros de ErbB3 pueden de hecho ser sustratos preferidos de ErbB4 dentro del contexto de un complejo heterotetramérico. Figura 2. Activación de miembros de la familia EGFR por la formación de hetero-tetrámero (A) La unión a EGF induce la formación de homodímeros de EGFR activados (azul) (paso 1). La unión de dos proteínas de ErbB2 (verde) monoméricas (paso 2) a un dímero de EGFR activado (azul) induce la homodimerización de las moléculas de ErbB2 (cian) seguida de autofosforilación y activación de ErbB2 (paso 3). (B) Un esquema general para la activación de miembros de la familia EGFR por formación de hetero-tetrámero (EGFR 5 B1, ErbB2 5 B2, ErbB3 5 B3 y ErbB4 5 B4). (1) Formación de heterotetramero entre un homodímero de EGFR inducido por EGF (B1) y dos moléculas de ErbB2 (B2). Dos moléculas de ErbB2 se dimerizan mediante la unión a un dímero de EGFR activado (como en el panel A). Las flechas marcan la autofosforilación entre dos EGFR (B1) o entre dos moléculas de ErbB2 (B2). Las flechas rotas marcan la transfosforilación potencial entre B1 y B2 o entre B2 y B1. (2) Formación de hetero-tetramer entre un homodímero de EGFR inducido por EGF (B1) y un homodímero de ErbB3 inducido por NRG (B3). Las flechas marcan la autofosforilación de B1 y la transfosforilación de B3 por B1. (3) Formación de hetero-tetramer entre un homodímero ErbB3 inducido por NRG (B3) y un homodímero ErbB4 inducido por NRG (B4). Las flechas marcan la autofosforilación de B4 y la transfosforilación de B3 por B4. (4) Formación de hetero-tetramero entre un homodímero de EGFR inducido por EGF (B1) y un homodímero de ErbB4 inducido por NRG (B4). Las flechas marcan la autofosforilación de B1 y B4. Las flechas rotas marcan el potencial de transfosforilación entre B1 y B4 o entre B4 y B1.

Figura 2 Activación de miembros de la familia EGFR por formación de hetero-tetrámero Los estudios estructurales del núcleo catalítico de varias RTK, junto con los estudios bioquímicos y cinéticos de la fosforilación y activación del receptor, han proporcionado información sobre el mecanismo mediante el cual la dimerización de RTK activa la actividad enzimática (38, 73, 37). La imagen emergente es que la oligomerización del receptor aumenta la concentración local de la PTK, lo que lleva a una transfosforilación más eficiente de los residuos de tirosina en el bucle de activación del dominio catalítico (Hubbard et al. 1998). Los estudios estructurales han demostrado que, tras la fosforilación de la tirosina, el bucle de activación adopta una configuración "abierta" que permite el acceso a ATP y sustratos, y permite la fosfotransferencia de MgATP a las tirosinas en el propio receptor y en las proteínas celulares involucradas en la transmisión de señales.

Mecanismo de activación de proteínas de señalización. Además de su papel central en el control de la proteína tirosina quinasa, la autofosforilación de tirosina de RTK es crucial para el reclutamiento y activación de una variedad de proteínas de señalización. La mayoría de los sitios de autofosforilación de tirosina se encuentran en regiones no catalíticas de la molécula receptora. Estos sitios funcionan como sitios de unión para los dominios SH2 (homología de Src 2) o PTB (unión a fosfotirosina) de una variedad de proteínas de señalización. La unión mediada por el dominio SH2 de proteínas de señalización a sitios de autofosforilación de tirosina proporciona un mecanismo para el ensamblaje y reclutamiento de complejos de señalización por las tirosina quinasas receptoras activadas. Según este punto de vista, cada RTK debe considerarse no solo como un receptor con actividad tirosina quinasa sino también como una plataforma para el reconocimiento y reclutamiento de un complemento específico de proteínas de señalización (Pawson y Schlessinger 1993). Dominios modulares de las proteínas de señalización Las proteínas de señalización que contienen dominios SH2 y PTB son de naturaleza modular (57, 77, 69). Muchas de estas proteínas contienen actividades enzimáticas intrínsecas y módulos de proteínas que producen interacciones con otras proteínas, con fosfolípidos o con ácidos nucleicos. Los módulos de proteínas involucrados en los procesos de señalización celular varían en tamaño desde 50 a 120 aminoácidos. La Figura 3 muestra varios módulos de proteínas que han demostrado estar involucrados en la señalización celular aguas abajo de los RTK y otros receptores de la superficie celular. Los dominios SH2 se unen específicamente a distintas secuencias de aminoácidos definidas por 1 a 6 residuos C-terminal al resto pTyr (Songyang et al. 1993), mientras que los dominios PTB se unen a pTyr dentro del contexto de secuencias

específicas de 3 a 5 residuos en su extremo N (Margolis 1999). Ciertos dominios PTB se unen a secuencias peptídicas no fosforiladas, mientras que otros reconocen igualmente bien tanto las secuencias que contienen fosfotirosina como las que no contienen fosforilación (Margolis 1999). Los dominios SH3 se unen específicamente al motivo de secuencia rica en prolina PXXP, mientras que los dominios WW se unen preferentemente a otro motivo rico en prolina PXPX (Kuriyan y Cowburn 1997). Los dominios de homología de Pleckstrin (PH) comprenden una gran familia de más de cien dominios. Mientras que ciertos dominios de PH se unen específicamente a PtdIns (4,5) P 2 , otro subconjunto de dominios de PH se une preferentemente a los productos de fosfoinositido-3-quinasas (quinasa PI-3) inducida por agonistas (24, 61, 62, 13). Como solo un pequeño subconjunto de dominios de PH se une específicamente a los fosfoinositidos o a sus grupos principales solubles, los ligandos fisiológicos de la mayoría de los dominios de PH aún no se han identificado. Sin embargo, la unión débil y no específica de la mayoría de los dominios de PH a los fosfoinositidos puede compensarse por la naturaleza oligomérica de ciertas proteínas que contienen dominios de PH que conducen a una fuerte asociación de membrana (Lemmon y Ferguson 2000). Finalmente, los dominios FYVE comprenden otra familia de módulos de proteínas pequeñas que reconocen específicamente PtdIns-3-P (Fruman et al. 1999), y los dominios PDZ pertenecen a otra gran familia de módulos de proteínas independientes que se unen específicamente a residuos hidrófobos en los extremos C de sus proteínas objetivo (Gomperts 1996) Una gran familia de proteínas que contienen el dominio SH2 posee actividades enzimáticas intrínsecas, como la actividad de la PTK (quinasas Src), la actividad de la proteína tirosina fosfatasa (PTP) (Shp2), la actividad de la fosfolipasa C (PLCγ) o la actividad de Ras-GAP entre otras actividades. Otra familia de proteínas contiene solo dominios SH2 o SH3. Estas proteínas adaptadoras (por ejemplo, Grb2, Nck, Crk, Shc) utilizan sus dominios SH2 y SH3 para mediar en las interacciones que unen diferentes proteínas involucradas en la transducción de señales. Por ejemplo, la proteína adaptadora Grb2 conecta una variedad de receptores de superficie a la cascada de señalización de la quinasa Ras / MAP. Grb2 interactúa con las RTK activadas a través de su dominio SH2 y recluta el factor de liberación de nucleótido de guanina Sos cerca de su proteína objetivo Ras en la membrana celular (85, 75). Figura 3. Módulos de proteínas y proteínas de acoplamiento que participan en la señalización mediante receptores de tirosina quinasas (A) Módulos de proteínas implicados en el control de las vías de señalización intracelular. Las RTK activadas, fosforiladas en tirosina, forman un complejo con los dominios SH2 y PTB de las proteínas de señalización. Los dominios SH2 se unen a los sitios pTyr en los receptores activados, mientras que los dominios PTB se unen a las regiones fosforiladas y no fosforiladas de tirosina en los RTK. Los dominios de PH se unen a diferentes fosfoinositidos que conducen a la asociación de membrana. Los dominios SH3 y WW se unen a secuencias ricas en prolina en proteínas diana. Los dominios PDZ se unen a residuos hidrófobos en los extremos C de las proteínas diana. Los dominios FYVE se unen específicamente a PdtIns (3) P. Mientras que las proteínas adaptadoras como Grb2 o Nck contienen solo los dominios SH2 y SH3, otras proteínas de señalización contienen actividades enzimáticas adicionales como las proteínas quinasas (Src, PKB), la PTPasa (Shp2) fosfolipasa C (PLCg), Ras-GAP o Rho-GRF ( Vav). (B) Proteínas de acoplamiento que funcionan como plataformas para el reclutamiento de proteínas de señalización. Todas las proteínas de acoplamiento contienen una región de direccionamiento de membrana en sus extremos N. FRS2 se dirige a la membrana por miristoilación, y LAT se dirige a la membrana celular por un dominio transmembrana (TM) y por paltotolación. La mayoría de las proteínas de acoplamiento están dirigidas a la membrana celular por sus dominios PH. Las proteínas de acoplamiento contienen múltiples sitios de fosforilación de pTyr que funcionan como sitios de unión para los dominios SH2 de una variedad de proteínas de señalización.

Proteínas de acoplamiento El reclutamiento de membrana inducido por agonistas de las proteínas de señalización estimuladas por la fosforilación de tirosina también está mediado por una familia de proteínas de acoplamiento. La figura 3 muestra un diagrama esquemático de varias proteínas de acoplamiento. Todas las proteínas de acoplamiento contienen en su extremo N una señal de direccionamiento de membrana y en su extremo C una gran región que contiene múltiples sitios de unión para los dominios SH2 de las proteínas de señalización (91, 56). Algunas proteínas de acoplamiento están asociadas con la membrana celular por un anclaje de miristilo (por ejemplo, FRS2), mientras que otras tienen su propio dominio transmembrana (por ejemplo, LAT) (Zhang et al. 1998a). Sin embargo, la mayoría de las proteínas de acoplamiento contienen un dominio PH en su extremo N. Las proteínas de acoplamiento como Gab1 se asocian con la membrana celular mediante la unión de su dominio PH a PtdIns (3,4,5) P 3 en respuesta a la estimulación inducida por agonistas de la PI-3 quinasa (Rodrigues et al.2000). Además de la señal de direccionamiento de membrana, la mayoría de las proteínas de acoplamiento contienen dominios específicos como los dominios PTB que son responsables de la formación de complejos con un conjunto particular de receptores de la superficie celular. Los dominios PTB de IRS1 e IRS2, por ejemplo, se unen específicamente a IR, IGF1-R o IL4-R. Los dominios PTB de FRS2α y FRS2β, por otro lado, se unen preferentemente a FGFR o NGFR. Se ha demostrado que las proteínas de acoplamiento funcionan como plataformas para el reclutamiento de proteínas de señalización en respuesta a la estimulación del receptor. De hecho, la mayoría de las proteínas de señalización que se activan en respuesta a la estimulación con insulina o FGF se reclutan a través de las familias de proteínas de acoplamiento IRS o FRS y no por su unión directa a IR o FGFR. Paradigmas para la activación de proteínas efectoras Aunque muchas proteínas sirven como sustratos de, y son activadas por, RTKs, parece que hay tres mecanismos generales diferentes de cómo se activan las proteínas de señalización en respuesta a la estimulación de RTK. La Figura 4resume tres sistemas efectores que ejemplifican estos paradigmas no mutuamente exclusivos para la activación de proteínas efectoras por RTK.

Figura 4 Paradigmas para la activación de proteínas de señalización en respuesta a la activación RTK

Figura 4. Paradigmas para la activación de proteínas de señalización en respuesta a la activación de RTK Se requieren al menos dos eventos moleculares separados para la activación inducida por RTK de moléculas de señalización. Como muchas dianas proteicas de las RTK están ubicadas en la membrana celular, la translocación a la membrana celular es esencial para la activación de muchas proteínas efectoras. (A) Activación de PKB (también conocida como Akt) por translocación de membrana. PtdIns (3,4,5) P3 generado en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento sirve como un sitio de unión para los dominios PH de PDK1 y PKB. La translocación de la membrana se acompaña de la liberación de una autoinhibición que conduce a la activación de las actividades de la quinasa PDK1 y PKB. La activación completa de PKB requiere la fosforilación por PDK1 (y también por PDK2?). La PKB activada fosforila una variedad de proteínas diana que previenen la muerte apoptótica y regulan varios procesos metabólicos. (B) Activación por un cambio conformacional. La unión de los dominios SH2 de p85, la subunidad reguladora de la PI-3 quinasa a los sitios pTyr en receptores activados, libera una restricción autoinhibitoria que estimula el dominio catalítico (p110). PI-3 cinasa cataliza la fosforilación de las 39 posiciones del anillo de inositol de PtdIns (4) P y PtdIns (4,5) P2 para generar PtdIns (3,4) P2 y PtdIns (3,4,5) P3, respectivamente . (C) Activación por fosforilación de tirosina. La unión de los dominios SH2 de PLCg a sitios pTyr en receptores activados facilita la fosforilación de tirosina de PLCg así como la translocación de membrana; un proceso mediado en parte por la unión del dominio PH a los productos de la PI-3 quinasa. La fosforilación de la tirosina es esencial para la activación de PLCg que conduce a la hidrólisis de PtdIns (4,5) P2 y la generación de los dos segundos mensajeros Ins (1,4,5) P3 y diaciglicosol.

Activación por Translocación de Membrana. La activación de la PI-3 quinasa inducida por PDGF conduce a la generación de los segundos mensajeros PtdIns (3,4) P 2 y PtdIns (3,4,5) P 3 . La generación de estos segundos mensajeros desempeña un papel crucial en la activación de PDK1 y PKB (también conocida como AKT), dos proteínas quinasas altamente conservadas que desempeñan un papel importante en la estimulación de la supervivencia celular, la síntesis de proteínas y los procesos metabólicos ( Figura 4A ) . PDK1 tiene un dominio PH en el término C de la proteína a través del cual se une a PtdIns (3,4,5) P 3 que conduce a la translocación de membrana (1, 2). PKB, que también se recluta a la membrana a través de su dominio del dominio PH N-terminal a los productos de la quinasa PI-3 (26, 27), está fosforilada por PDK1 en Thr308 en su bucle de activación. Se ha propuesto que una proteína quinasa aún no identificada (PDK2 hipotética) es responsable de la fosforilación de PKB en Ser473 que conduce a la estimulación completa de la actividad de PKB. Sin embargo, recientemente se informó que la fosforilación de Ser473 está mediada por la autofosforilación PKB (95, 96[este número de Cell ]). Activación por un cambio conformacional. Existe buena evidencia de que la unión mediada por el dominio SH2 de ciertas proteínas de señalización a las fosfotirosinas en los receptores activados induce un cambio conformacional que libera una autoinhibición que resulta en la estimulación de la actividad enzimática. Por ejemplo, la actividad de la proteína tirosina quinasa de Src se activa cuando su dominio SH2 se une a los sitios de autofosforilación de tirosina en PDGFR (94, 105). De manera similar, la unión de p85, la subunidad reguladora de la PI-3 quinasa, a las fosfotirosinas en el PDGFR o IRS1 causa cambios conformacionales en la p85 que se transmiten a la subunidad catalítica p110, lo que lleva a un aumento de la actividad de la quinasa PI-3 ( Figura 4B ). Además, al unirse a PDGFR o IRS1 fosforilada en tirosina, la PI-3 quinasa se transloca a la membrana celular donde se encuentra su sustrato PtdIns (4,5) P 2 . Activación por Fosforilación de Tirosina. Se ha demostrado que la fosforilación de tirosina de ciertas proteínas diana es necesaria para la estimulación por ligando de su actividad enzimática ( Figura 4C ). En respuesta a la activación del receptor de EGF, PDGF o FGF, los dominios SH2 de PLCγ se unen a fosfotirosinas específicas en las colas C-terminales de estos receptores. La unión de PLCγ al receptor activado facilita su eficiente fosforilación de tirosina por el RTK. La activación de la actividad de la fosfolipasa C inducida por PDGF se abroga en células que expresan PLCγ mutado en los sitios de fosforilación de tirosina ( Kim et al. 1991). La activación de PLCγ también depende de la generación inducida por agonistas de productos de PI-3 quinasa. Tanto la fosforilación de tirosina como la translocación de membrana de PLCγ mediante la unión de su dominio PH a PtdIns (3,4,5) P 3 son esenciales para la activación completa de la actividad de la fosfolipasa-C que conduce a la generación de los dos segundos mensajeros diacilglicerol e Ins (1, 4,5) P 3 (Falasca et al. 1998).

Como muchos de los objetivos de los RTK están ligados a la membrana, la translocación de la membrana de los componentes de señalización clave es crítica en el proceso de transducción de la señal. Al menos dos eventos moleculares deben tener lugar antes de que se produzca la activación inducida por agonistas de cada una de las proteínas efectoras descritas en la Figura 4 . La activación de PKB, por ejemplo, requiere la translocación a la membrana plasmática y la fosforilación por PDK1 en un residuo clave de Thr. Además, se propuso que la translocación de PKB a la membrana celular esté acompañada por la liberación de una autoinhibición, lo que sugiere que también puede tener lugar un cambio conformacional en PKB y puede ser necesario para la fosforilación por PDK1 y para la activación de la quinasa ( Figura 4A). La activación de la PI-3 quinasa inducida por PDGF está mediada por un cambio conformacional en la PI-3 quinasa inducida por la unión de p85 a los sitios pTyr en PDGFR activados ( Figura 4B ). La estimulación de PLCγ, por otro lado, depende tanto de la fosforilación de tirosina como de la activación de la quinasa PI-3 ( Figura 4C ). La translocación de membrana es esencial para la activación de la cinasa PI-3 y PLCγ, ya que PtdIns (4,5) P 2 , el sustrato de estas dos enzimas se encuentra en la membrana celular. Vías de señalización intracelular El rápido progreso en la comprensión de las vías de señalización intracelular que tuvieron lugar durante la década de 1990 se debió en gran medida a la convergencia de la información generada por múltiples disciplinas científicas. Proteínas similares fueron identificadas repetidamente aplicando metodologías totalmente diferentes. Se han descubierto componentes clave de las vías de señalización en estudios bioquímicos en los que las proteínas celulares se aislaron, clonaron y analizaron. El invertebrado C. elegans y DrosophilaSe han encontrado homólogos de las mismas proteínas en pantallas genéticas. Además, en muchos casos, las mismas proteínas se han identificado como productos de genes que están mutados en diferentes enfermedades humanas, como el cáncer, los trastornos óseos graves, las inmunodeficiencias y las enfermedades neurológicas. Está empezando a surgir una imagen con respecto a los diferentes componentes de varias vías de transducción de señales y redes de señalización que son activadas por los receptores de la superficie celular ( Figura 5 ). Los principios generales que gobiernan el flujo de información espaciotemporal de la superficie celular al núcleo, y los modos de comunicación entre las diferentes vías de señalización se están revelando.

Figura 5 Vías de señalización activadas por RTKs

Figura 5. Vías de señalización activadas por RTK (A) Las diferentes vías de señalización se presentan como distintos casetes de señalización (cajas de colores). En varios casos, los casetes de señalización no incluyen todos los componentes conocidos de una ruta determinada. También se muestran ejemplos de señales estimulantes e inhibitorias para las diferentes vías. Por ejemplo, además de la activación de la cascada de señalización MAP quinasa, Ras activa la quinasa PI-3 y Cdc42. La estimulación de la PI-3 quinasa conduce a la activación de PDK1 y PKB, dos quinasas que regulan diversos procesos metabólicos y previenen la muerte apoptótica. Además, la activación de la PI-3 quinasa estimula la generación de peróxido de hidrógeno que a su vez oxida y bloquea la acción de una proteína inhibitoria tirosina fosfatasa (PTP). Los casetes de señalización presentados en la figura regulan la actividad de múltiples objetivos citoplásmicos. Sin embargo, las vías de señalización de Ras / MAP, STAT, JNK y PI-3 cinasa también regulan la actividad de los factores transcripcionales por fosforilación y por otros mecanismos. (B) Mecanismos para la atenuación y terminación de la activación de RTK. En varios casos, la actividad de las RTK puede ser regulada negativamente por los antagonistas de ligando o por hetero oligomerización con variantes de receptores de interferencia dominantes que ocurren naturalmente. La actividad PTK de EGFR se atenúa por la fosforilación inducida por PKC en la región de yuxtamembrana. La desfosforilación de residuos de pTyr reguladores clave por las proteínas tirosina fosfatasas (PTP) puede inhibir la actividad de la quinasa o eliminar los sitios de acoplamiento. Un mecanismo importante para la terminación de la señal es a través de la endocitosis y degradación del receptor. La proteína oncogénica Cbl se une a los sitios pTyr en RTK activados a través de su dominio similar a SH2. El dominio de dedo RING de Cbl funciona como una ubiquitina-ligasa que conduce a la ubiquitinación y degradación del receptor por el proteosoma.

La cascada de señalización Ras / MAP quinasa Todos los RTK y muchos otros receptores de la superficie celular estimulan el intercambio de GTP por el GDP en la proteína G pequeña Ras. Tanto los estudios bioquímicos como los genéticos han demostrado que Ras está activado por el factor de intercambio de nucleótidos guanina, Sos. La proteína adaptadora Grb2 juega un papel importante en este proceso al formar un complejo con Sos a través de sus dominios SH3. El complejo Grb2 / Sos se recluta en una RTK activada a través de la unión del dominio SH2 de Grb2 a los sitios pTyr específicos del receptor, lo que permite trasladar el Sos a la membrana plasmática donde está cerca de Ras y puede estimular el intercambio de GTP por el GDP (85, 75, 5[este número de Cell ]). El reclutamiento de membrana de Sos también se puede lograr mediante la unión de Grb2 / Sos a Shc, otra proteína adaptadora que forma un complejo con muchos receptores a través de su dominio PTB (Margolis 1999). Alternativamente, los complejos de Grb2 / Sos pueden reclutarse a la membrana celular mediante la unión a proteínas de acoplamiento ligadas a la membrana, como IRS1 o FRS2α, que se fosforilan en tirosina en respuesta a la activación de ciertos RTK (91, 56). También hay evidencia de que el dominio PH de Sos es esencial para la translocación de membrana y para la activación completa de Ras. Una vez en el estado de unión a GTP activo, Ras interactúa con varias proteínas efectoras como la quinasa Raf y PI-3 para estimular numerosos procesos intracelulares. Raf activado estimula la MAP-quinasa-quinasa (MAPKK, MEK) mediante la fosforilación de un residuo clave de Ser en el bucle de activación. MAPKK luego fosforila MAPK (ERK) en los residuos Thr y Tyr en el bucle de activación que conduce a su activación. La MAPK activada fosforila una variedad de sustratos citoplásmicos y ligados a la membrana (por ejemplo, EGFR, Sos). Además, MAPK se traslada rápidamente al núcleo donde fosforila y activa los factores de transcripción (50, 41). El casete de señalización compuesto por MAPKKK, MAPKK y MAPK está altamente conservado en la evolución y existen varias cascadas MAPK en levaduras, en invertebrados y vertebrados(102, 66, 30). Estas cascadas de señalización altamente conservadas desempeñan un papel importante en el control de los procesos metabólicos, el ciclo celular, la migración celular y la forma celular, así como en la proliferación y diferenciación celular (Davis 2000 [este número de Cell ]). Metabolismo de fosfoinositol y señalización celular La activación de los RTK conduce a una rápida estimulación del metabolismo del fosfoinositol y la generación de segundos mensajeros múltiples (81, 13). PLCγ es rápidamente reclutado por una RTK activada a través de la unión de sus dominios SH2 a los sitios pTyr en las moléculas

receptoras. Tras la activación, PLCγ hidroliza su sustrato PtdIns (4,5) P 2 para formar dos segundos mensajeros, diacilglicerol e Ins (1,4,5) P 3 . Al unirse a receptores intracelulares específicos, Ins (1,4,5) P 3 estimula la liberación de Ca 2+ de las tiendas intracelulares. El Ca 2+luego se une a la calmodulina, que a su vez activa una familia de proteínas quinasas dependientes de Ca 2+ / calmodulina. Además, tanto el diacilglicerol como el Ca 2+ activan a los miembros de la familia de proteínas quinasas PKC. Los segundos mensajeros generados por PtdIns (4,5) P 2. la hidrólisis estimula una variedad de respuestas intracelulares además de la fosforilación y activación de factores transcripcionales (50, 41). La fosfolípido quinasa PI-3 quinasa se activa prácticamente en todas las RTK. Un grupo de PI-3 quinasas son heterodímeros compuestos por una subunidad reguladora p85, que contiene dos dominios SH2 y uno SH3 y una subunidad catalítica designada p110. Al igual que otras proteínas que contienen el dominio SH2, la PI-3 cinasa forma un complejo con sitios pTyr en receptores activados o con proteínas de acoplamiento fosforiladas en tirosina, como IRS1 y Gab1. La cinasa PI-3 activada fosforila los PtdIns (4) P y PtdIns (4,5) P 2 para generar los segundos mensajeros PtdIns (3,4) P 2 y PtdIns (3,4,5) P 3 . PtdIns (3,4,5) P 3 media la translocación de la membrana de una variedad de proteínas de señalización, como las proteínas tirosina quinasas no receptoras Btk e Itk, las Ser / Thr quinasas PDK1 y PKB, el factor de intercambio de Arf Grp1, la proteína de acoplamiento Gab1 y PLCγ1, entre muchos otros (81, 13). La translocación de la membrana está mediada a través de la unión de sus dominios PH a los productos de la PI-3 cinasa inducidos por agonistas, lo que lleva a su activación y posterior estimulación de una variedad de respuestas celulares ( Figura 4). Una respuesta importante es la estimulación de la supervivencia celular. Se ha demostrado que la activación de PKB dependiente de la quinasa PI-3 conduce a la fosforilación e inactivación de BAD. La fosforilación de BAD previene la muerte celular apoptótica al bloquear su formación de complejos con las proteínas apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xl ( Figura 4A ) (Datta et al.1999). Otro mecanismo para la inhibición de la apoptosis es a través de la fosforilación inducida por PKB del factor de transcripción FKHR1 (Brunet et al. 1999), que a su vez suprime la expresión génica proapoptótica. La activación de PDK1 inducida por insulina conduce a la fosforilación y activación de la quinasa S-6. Además, la glucógeno sintasa quinasa3 (GSK-3) y la fosfofruckokinase, dos enzimas que se regulan en respuesta a la estimulación de la insulina, son fosforiladas por PKB. PDK1 y PKB pueden desempeñar un papel en el control de la síntesis de proteínas, la gluconeogénesis y la glucólisis en respuesta a la estimulación de la insulina (Toker y Newton 2000a). La PI-3 quinasa también desempeña un papel importante en la generación de peróxido de hidrógeno inducida por el factor de crecimiento. Se ha demostrado recientemente que H inducida por PDGF 2 O 2 generación es dependiente de la activación de PI-3 quinasa y la Rac pequeña proteína G (Bae et al. 2000). Estudios anteriores demostraron que la activación de la NADPH sintasa, el complejo enzimático que cataliza la producción de peróxido de hidrógeno, es un efector de Rac. Curiosamente, la generación inducida por EGF de H 2 O 2 es esencial para la autofosforilación de tirosina sostenida y la activación de EGFR (Bae et al. 1997). El peróxido de hidrógeno que se genera en respuesta a la estimulación con EGF oxida e inactiva una proteína tirosina fosfatasa (PTP) que desfosforila el EGFR activado (58, 4). La regulación de la actividad de la quinasa EGFR no es el único papel del peróxido de hidrógeno en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento. Existe buena evidencia de que el H 2 O 2 desempeña un papel activo en el control de múltiples procesos celulares La actividad de las proteínas efectoras que dependen de la activación de la PI-3 quinasa puede ser regulada negativamente por PTEN y SHIP, dos fosfatasas específicas de fosfoinositido que desfosforilan las posiciones 3 'y 5' del anillo de inositol de fosfoinositidos, respectivamente (6, 67). PTEN es una proteína supresora de tumores que se encuentra mutada en una variedad de cánceres humanos que conducen a una estimulación aberrante de la vía de supervivencia celular (Maehama y Dixon 1998).

Translocación nuclear de STATs Todas las linfocinas inducen la transcripción génica activando la vía de señalización JAK / STAT (14, 43). La unión de las linfocinas a sus complejos receptores binarios conduce a la activación de JAK y la posterior fosforilación de la tirosina de STAT. A esto le sigue la unión del dominio SH2 de STAT a los sitios pTyr en STAT homotípicos o heterotípicos que permiten la formación de homodímeros o heterodímeros STAT. Las STAT diméricas migran al núcleo para activar la transcripción en una secuencia de ADN objetivo designada como elemento GAS. Además de su papel central en la señalización a través de receptores de linfocinas, existe una buena evidencia de que las STAT desempeñan un papel en la señalización a través de RTK. La estimulación con PDGF, EGF o FGF conduce a una rápida fosforilación de la tirosina y la migración de STAT al núcleo y la transcripción de genes de ADN diana. El programa de transcripción iniciado por STAT es un componente integral del programa genético inducido por la estimulación del factor de crecimiento. Además, existe buena evidencia de que STAT3 desempeña un papel en la transformación oncogénica inducida por PTK, ya que las formas constitutivamente diméricas de STAT3 promueven la formación de tumores.

Mecanismo de atenuación y terminación de la señal. La actividad de los RTK debe estar bien regulada y adecuadamente equilibrada para poder mediar en sus tareas celulares normales y sus muchas respuestas fisiológicas. De hecho, la expresión o disfunción aberrante de las RTK es responsable de varias enfermedades y trastornos del desarrollo. Es de esperar, por lo tanto, que existan varios mecanismos para la atenuación y terminación de la actividad RTK inducida por los ligandos estimuladores. Ligandos antagonistas En Drosophila , la activación del homólogo de EGFR por un factor similar a EGF (por ejemplo, Spitz) conduce a la expresión de una proteína similar a EGF secretada denominada Argos. Los experimentos genéticos y bioquímicos sugieren que Argos se une a EGFR, compite con Spitz por la unión al receptor e inhibe la actividad de EGFR ( Figura 5B ). Se ha propuesto que la expresión regulada de un agonista de EGFR (Spitz) y un antagonista de EGFR (Argos) es esencial para el control de varias redes reguladoras en las que el EGFR desempeña un papel importante en el desarrollo de Drosophila (Casci y Freeman 1999). No se ha identificado ningún homólogo de vertebrados de Argos y el mecanismo de su actividad antagónica aún no se conoce (Jin et al. 2000). Otro ejemplo de un antagonista de RTK proviene de la familia de las angiopoyetinas. Las angiopoyetinas pertenecen a una familia de proteínas multiméricas que regulan la vascularización de los mamíferos y la angiogénesis. Las angiopoyetinas se unen específicamente y activan Tie2, una RTK expresada en la superficie de las células endoteliales que está implicada en el control de la vascularización y la angiogénesis. Curiosamente, un grupo de angiopoyetinas inhibe las respuestas biológicas mediadas por el receptor Tie2 ( Maisonpierre et al. 1997). Se cree que la expresión espaciotemporal de las angiopoyetinas estimulantes e inhibitorias es crítica para modelar y remodelar el sistema vascular durante el desarrollo. Además, el grado de oligomerización del receptor inducido por las angiopoyetinas inhibitorias o estimulantes puede determinar el resultado biológico. Heterooligomerización con receptores mutantes Además de las transcripciones que codifican RTK de longitud completa, ciertos tejidos expresan variantes de receptores solubles o ligados a la membrana que son naturales y que son deficientes en la actividad de RTK. La expresión de un mutante de deleción inactivo en la misma célula puede resultar en una inhibición negativa dominante del receptor de longitud completa a través de la generación de heterodímeros o hetero-oligómeros inactivos (Jaye et al. 1992). Se cree que

una función biológica de las variantes de receptores mutantes coexpresadas en la misma célula con receptores de longitud completa es proporcionar un mecanismo para atenuar la señal generada por la estimulación por ligando del receptor de longitud completa ( Figura 5B ). Inhibición de la actividad RTK La activación de la proteína quinasa-C (PKC) por los receptores acoplados a la proteína G o por PDGF o forbolésteres (PMA) da como resultado la fosforilación de EGFR en múltiples residuos de Ser y Thr, incluido Thr654 en el dominio yuxtamembrana de EGFR. La fosforilación de EGFR inducida por PKC da como resultado una inhibición de su actividad PTK y una fuerte inhibición de la unión de EGF al dominio de unión al ligando extracelular (12, 17). Por tanto, la fosforilación mediada por PKC del dominio yuxtamembrana de EGFR parece proporcionar un mecanismo de retroalimentación negativa para el control de la actividad del receptor. SOCS ( s uppressor o f c ytokine s ignaling) pertenece a una familia de proteínas que funcionan como reguladores negativos para la inhibición por retroalimentación en respuesta a la estimulación de citoquinas (Hilton et al. 1998). Se ha demostrado que las proteínas SOCS inhiben la señalización en respuesta a la estimulación con citoquinas mediante la unión directa al dominio PTK de JAK a través de sus dominios SH2. Ahora hay evidencia de que la estimulación con insulina induce la expresión de SOCS-3 y que SOCS-3 se une directamente al IR, lo que sugiere que un mecanismo de retroalimentación negativa similar puede tener lugar en la señalización a través de RTK (Emmanuelli et al. 2000). Inhibición por tirosina fosfatasas Las proteínas tirosina fosfatasas (PTP) desempeñan un papel importante en el control de la actividad RTK y las vías de señalización que regulan. Prácticamente todas las RTK pueden activarse, incluso en ausencia de unión a ligando, mediante el tratamiento de células con inhibidores de PTP. Este experimento demuestra que la actividad de las RTK está siendo monitoreada y verificada continuamente por PTP inhibitorias. La actividad de la proteína tirosina quinasa de la mayoría de las RTK está regulada positivamente por uno o varios sitios de fosfotirosina en el bucle de activación. Las proteínas tirosina fosfatasas que desfosforilan estos residuos de p-Tyr reguladores inhibirán la actividad de RTK y las respuestas biológicas mediadas por efectores posteriores que dependen de la actividad de PTK. Recientemente se demostró que la alteración génica dirigida de PTP1B en ratones conduce a la hiperfosforilación de IR e IRS1 y a la sensibilización de la señalización a través del IR in vitro y en los ratones mutantes. Estos datos argumentan que PTP1B es un importante regulador negativo de IR (Elchebly et al. 1999). Endocitosis y Degradación del Receptor La estimulación del factor de crecimiento da como resultado una endocitosis rápida y la degradación tanto del receptor como del ligando. La unión del ligando induce la agrupación de receptores en las fosas recubiertas en la superficie celular, seguida de la endocitosis, la migración a cuerpos multivesiculares y la degradación final por las enzimas lisosomales. Se ha demostrado que la degradación de EGFR depende de la actividad de la proteína tirosina quinasa y que un mutante del receptor de quinasa negativo se recicla a la superficie celular para su reutilización (Ullrich y Schlessinger 1990). La rápida endocitosis y la degradación del EGFR activado y otras RTK atenúan la señal generada en la superficie celular en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento. Estudios recientes sugieren que la proteína oncogénica Cbl desempeña un papel en la regulación de la degradación de EGFR y PDGFR. Cbl contiene varios subdominios, incluido un dominio similar a SH2 que es responsable de la unión a RTK activados, y un dominio de dedo RING que funciona como una ubiquitina ligasa. La unión de EGFR o PDGFR a Cbl conduce a la ubiquitinación del receptor y la posterior degradación por el proteosoma (Joazeiro et al. 1999 ( Figura 5B ). Por otro lado, la formación de complejos con receptores activados da como resultado la fosforilación de tirosina de Cbl seguida por el reclutamiento de proteínas de señalización tales como PI-3 quinasa, argumentando que Cbl también puede funcionar como una proteína de acoplamiento para el reclutamiento de proteínas efectoras.

Acoplamiento con vías de señalización heteróloga En los últimos años se ha hecho evidente que los RTK y las vías de señalización que activan forman parte de una gran red de señalización que puede regularse mediante múltiples señales extracelulares como la adhesión celular, los agonistas de los receptores acoplados a proteínas G, las linfoquinas o las señales de estrés (Carpintero 1999). También se ha demostrado que la adhesión celular a través de receptores de integrina conduce a la activación de varias RTK, incluidos los receptores para insulina, EGF, PDGF y FGF, lo que da lugar a la fosforilación de tirosina de proteínas diana y la activación de vías de señalización que normalmente son activadas por estos receptores. Se ha propuesto que la activación del receptor inducida por la adhesión celular está mediada por el coagulo de integrinas con RTK, aunque no se comprende el mecanismo preciso de formación de complejos entre las integrinas y las RTK. También se ha demostrado que las RTK se activan por la despolarización de la membrana, por varias respuestas al estrés que incluyen condiciones hiperosmóticas y radiación ultravioleta, así como por receptores acoplados a proteína G (Carpintero 1999). Se ha demostrado que los agonistas de varios receptores acoplados a proteínas G (p. Ej., Endotelina, ácido lisofosfatídico, angiotensina y trombina) estimulan la fosforilación de tirosina de EGFR o PDGFR. También se ha propuesto que EGFR y PDGFR, así como las PTK no receptoras, Src y PYK2, son cruciales para acoplar la estimulación de los receptores acoplados a la proteína G con la cascada de señalización de la quinasa Ras / MAP (sesenta y cinco, 32). Sin embargo, aún no está claro cómo las rutas dependientes de Gi y Gq activan estas proteínas tirosina quinasas. Además, la estimulación de la MAP quinasa inducida por los receptores acoplados a la proteína G es normal en fibroblastos deficientes en EGFR o en quinasas Src. También existe buena evidencia de acoplamiento entre la señalización de EGFR y la vía de señalización activada por la transformación de los receptores del factor de crecimiento β (TGFβ). La familia de citocinas TGFβ media en sus respuestas biológicas uniéndose y activando un complejo hetero-tetramérico compuesto de receptores con actividad Ser / Thr designado receptor-I y -II de TGFβ (Massagué et al. 2000[este número de Cell ]). La estimulación de los receptores de TGFβ da como resultado la fosforilación de las proteínas Smad, seguida de su translocación al núcleo celular y la consiguiente mejora de la actividad transcripcional de los genes diana. EGF ejerce una respuesta inhibitoria en la señalización de TGFβ, al inducir la fosforilación de proteínas Smad en sitios específicos que evitan la translocación nuclear y causan una inhibición de la actividad transcripcional (54, 18, 109). Ya es evidente que las vías de señalización no funcionan de manera aislada, y no pueden presentarse o considerarse de una manera lineal simple como lo propondrían los análisis genéticos. Una imagen más realista es que las vías de señalización están unidas entre sí en una gran red de proteínas que está sujeta a múltiples entradas estimulantes e inhibitorias, así como a mecanismos complejos de retroalimentación. Dicha complejidad es esencial para mediar las respuestas pleiotrópicas de los factores de crecimiento en el desarrollo y en el animal adulto.

Factores que determinan la especificidad de las vías de señalización Una pregunta sin respuesta importante en el campo de la transducción de señales concierne al origen de la especificidad de la señal. ¿Cómo se transmiten la gran cantidad de señales extracelulares para inducir respuestas biológicas específicas? No está nada claro cómo la activación de una RTK dada en la membrana celular por un ligando específico podría utilizar el repertorio actualmente conocido de vías de señalización intracelular para transducir una

respuesta biológica única. La insulina y el NGF, por ejemplo, estimulan respuestas biológicas únicas en sus tejidos diana. Sin embargo, las vías de señalización intracelular que son activadas por la insulina, NGF u otros factores de crecimiento son muy similares. En otros casos, la activación de las mismas moléculas de señalización en diferentes células conduce a respuestas distintas. ¿Por qué, por ejemplo, ¿La estimulación de la PI-3 quinasa por la insulina en las células musculares se traduce en una mejora de los procesos metabólicos, mientras que la estimulación de la PI-3 quinasa por el NGF en las células neuronales produce una señal antiapoptótica? Además, ¿cuáles son los factores que determinan el resultado biológico de una señal generada por un receptor tirosina quinasa en un contexto celular diferente? ¿Por qué la estimulación de una RTK (p. Ej., TrkA, FGFR, Ret) en los fibroblastos produce una proliferación celular mientras que la estimulación de la misma RTK en las células neuronales produce una diferenciación celular? Se han propuesto varios mecanismos para el control de la especificidad en la señalización celular. ¿Cuáles son los factores que determinan el resultado biológico de una señal generada por un receptor tirosina quinasa en un contexto celular diferente? ¿Por qué la estimulación de una RTK (p. Ej., TrkA, FGFR, Ret) en los fibroblastos produce una proliferación celular mientras que la estimulación de la misma RTK en las células neuronales produce una diferenciación celular? Se han propuesto varios mecanismos para el control de la especificidad en la señalización celular. ¿Cuáles son los factores que determinan el resultado biológico de una señal generada por un receptor tirosina quinasa en un contexto celular diferente? ¿Por qué la estimulación de una RTK (p. Ej., TrkA, FGFR, Ret) en los fibroblastos produce una proliferación celular mientras que la estimulación de la misma RTK en las células neuronales produce una diferenciación celular? Se han propuesto varios mecanismos para el control de la especificidad en la señalización celular. Control combinatorio La especificidad de la señal se puede definir en parte por un control combinatorio. Cada RTK recluta y activa un conjunto único de proteínas de señalización a través de sus propios sitios de autofosforilación de tirosina y por medio de los sitios de fosforilación de tirosina en proteínas de acoplamiento estrechamente asociadas (por ejemplo, Gab1, FRS2). El reclutamiento combinatorio de un complemento particular de proteínas de señalización de un conjunto común preexistente de casetes de señalización es un mecanismo para el control de la especificidad de la señal. Este proceso está regulado aún más por el reclutamiento diferencial de proteínas estimulantes e inhibidoras por los diferentes receptores y las proteínas efectoras de flujo descendente que conducen a un ajuste fino de las respuestas celulares. El papel de las proteínas del andamio Se ha demostrado que las proteínas de andamiaje que se unen simultáneamente a varias proteínas pueden aislar componentes clave de las vías de señalización de las cascadas de señalización estrechamente relacionadas (Whitmarsh y Davis 1998). En la levadura, se ha demostrado que la proteína de andamiaje Ste5 interactúa con una proteína G activada por feromonas y con componentes de la cascada de MAP quinasa. Ste5 forma un complejo con Ste11, Ste7 y Fus3P que conduce al aislamiento de la cascada de MAP quinasa inducida por feromonas a partir de vías de señalización estrechamente relacionadas. Otro ejemplo es JIB, una proteína que funciona como una proteína de andamiaje en la cascada de señalización JNK en células de mamíferos (Davis 2000). También hay evidencia de que miembros particulares de la cascada MAPK forman un complejo con una quinasa activadora corriente arriba específica y una quinasa efectora corriente abajo para proporcionar aislamiento de otras cascadas MAP quinasa (Kallunki et al. 1994). Queda por determinar si las RTK inducen respuestas biológicas específicas utilizando proteínas de andamio específicas. Compartimentación celular En los últimos años se ha hecho evidente que la localización celular de proteínas involucradas en la señalización celular tiene un profundo impacto en su actividad biológica. Dado que muchos de los objetivos de las RTK se encuentran en la membrana celular, se requiere la translocación de la membrana para la activación de muchos procesos celulares. La unión de los dominios SH2,

PTB o SH3 a los receptores activados o a las proteínas de acoplamiento ligadas a la membrana conduce a la translocación de la membrana. Además, la translocación de la membrana está regulada en parte por los dominios PH o FYVE, dos módulos de proteínas que se unen a diferentes fosfoinositidos. Se ha demostrado que la unión de proteínas que contienen dominios PDZ a sus secuencias diana canónicas en el extremo C de las proteínas de señalización inducirá el ensamblaje de conjuntos específicos de proteínas de señalización en regiones específicas en la cara interna de la membrana celular. Se ha propuesto que una variedad de proteínas involucradas en la señalización celular se concentran en microdominios ricos en colesterol denominados "balsas de membrana" (Simons y Ikonen 1997). Se piensa que las "balsas de membrana" funcionan como sitios de ensamblaje de proteínas involucradas en la señalización celular, incluidos los receptores de la superficie celular, proteínas similares a GPI, quinasas Src y proteínas Ras (Marrón y londres 2000). Sin embargo, aún no está claro si existen balsas de membrana en el contexto de las células vivas (Edidin 1997) o si este fenómeno representa un artefacto causado por la solubilización del detergente. La translocación de proteínas STAT de la membrana celular al núcleo es otro ejemplo del papel de la localización de proteínas en la señalización celular (14, 43). Inicialmente, las proteínas STAT se unen a los dominios citoplásmicos de los receptores de linfoquinas cerca de las proteínas tirosina quinasas de la familia JAK. La estimulación del receptor de linfocinas o RTK conduce a la fosforilación de la tirosina de STAT, lo que da como resultado una dimerización homotípica o heterotípica seguida por la translocación nuclear y la regulación de la transcripción de genes diana. Duración y amplitud de la señal Las vías de señalización celular podrían considerarse como componentes de circuitos intracelulares generados por redes de proteínas. Según esta visión, la transmisión de la señal y el resultado biológico deberían verse afectados por consideraciones cuantitativas, como la duración de la señal y la intensidad de la señal (Marshall 1995). Por ejemplo, las RTK que inducen la estimulación transitoria de MAPK (por ejemplo, EGFR, IR) estimulan la proliferación de células PC12, mientras que las RTK que estimulan una respuesta MAPK sostenida y robusta (por ejemplo, NGFR, FGFR) promueven la diferenciación neuronal de las mismas células. De hecho, la sobreexpresión de IR o EGFR en células PC12 conduce a una respuesta MAPK sostenida que produce una diferenciación celular, aunque los mismos receptores dan una respuesta proliferativa cuando se expresan a niveles más bajos. Estos experimentos muestran que el resultado biológico (proliferación versus diferenciación) está determinado por la modulación cuantitativa del umbral de señal (Marshall 1995 ). El umbral de la señal se puede determinar por la actividad específica de un RTK determinado y por la acción equilibrada de las diversas señales inhibitorias o estimuladoras que se activan mediante el RTK. Por ejemplo, la señal generada por un RTK puede prolongarse mediante la generación de peróxido de hidrógeno que bloquea las proteínas inhibidoras tirosina fosfatasas o mediante la fosforilación de proteínas de acoplamiento que promueven la amplificación de la señal mediante el reclutamiento de múltiples moléculas de señalización. Las vías de señalización también están sujetas a múltiples mecanismos de retroalimentación negativa a nivel del propio receptor por la proteína inhibitoria tirosina fosfatasas y por la endocitosis y degradación del receptor. Además, la actividad específica de las proteínas efectoras clave puede ser regulada negativamente por señales inhibitorias. Por ejemplo, Las respuestas de MAPK son inhibidas por las proteínas fosfatasas que desfosforilan e inactivan esta enzima. Las dos fosfoinositidas fosfatasas PTEN y SHIP desfosforilan específicamente el fosfato 3 'o 5' de los PtdIns (3,4,5) PEl anillo de 3 inositol, respectivamente, conduce a la inhibición de las respuestas celulares mediadas por los productos de la PI-3 quinasa. El equilibrio entre las diversas respuestas estimulantes e inhibitorias determinará en última instancia la intensidad y la duración de las señales que se transmiten a través de las redes de cascadas de señalización luego de su inicio en la superficie celular en respuesta a la estimulación con RTK.

Contexto celular El resultado biológico de las señales generadas en la superficie celular en respuesta a la estimulación con RTK depende en gran medida del contexto celular. El mismo RTK inducirá una respuesta totalmente diferente cuando se expresa en diferentes células o en diferentes etapas de diferenciación de un linaje celular particular (Sahni et al. 1999). Por ejemplo, en el desarrollo temprano, el FGFR1 desempeña un papel importante en el control de la migración celular, un proceso crucial para el patrón mesodérmico y la gastrulación. La estimulación de FGFR1 en los fibroblastos, por otro lado, conduce a la proliferación celular, mientras que la estimulación de FGFR1 expresada en células neuronales induce la supervivencia y diferenciación celular. La explicación más plausible para estas observaciones es que diferentes células expresan proteínas efectoras específicas del tipo de célula y factores de transcripción que median en las diferentes respuestas. Según este punto de vista, las RTK y sus vías de señalización son capaces de alimentarse en múltiples procesos, regulando así la actividad de diferentes proteínas efectoras y factores transcripcionales en diferentes entornos celulares. Por lo tanto, una entrada similar puede generar una salida diferente en un contexto celular diferente. Finalmente, hay una buena evidencia de que las cascadas de señalización críticas están reguladas por pasos múltiples y paralelos que conducen a la redundancia en las vías de señalización. Por ejemplo, el receptor de EGF activado recluta la proteína adaptadora Grb2 directa e indirectamente a través de Shc y Gab1. Por lo tanto, los mutantes de EGFR defectuosos en la unión de Grb2 son capaces de reclutar la proteína adaptadora Grb2 indirectamente, lo que resulta en una activación eficiente de la cascada de señalización de Ras / MAP quinasa. Otro ejemplo es la redundancia observada en la expresión y función de las quinasas Src (Klinghoffer et al. 1999). Mientras que la mayoría de las células expresan al menos tres de los nueve miembros conocidos de la familia Src, la expresión de una única quinasa Src es suficiente para mediar una señal intracelular que requiere una quinasa de la familia Src.

Conclusiones Han pasado 20 años desde que se descubrió la fosforilación de la proteína tirosina ( Hunter y Sefton 1980 ). Las últimas dos décadas han visto un rápido progreso en la caracterización de las proteínas tirosina quinasas, las vías de señalización que activan y los mecanismos subyacentes a su acción y regulación. Con la completa determinación de las secuencias de los genomas de C. elegans, Drosophila y Homo sapiens , toda la plétora de quinasas, fosfatasas y proteínas de señalización se ha vuelto accesible para los bioquímicos y genetistas interesados en descifrar los roles desempeñados por los RTK en Procesos biológicos normales y en situaciones patológicas. Ya está claro que las vías de señalización activadas por RTK están interconectadas con otras vías de señalización a través de redes de proteínas que están sujetas a múltiples mecanismos de retroalimentación positiva y negativa. La herramienta frecuentemente aplicada de la alteración de genes específicos utilizada por los genetistas para analizar las vías de señalización se complica por la existencia de vías de señalización redundantes y porque los componentes clave a veces son compartidos por múltiples cascadas de señalización. En consecuencia, se deben desarrollar y aplicar herramientas más sofisticadas para el análisis de las vías de señalización celular. Se necesitan nuevas técnicas para la determinación de la localización de proteínas (Teruel y Meyer 2000[este número de Cell ]) y la medición de la cinética de las reacciones celulares en el contexto de las células vivas e incluso en el animal vivo. Además, análisis detallados de los patrones de expresión génica mediante análisis de microarrays de genes que se expresan en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento (Fambrough et al. 1999) de células derivadas de tejidos normales o patológicos revelarán nuevos enlaces entre las vías de señalización. Finalmente, los bioquímicos y genetistas modernos deberán adoptar enfoques que hayan sido desarrollados por ingenieros para describir redes complicadas (por ejemplo, análisis del sistema) a fin de obtener una perspectiva coherente y realista sobre la señalización celular