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AISLAMIENTO DE DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Objetivo: etilendiaminotetraacético, que es un agente quelante, que puede crear complejos con iones  Aislar, purificar y caracterizar divalentes, dado que el Ca2+ es un cofactor espectrofotométricamente DNA de guayaba requerido por las nucleasas, su secuestro por el  Identificar por cromatografía en capa fina las EDTA evita la degradación del DNA, el NaCl … bases nitrogenadas del DNA y RNA El almidón de la guayaba se hidroliza por la aprovechando su propiedad para absorber acción de la enzima amilasa, la cual rompe los luz UV. enlaces α 1, 4. Introducción: La solución saturada de NaCl provoca la Los ácidos nucleicos representan la cuarta gran precipitación salina de proteínas y el SDS al 10 clase de macromoléculas. Éstas, igual que las % es un compuesto tensioactivo aniónico proteínas y los polisacáridos, contienen antipático, toma la parte lipídica de la célula y múltiples unidades monoméricas similares que forma semimicelas, además rompe enlaces no se unen en forma covalente para producir covalentes de las proteínas, por lo que deshace polímeros grandes. El DNA y RNA son muy la membrana y libera el contenido de la célula. apropiados para funcionar como portadores de Despues de la centrifugación se obtienen tres información genética en virtud de sus fases: En la superior se encuentra el DNA, en la estructuras covalentes. Los nucleótidos tienen media las proteínas coaguladas y en la inferior tres componentes: un azúcar con cinco la mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico. carbonos, uno o más grupos fosfato y un El sobrenadante se vierte en alcohol 96° para la compuesto nitrogenado débilmente básico precipitación de los polímeros biológicos entre llamado base, las cuales son derivadas de los cuales se encuentra el DNA de guayaba pirimidina (tiene un solo anillo de cuatro átomos de carbono y dos de nitrógeno) y purina (tiene Resultados: un sistema de anillos fundidos de pirimidina y de Se anexa: imidazol). Los dos tipos de bases son no Grafica 1. Espectro de absorción de DNA de saturados, con dobles enlaces conjugados. Esta guayaba. propiedad hace que los anillos sean planos, y también explica su capacidad de absorber la luz ultravioleta. El RNA está formado por: el azúcar D-Ribosa, bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina o uracilo) y el grupo fosfato. El DNA esta formado por: el azúcar desoxirribosa (el prefijo desoxi indica que el carbono 2´ del azúcar carece del átomo de oxigeno), bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina o timina) y el grupo fosfato. El DNA se encuentra en el núcleo de las células eucarióticas y para su extracción es necesario: un procedimiento mecánico para romper la pared y membrana celular y así facilitar su La determinación de la concentración de DNA extracción, es importante mencionar que el obtenido en mg/ mL se realizó por tres métodos proceso debe ser llevado en condiciones en que diferentes: se inhiban las enzimas degradativas de los Método 1. Se anexa Figura 1. Nomograma para ácidos nucleicos (nucleasas), además de que el el cálculo de las concentraciones de ácidos DNA obtenido debe ser purificado. nucleicos y proteínas. Análisis de la técnica: Factor de dilución: 3 A 15 g de guayaba se le adiciono una solución Valor obtenido del nomograma para ácidos de Tris/EDTA/NaCl, trisaminometano, que es un nucleicos: 0.016 mg / mL regulador de pH, ácido

AISLAMIENTO DE DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 𝑚𝑔 ⁄𝑚𝐿 ∴ Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑖𝑐𝑜𝑠 = 3(0.016) = 0.048 Método 2: Mediante la fórmula: 𝐴260 0.656 ∗ 3 [𝐷𝑁𝐴] = ∗ 𝐹𝐷 = 22500 22500 𝑚𝑔 −5 𝑔 = 8.74𝑥10 ⁄𝑚𝑙 𝑜 𝑏𝑖𝑒𝑛 0.0874 ⁄𝑚𝑙 Método 3: Mediante la relación: 50 𝜇𝑔 𝐷𝑁𝐴 𝑝𝑢𝑟𝑜 − 1 𝐴260 𝑥 − 𝐴260 ∴ 𝑥 = 𝐴260 ∗ 50 𝜇𝑔 𝐷𝑁𝐴 𝑝𝑢𝑟𝑜 ∗ 𝐹𝐷 𝑥 = 0.656 ∗ 50 ∗ 3 𝜇𝑔 𝑚𝑔 = 98.4 ⁄𝑚𝑙 𝑜 𝑏𝑖𝑒𝑛 0.098 ⁄𝑚𝑙 Calculo de la pureza:

𝐴260 𝑛𝑚 ≈2 𝐴280 𝑛𝑚 0.656𝑛𝑚 𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = 0.9252 0.709𝑛𝑚 Discusión de resultados: El espectro de absorción del DNA puro presenta un máximo a una absorbancia de 260 nm que corresponde a los ácidos nucleicos y un mínimo en 230 nm correspondiente a enlaces peptídicos, sin embargo, los datos de la espectrofotometría indican un comportamiento distinto al mencionado, pues la absorbancia a 230 nm y 280 nm son mayores a 260 nm, éste resultado indica la presencia en mayor cantidad de proteínas y enlaces peptídicos en comparación al DNA 𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =