Dasar Teori-prosedur Kerja Pewarnaan.doc

Topik: Pewarnaan Secara Gram Tujuan: 1. Untuk memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram. 2. Untuk menentukan sifat Gram dari bakteri yang diperiksa. Dasar Teori : Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri

Klebsiella

pneumoniae.

Bakteri Gram-negatif adalah

bakteri

yang tidak

mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak (Dwijoseputro, d. 1994). b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Dwijoseputro, d. 1994). Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel

menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Hardiningsih, 2006). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Sutedjo , M . 1991). Tabel 1.1 Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-) Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan penisilin Penghambatan

oleh Lebih dihambat

pewarna basa (VK) Kebutuhan nutrisi

Kebanyakan

Ketahanaa terhadap

kompleks Lebih tahan

Kurang dihambat spesies

relatifRelatif sederhana Kurang tahan

perlakuan fisik Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010). Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7

menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

Alat dan Bahan ALAT: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Mikroskop Kaca benda Mangkuk pewarna Kawat penyangga Pipet Pinset Lampu spiritus Botol penyemprot

BAHAN: 1. Aquades steril 2. Biakan murni bakteri umur 1x24 jam 3. Larutan Amonium Oksalat Kristal Violet 4. Kertas penghisap 5. Korek api 6. Alkohol 95% 7. Lisol 8. Sabun cuci 9. Larutan Safranin 10. Larutan Iodium Cara Kerja. 1. Disediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan di atas nyala lampu spiritus. 2. Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut. 3. Secara aseptik diambil bakteri inokulum yang akan diperiksa, lalu diletakkan di atas tetesan aquades itu. Kemudian diratakan perlahan-lahan dan ditunggu sampai mengering. 4. Dilakukan fiksasi dengan cara membuka sediaan tersebut di atas nyala api lampu spiritus dengan cepat. 5. Diletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang ada di ataalaman pewarna. Lalu teteskan larutan Ammonium Oksalat Krist Violet di atas sediaan tersebut. Ditunggu selama 1 menit. 6. Dibuang kelebihan zat warna ke dalam wadah dan dibilas sediaan dengan air kran / aquadest

7. Diteteskan larutan iodium di atas sediaan, lalu ditunggu selama 2 menit. 8. Dibuang kelebihan larutan iodium ke dalam mangkuk dibilas dengan air kran. 9. Diteteskan alkohol 95% di atas sediaan, lalu ditunggu selama 1 menit. 10. Dibuang sisa alkohol ke dalam wadah dan dibilaslah sediaan. 11. Diteteskan larutan Safranin di atas sediaan, lalu biarkan selama 30 detik menit. 12. Safranin yang sisa dibuang pada mangkuk , dan kaca benda dibilas dengan air kran. 13. Dieringkan sediaan dengan hati-hati dengan kertas penghisap, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Daftar Pustaka Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7 No. 1. Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1. Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS. Sutedjo , M . 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.