Curs Gc Si Ms.pdf

GC - introducere

Clasificarea tehnicilor cromatografice c.p.

c.a.

c.p.

c.a. - cromatografie de adsorbţie c.p. - cromatografie de partiţie

c.p. c.a.

c.a.

p.2 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Absorbţia şi adsorbţia ...

ABsorbţie

ADsorbţie p.3 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Distribuţia concentraţiei solutului în faza mobilă şi faza staţionară direcţia de curgere

Faza mobilă transfer din faza staţionară în faza mobilă

profilul concentraţiei solutului în faza staţionară

Faza staţionară

profilul concentraţiei solutului în faza mobilă

transfer din faza mobilă în faza staţionară p.4 - Bazele teoretice ale cromatografiei

intensitate

Timp de retenţie şi ordine de eluţie

octan

Injecţie

pic 1

nonan

timp

p.5 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Concentraţie

Forma picului cromatografic

Răspunsul detectorului

distanţă

tr punct de inflexiune

injecţie

timp sau volum p.6 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Schema procesului cromatografic detector

cromatogramă

timp

direcţia de curgere a f.m.

coloana cromatografică

p.7 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Lărgirea zonei cu probă coloană start

p.8 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă - echilibrul interfazic direcţie de eluţie

faza mobilă faza staţionară zona cu probă la intrare în coloană

faza mobilă faza staţionară zona cu probă în coloană, la un timp oarecare de eluţie p.9 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă - difuziune longitudinală -

zona cu probă la scurt timp după intrarea în coloană difuziune longitudinală

zona cu probă după un timp mai îndelungat de eluţie direcţie de eluţie p.10 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă - difuziune structurală -

timp

p.11 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă - difuziune transversală zona cu probă la intrare în coloană

direcţie de eluţie

zona cu probă în coloană, la un timp oarecare de eluţie

p.12 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factor de separare şi factor de capacitate retenţia relativă sau factorul de separare (pentru compuşii 1 şi 2)

 = (tr2’/tr1’) = k2’/k1’ = K2/K1 factorul de capacitate k’ = (tr – tm)/tm=

CsVs / CmVm= K (Vs/Vm)

(raportul între timpul petrecut de un component în f.m. respectiv f.s.) coeficientul de partiţie

K = Cs/Cm p.13 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Numărul de talere teoretice şi înălţimea echivalentă a talerului Numărul de talere teoretice (N) tR – timpul de retenţie wh – lăţimea picului la ½ din înălţime

Înălţimea echivalentă a talerului teoretic (H) L – lungimea coloanei

p.14 - Bazele teoretice ale cromatografiei

2((tR)y - (tR)x) Rs = ----------------Wx + W y

intensitate

rezoluţie 1.0

timp

intensitate

intensitate

rezoluţie 0.5

rezoluţie 0.75

intensitate

Rezoluţia

rezoluţie 1.5

timp p.15 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Compararea rezoluţiei la diverse concentraţii

p.16 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Izoterma de adsorbţie

p.17 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Picuri cromatografice asimetrice

41.7(t r / w0 .1 ) N A / B  1.25

2

p.18 - Bazele teoretice ale cromatografiei

E c u a ţ i a Van D e e m t e r

B H  A  C x x Unde A, B, C sunt contribuţii din: A difuziune structurală B difuziune longitudinală C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.19 - Bazele teoretice ale cromatografiei

E c u a ţ i a Van D e e m t e r

B H  A  C x x Unde A, B, C sunt contribuţii din: A difuziune structurală B difuziune longitudinală C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.20 - Bazele teoretice ale cromatografiei

C u r b e l e Van D e e m t e r

p.21 - Condiţii de analiză GC-MS

F a z a m o b i l ă - c u r b e l e Van D e e m t e r pentruH2, He şi N2

Debite recomandate (ml / min): Diametru interior Hidrogen 0.10 mm 1.0 0.25 mm 2.5 0.32 mm 3.2 0.53 mm 5.3

Heliu 0.5 1.3 1.9 4.2

p.22 - Descrierea părţilor componente ale GC

C u r b e l e Van D e e m t e r

p.23 - Condiţii de analiză GC-MS

Efectul vitezei fazei mobile

Viteză mare >> scăderea R

p.24 - Condiţii de analiză GC-MS

Separarea gaz - cromatografică Injector Detector

Cromatograf

Coloană cromatografică Calculator sau înregistrator

“Cuptor”

Gaz purtător Proba: amestec A+B+C+D+E E

A

Cromatogramă B

D

A B Intensita te

C

E

C

??? - volatilitate ??? - punct de fierbere 0 5 ??? - masă moleculară ??? - polaritate ??? - matrice, solvent, stabilitate termică, alţi factori.

D 10 Timp (minute)

15

20

p.25 - Principiul determinării gaz-cromatografice

Faza mobilă – cerinţe de puritate

p.26 - Descrierea părţilor componente ale GC

Faza mobilă – cerinţe de puritate

p.27 - Descrierea părţilor componente ale GC

Dispozitive de măsurare şi reglare a debitului

p.28 - Descrierea părţilor componente ale GC

Coloane cromatografice

Convenţionale

solut adsorbit la suprafaţa fazei staţionare

peretele coloanei capilare

Capilare solut dizolvat în faza staţionară depusă pe peretele capilarei p.29 - Descrierea părţilor componente ale GC

Nume comercial Tip adsorbant Silice

C grafitizat

Polimeri poroşi

Suprafaţa Diametrul porilor specifică (nm) (m2/g)

Spherosil XOA 400 Spherosil XOA 200

300 – 500 140 - 230

8 15

Spherosil XOB 075 Spherosil XOB 030 Spherosil XOB 015

75 – 125 37 – 62 18 - 31

30 60 125

Spherosil XOC 005

5 -15

300

Porasil B

125 – 250

10 – 20

Porasil C

50 - 100

20 - 40

Carbopack B Carbopack C

100 12

-

Carbosieve

1000

1,3

Spherocarb

1200

1,5

Chromosorb 101 (răşini poliaromatice)

< 50

300 - 400

Porapak P sau Q (copolimeri ai stirenului cu etilvinilbenzen)

> 500

7,5

Polaritatea coloanelor cromatografice Me Si

O

Me

O

Si

Si

Ph

m

O

Si R'

Me

O n

5% fenil (HP-5, DB-5, etc.) 35% fenil (HP-35, DB-35, etc.) 50% fenil (HP-50+, DB-17, etc.)

Me

R O m

Nepolară

n Me

Ph O

100 % metil (HP-1, DB-1 etc.)

6% cianopropilfenil (HP-1301, DB-1301, etc.) Si O 14% cianopropilfenil (HP-1701, DB-1701etc.) 50% cianopropilfenil (HP-225, DB-225, etc.) Me n

Nepolară Polaritate medie Polaritate medie

Polaritate medie Polaritate medie Polaritate mare

H H HO - - C-C-O- -H

100% PEG (HP-WAX)

Polară

H H p.31 - Descrierea părţilor componente ale GC

Polaritatea coloanelor cromatografice HP-17: 50% fenil şi 50% metil siloxan

comparativ cu

HP-50+ : (50%)-Difenil (50%)-Dimetilpolisiloxan

CH3 Si

Si O CH3

m

O

Si

n

O

CH3

n

! coloanele sunt diferite !

p.32 - Descrierea părţilor componente ale GC

Polaritatea coloanelor cromatografice C12

C10

Hexanol

100% Metil (nepolar)

0

2

4

C10

6

8

condiţii identice la GC coloane de dimensiuni identice fază staţionară diferită

C12

100% PEG (polar)

Hexanol

0

2

4

6

8

p.33 - Descrierea părţilor componente ale GC

Ordinea de eluţie şi punctele de fierbere

p.34 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice

●

faza staţionară

●

diametrul interior

●

lungimea

●

grosimea filmului p.35 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - diametrul interior 80°C izoterm 21.81 0

5

10

15

0.25 mm

20

16.06 0

2

4

6

8

10

12

14

0.32 mm

16

Timpul de retenţie este invers proporţional cu diametrul interior

p.36 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - diametrul interior -

n =58,700

n =107,250

0.53 mm capacitate pentru probă : < 2 ug

0.32 mm < 500 ng

p.37 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - lungimea coloanei Lungime (m) 15 30 60

N 71,430 142,860 285,720

0.25 mm ID N/m = 4762

p.38 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - lungimea coloanei -

R=0.84 2.29 min

15 m

R=1.16 4.82 min

30 m

R=1.68 8.73 min

60 m

p.39 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - grosimea filmului 7.00

grosimea mai mare a filmului conduce la 0 timpi de retenţie mai mari

0.25 µm 2

4

6

8

25.00 1.00 µm 0

5

10

15

20

25

grosimea mai mare a filmului conduce la pierderi de f.s. mai mari p.40 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice - grosimea filmului formarea produşilor siloxanici de degradare

CH3

Si HO O

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Si Si O Si O Si O Si O Si O CH3 CH3 CH3 CH CH3 CH3 3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3 Si O Si O Si O Si OH CH3 CH3 CH3 CH3

H3C

+

H3C CH3 Si O O Si CH3 H3C Si O CH H3C 3

Reacţia se repetă

p.41 - Descrierea părţilor componente ale GC

Efectul grosimii filmului

p.42 - Condiţii de analiză GC-MS

p.43 - Condiţii de analiză GC-MS

Operarea în regim programat de temperatură

Sistemele de injecţie neselective pentru cromatografia de gaze (cu transferul integral, sub aspect calitativ şi cantitativ, al probei către coloana cromatografică): i) Injectoare fără divizarea fluxului de fază mobilă („splitless”); ii) Injectoare cu injecţie direct în coloană, la rece („cool-on-column”); iii) Injectoare de tip valvă rotativă pentru gaze sau lichide; iv) Injectoare de tip diafragmă pentru probe lichide.

Sistemele de injecţie selective utilizate în cromatografia de gaze sunt: i) Injectoare cu divizarea fluxului de fază mobilă („split”); ii) Injectoare cu şi fără divizarea fluxului de fază mobilă („split / splitless”); iii) Injectoare de tip „head space”; iv) Injecţie de tip „purge and trap”; v) Injecţie cu piroliză (pirolizoare); vi) Injectoare cu programare de temperatură („program temperature vaporizer” - PTV).

● ● ● ● ●

INJECTOARE clasice cu splitare split-splitless on column P T V, a l t e t i p u r i

Sisteme de introducere a probei

PTV

On column

Split-splitless p.46 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sisteme de introducere a probei specifice analizei gazelor

p.47 - Descrierea părţilor componente ale GC

Injectoare - avantajele injecţiei split-splitless

p.48 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sisteme automate de introducere a probei

p.49 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace

Sistem static Sistem dinamic p.50 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace cu compensare de presiune

p.51 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace

inj.lichid

Headspace p.52 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace

1 ml 5 ml 5 ml + NaCl sol.apoasă ciclohexan + dioxan

Influenţa volumului de probă şi a adaosului de NaCl asupra senzitivităţii Influenţa temperaturii asupra senzitivităţii p.53 - Descrierea părţilor componente ale GC

Detectori

Distructivi • Spectrometru de masă (CI/EI) • Ionizare în flacără (FID) • Pentru azot şi fosfor (NPD) • Flame - fotometric (FPD) • Emisie atomică (AED) • ICP, ICP-MS p.54 - Descrierea părţilor componente ale GC

Detectori distructivi

FPD

FID

NPD

AED p.55 - Descrierea părţilor componente ale GC

Detectori

Nedistructivi • Conductivitate termică (TCD) • Captură de electroni (ECD) • Fotoionizare (PID) • Infraroşu (FT-IR) • RMN p.56 - Descrierea părţilor componente ale GC

Detectori nedistructivi

TCD

PID

ECD p.57 - Descrierea părţilor componente ale GC

Cromatograme cu detectori diferiţi

p.58 - Descrierea părţilor componente ale GC

Nivel de zgomot, drift şi bleeding în cromatogramă

Picuri incomplet separate prin GC

p.60 - Condiţii de analiză GC-MS

Identificarea componenţilor pentru picuri incomplet separate prin GC

p.61 - Condiţii de analiză GC-MS

Soluţii hardware pentru separare incompletă

p.62 - Condiţii de analiză GC-MS

●

Stabilirea condiţiilor de analiză pentru GC ●

Condiţii la injector ●

●

Stabilirea condiţiilor de analiză

Debitul de gaz purtător ●

debit mare – viteză de eluţie mare >> pierdere de rezoluţie

●

debit mic – creşterea rezoluţiei >> creşterea timpului de retenţie

Volumul de injecţie – volum mare >> poate duce la depăşirea capacităţii coloanei pentru probă, volum mic >> senzitivitate scăzută

●

Temperatura ●

temperatură mare – mobilitate mare, vaporizare rapidă >> potenţial de degradare a compuşilor în injector

●

●

temperatură mică – depunerea compuşilor grei >> contaminare

●

Condiţii la coloană – prin optimizare în funcţie de natura probei

●

Condiţii la detector – temperatură acoperitoare pentru evitarea condensării compuşilor grei

Stabilirea condiţiilor de analiză pentru injectorul SSL ●

Temperatură acoperitoare (20-30 grade peste punctul de fierbere al celui mai greu compus)

●

Operare split – rată de splitare mai mare de 1:20, gas saver pentru economisire He

●

Operare split - splitless – timp de splisless 0.5 – 1 ml/min, debit de purjare mare (> 50 ml/min)

Temperatura injectorului

Volumul tubului de vaporizare

Vapoare optimă

Explicaţii

200 - 280°C

- asigură volatilizarea instantanee; -reduce efectul de degradare. Observaţie: de folosit valori mai mari în cazul probelor cu efect puternic de matrice şi analiţi cu p.f. ridicate

> 0,8 mL

în cazul injecţiei automate

< 0,7 mL

Tipul tubului de vaporizare

în cazul injecţiei manuale

fără umplutură cu vată de sticlă silanizată

Volumul injectat

Debit în circuitul de purjare a vaporilor

numai în cazul injecţiei manuale pentru autoinjecţie, probe cu efect de matrice pronunţat

0,5 -3 μL

20 - 50 mL/min

nu e un parametru critic

20 - 80 sec

în funcţie de natura probei

Temperatura internă a coloane

p.f.solv.= 25°C

în cazul focusării prin solvent

Debitul gazului purtător prin coloană

> 2 mL/min

Debitul de gaz purtător utilizat la purjarea septumului

1 - 5 mL/min

Timpul de splitare

Parametru

Spectrometria de masă

Importanţa MS în analiza structurală

Cuplajul GC-MS - compatibilitate ●

Faza mobilă în stare gazoasă, mobilitate mare  eliminare uşoară prin

sistemul de vid, interfernţă minimă cu proba ●

Sistem simplu pentru linia de transfer – este necesară numai termostatarea

●

Transfer al probei în fază gazoasă, cu puritate avansată

●

Limitare la capabilitatea de separare a metodei GC

●

Permite obţinerea ionilor moleculari cu energie ridicată (nu este necesară o ionizare

suplimentară cum ar fi la HPLC-MS pentru fragmentarea ionului molecular) – viteze mari de scanare în full scan ●

Precauţii ●

Limitele de temperatură la linia de transfer – minim 20oC sub limita

specificată pentru coloană ●

Calitatea coloanei – impurificare cu siloxani

●

Exploatarea incorectă a coloanei – impurificare cu siloxani

●

Probe cu impurităţi nevolatile cu masă mare (ex.trigliceride) – impurificare

●

Debitul incorect al fazei mobile – depăşirea capacităţii pompei de vid înalt

●

Volumul incorect de injecţie – contaminarea sursei

p.67 - Compatibilitatea GC-MS

●

Stabilirea condiţiilor de analiză pentru GC ●

Condiţii la injector ●

●

Stabilirea condiţiilor de analiză

Debitul de gaz purtător ●

debit mare – viteză de eluţie mare >> pierdere de rezoluţie

●

debit mic – creşterea rezoluţiei >> creşterea timpului de retenţie

Volumul de injecţie – volum mare >> poate duce la depăşirea capacităţii coloanei pentru probă, volum mic >> senzitivitate scăzută

●

Temperatura ●

temperatură mare – mobilitate mare, vaporizare rapidă >> potenţial de degradare a compuşilor în injector

●

●

temperatură mică – depunerea compuşilor grei >> contaminare

●

Condiţii la coloană – prin optimizare în funcţie de natura probei

●

Condiţii la linia de transfer – în mod curent o valoare acoperitoare

Stabilirea condiţiilor de analiză pentru MS ●

Domeniul de masă suficient de mare – domeniu mare >> viteză mică de achiziţie mică

●

Threshold – acoperitor pentru integrarea picurilor mici

●

Viteza de achiziţie – acoperitoare pentru forma picului cromatografic p.68 - Condiţii de analiză GC-MS

Schema spectrometrului de masă Introducerea probei

Ieşirea datelor

Intrare

Sursa de ioni (camera de ionizare)

Achiziţia de date

Separator de ioni

Pompe de vid

Detector

Sistemul de vid al spectrometrului MS Presiune (Torr) 760 1 10-3 10-5 10-7 10-9

Pompe de vid preliminar ex.”rotary-vane”

Pompă de difuzie

Drum liber mijlociu (meters) 6.0x10-8 4.5x10-5 4.5x10-2 4.5x10 4.5x102 4.5x104

Pompă turbomoleculară

Introducerea probei prin termodesorbţie

O H3C

N C

O

C

Introducerea probei prin sistem cromatografic

C H3 C

N CH

N H

C

informaţie obţinută : ● masa moleculară ● distribuţia izotopică ● fragmentarea ionului molecular

N Spectrometru de masă

(~1 nanogram)

compus pur separat cromatografic

194

Mass Spectrum Cromatograf

GC, HPLC, etc

E

Abundance

67

A

55

109

82

42

D

136

94

C

B

Proba: amestec A+B+C+D+E

40

60

80

100

120

Mass (amu)

140

165 160

180

200

Linia de transfer GC

Linia de transfer GC

Linia de transfer

Sistemul quick-swap pentru schimbarea coloanei fără vent

Introducerea probei prin ESI, TS, APCI, plasmaspray, nanospray

Introducerea probei prin ICP

Exemple de cuplaje posibile: - GC-ICP-MS - HPLC-ICP-MS - LA-ICP-MS

Exemple de metode de ionizare a probei

Schema camerei de ionizare clasice (EI) Colector pentru electroni

Electrod de focalizare

Ioni pozitivi Repeller

+

Molecule neutre

+

+

e- e- e_

+

Inlet

+

+

__ +

+

ioni către separator ul magnetic

Electroni

Filament

Electrod accelerare

+

+

Specii formate la ionizarea EI

Ionizarea chimică CI

Alura spectrelor în EI respectiv CI pentru efedrină

EI

CI

Ionizarea prin electrospray ESI

Alura spectrelor în EI respectiv ESI pentru amfetamină

Ionizarea prin desorbţie

Spectrul FD pentru polistiren

EI

Alura spectrelor în EI respectiv FI (field ionization)

FI

Ionizarea prin bombardament cu a t o m i r a p i z i ( FAB )

S p e c t r u l p o l i e t i l e n g l i c o l u l u i p r i n FAB

Ionizarea prin desorbţie asistată laser din matrice (MALDI)

Spectrul polistirenului prin MALDI

Schema separatorului de ioni cu sector magnetic traiectoria în domeniu traiectorie în afara domeniului (ioni prea uşori)

S Detector

Sursa de ioni N Electromagnet

traiectorie în afara domeniului (ioni prea grei)

Schema separatorului de ioni cu sector magnetic cu dublă focalizare

Geometrii cu focalizare dublă şi triplă

Schema separatorului de ioni cu filtru quadrupolic ion resonant ion nerezonant

_

Detector

+ + _

Sursa de ioni

Tensiune continuă şi alternativă

Schema separatorului de ioni cu trapă ionică, nanotehnologii

Schema separatorului de ioni cu timp de zbor (TOF)

Separarea ionilor – TOF

Schema separatorului de ioni orbitrap

Schema separatorului de ioni cu rezonanţă ciclotronică

Spectru ESI Q-FT-ICR

Schema cuplajului MS - MS

Var i a n t e d e c u p l a j M S - M S

Detectorul multiplicator de electroni

dinodă

microcanal

Detectorul multiplicator de fotoni

Rezoluţia spectrală

Rezoluţia spectrală MS

Mecanismul ionizării probei M + e-

M+. + 2eM+.

unde

M+. => ionul molecular

Ioni moleculari formaţi în EI: M+. (M+1)+. (M+2)+. ...

(M+1)+.

Abundenţa picurilor izotopice C10H14 C

10 * 1.11%

H

14 * 0.015% =

13 2

=

11.1% 0.21% -------

135

pic / 34pic

11.31%

Distribuţia izotopică naturală

Analiza izotopică

Determinarea formulei moleculare

Alura picurilor moleculare pentru compuşi cu Cl sau Br

Spectrometrul IR-MS pentru analiză izotopică

Spectrometrul IR-MS pentru analiză izotopică

Unităţile de măsură utilizate: ● As – abundenţa izotopului greu (n2):

As = Rs / (1 + Rs) x 100 [% atom]

unde Rs = n2 / n1 ●

APE (atom percent excess):

APE = As – Astd

unde Astd este valoarea standard ●

notaţia  utilizează raportarea la mie:  = ((Rs – Rstd) / Rstd) x 1000 [‰]

std - PDB – carbonul conţinut în carbonatul de calciu din Peedee – Carolina de sud (de origine marină, din Belemnitella americana)

Spectrometrul IR-MS pentru analiză izotopică (ex.provenienţa heroinei)

Evidenţierea fragmentărilor specifice pe baza distribuţiei izotopice pentru Cl sau Br

Regula azotului • compuşii organici cu număr par de atomi de N în moleculă au masa moleculară pară, compuşii cu număr impar de atomi de N au masa moleculară impară • ionii OE respectă regula azotului • ionii EE respectă regula azotului inversată

Picul molecular şi picul de bază - tetrahidrocanabinol PB PM

Dificultăţi în atribuirea spectrelor

Utilizarea bibliotecilor de spectre

Dificultăţi la căutarea în bibliotecă - spectru MDMA -

Energii relative ale orbitalilor moleculari în compuşi organici

Formarea ionului molecular în funcţie de localizarea electronului expulzat

Energii de ionizare pentru molecule şi radicali (în eV)

Tipuri de fragmentări

Diagrama energetică a fragmentării

Diagrama energetică a fragmentării exemplificare

Tipuri curente de pierderi de fragmente neutre

Pierderi de molecule neutre