Curs 12 Metode Fizico Chimice.docx

Modulul 5 – Biochimie Curs 12. Metodele de laborator pentru determinarea unor constant biologice ale organismului si compozitiei chimice a probelor biologice de analizat Metodele fizice utilizate in laborator - pH – metrie, spectrofotometrie, cromatografie, electroforeza Spectrofotometria Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizeaza transmiterea luminii printr-o solutie pentru determinarea concentratiei unui solut in solutia respectiva. Spectrofotometrul difera de colorimetru prin modul in care lumina este separata in lungimile de unda componente. Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizeaza filtre. Ambele se bazeaza pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscuta printr-o proba si masurarea cantitatii de energie luminoasa care este transmisa. Aceasta se realizeaza prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei respective. O raza de lumina este formata din fotoni; cand un foton intalneste o molecula de analit, exista sanse ca analitul sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie reduce numarul de fotoni din raza de lumina, astfel reducand intensitatea luminoasa.Toate moleculele absorb energie radianta la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie in spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenti. Proteinele si acizii nucleici absorb lumina in domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implica o sursa de lumina, o prisma, un suport pentru probe si o fotocelula. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controleaza intensitatea luminii, lungimea de unda si conversia energiei primite la nivelul fotocelulei in fluctuatii voltmetrice. Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scala metrica/digitala si valorile sunt inregistrate intr-un computer. Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba respectiva. Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba exponentiala. Transmitanta este procentul relativ de lumina care a trecut prin proba. Transmitanta procentuala este transformata intr-o functie logaritmica inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate optica). Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = - log10T). Aceasta valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia absorbantei versus concentratie determina o linie dreapa, absorbanta crescand odata cu cresterea concentratiei (transmitanta scade odata cu cresterea concentratiei de analit). Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii cunoscute de dilutii a unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine solut si este cunoscuta ca “blank”. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa citeasca 100% transmitanta pentru absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0% (absorbanta infinita) este stabilita prin plasarea unei bariere intre sursa de lumina si fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi efectuate prin simpla plasare a probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei pentru o serie de probe standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie. Panta dreptei reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este utilizata pentru conversia oricarei absorbante masurate in concentratia corespunzatoare (C = A/ε). Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila (de obicei avand ca sursa de lumina o lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV. Singura modificare necesara este inlocuirea tuburilor de sticla cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV si nu este potrivita pentru un spectrofotometru UV).

1

Modulul 5 – Biochimie Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt teste colorimetrice, distingandu-se urmatoarele tipuri de teste: - teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu una sau mai multe enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen peroxid, care in prezenta unui substrat, sub actiunea peroxidazei duce la formarea unui pigment iminoquinonic care este determinat fotometric, intensitatea culorii formate fiind proportionala cu concentratia analitului respectiv (ex: determinarea acidului uric cu utilizarea uricazei); - teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu reactivul cu formarea unui produs conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.: bilirubina se cupleaza cu ionul diazoniu in mediu puternic acid cu formarea azobilirubinei de culoare rosie); in cazul determinarii enzimelor, acestea cliveaza enzimatic un substrat specific, produsul rezultat fiind colorat/ se cupleaza cu un cromogen si formeaza un complex colorat; - teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul reactiilor care au loc este determinat fotometric in lumina ultravioleta, concentratia sa fiind direct, respectiv invers proportionala cu concentratia analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST). - teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce ofera o linearitate mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei). Turbidimetria si nefelometria: se bazeaza pe formarea de complexe antigen-anticorp in solutie. Solutiile de antigen si anticorp sunt mixate, fiind necesare cantitati foarte mici de reactiv; formarea de agregate survine rapid. Turbidimetria masoara cantitatea de lumina transmisa nedeviata prin solutie; fotosenzorul este plasat in linie dreapta cu sursa de lumina; o solutie complet limpede va transmite 100% din lumina; cu cat concentratia de particule este mai mare, cu atat mai putina lumina este transmisa. Ca si in colorimetrie se aplica legea Beer-Lambert. Nefelometria masoara cantitatea de lumina dispersata in unghi drept fata de raza de lumina, fotosenzorul fiind plasat la un unghi de 90° fata de sursa de lumina; o solutie complet limpede nu disperseaza lumina. Deoarece masuratorile nefelometrice vizeaza cresterile peste un nivel de baza zero (spre deosebire de turbidimetrie care vizeaza reduceri ale transmisiei sub 100%), nefelometria este mai sensibila la concentratii mici ale analitilor. Nefelometria de rata reprezinta masurarea kinetica a formarii agregatelor. Timpul in care panta curbei “lumina dispersata – timp” este maxima, este proportional cu concentratia de antigen. Aplicatii ale turbidimetriei si nefelometriei: determinarea albuminemiei si microalbuminuriei, a imunoglobulinelor IgA, IgG, IgM si a fractiunilor complementului C3c, C4. pH –metru pH-ul reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentrației ionilor din soluție. Prin noțiunea de pH se exprimă cantitativ aciditatea (sau bazicitatea) unei substanțe, pe baza concentrației ionilor numiți hidroniu H3O+. Pentru soluțiile foarte diluate se consideră că pH-ul nu mai este egal cu concentrația hidroniului, ci cu concentrația molară a soluției. Limite pH[modificare | modificare sursă] 0 ≤ pH < 7 => pH acid | soluție acidă pH = 7 => pH neutru | soluție neutră 7 < pH ≤ 14 => pH bazic (alcalin) | soluție bazică (alcalină) Indicatori acido-bazici 2

Modulul 5 – Biochimie 1. indicator | 2. mediu neutru | 3. mediu acid | 4. mediu bazic _________________________________________________________________ 1. fenolftaleina | 2. Incolor | 3. incolor | 4. roșu carmin _________________________________________________________________ 1. metiloranj | 2. oranj | 3. roșu | 4. galben _________________________________________________________________ 1. turnesol | 2. violet | 3. roșu | 4. albastru Măsurare pH-ul poate fi măsurat prin: 





Adăugarea unui indicator de pH în soluția de analizat. Culoarea luată de indicator variază în funcție de pH-ul soluției. Utilizarea indicatorilor pentru determinări calitative trebuie să țină cont de variația de culoare a acestuia, în funcție de pH-ul soluției (de preferat sunt indicatorii care variază pe un interval de pH cât mai mic). Utilizarea unui aparat pH-metru cu electrozi pH selectivi: electrod de sticlă, electrod de hidrogen, electrod de chinhidronă. Determinarea exactă a valorii pH-ului se face totuși prin metode combinate: utilizarea de indicatori împreună cu metode spectrofotometrice, pentru identificarea fiecărui constituent ce influențează pH-ul (culoarea indicatorului).

-

Valori reprezentative ale pH-ului Tipuri de substanțe pH Acid clorhidric - HCl , 1M 0.1 Acid de baterie 0.5 Acidul gastric 1.5 – 2.0 Suc de lămâie 2.4 Cola 2.5 Oțet - CH3COOH 2.9 Suc de portocală sau de măr 3.5 Bere 4.5 Ploaie acidă <5.0 Cafea 5.0 Ceai 5.5 Lapte 6.5 Suc intestinal 6-7 Apă pură / distilata - H20 7.0 Saliva omului sănătos 6.5 – 7.4 Sânge 7.34 – 7.45 Apă de mare 8.0 Săpun de toaletă 9.0 – 10.0 Amoniac - NH3 11.5 Înălbitor 12.5 Sodă caustică - NaOH 13.9

pH-ul urinei reprezintă reacţia urinei şi are valori normale între 4,8 şi 7,8

pH-metria esofagiană computerizată tip Holter reprezintă o tehnică modernă de investigare a acidităţii stomacului şi esofagului; 

În funcţie de tipul de electrod ataşat, metoda poate înregistra pH-ul la unul sau mai multe niveluri (esofag proximal, esofag distal, sfincter esofagian inferior, stomac) sau se 3

Modulul 5 – Biochimie poate folosi pentru înregistrarea concomitentă a presiunilor la nivelul tubului digestiv superior.  Procedura este utilizată pentru a preciza cantitativ severitatea refluxului gastric sau pentru a diferenţia patologia de reflux de alte boli.  Testul stabileşte dacă există o corelaţie între regurgitarea de acid şi diverse simptome: durere retrosternală, tuse seacă nocturnă, senzaţia de sufocare nocturnă, astm, răguşeală (disfonie), senzaţia de nod sau durere în gât. Procedura de investigare este următoarea:     



  







Pacientul este invitat să stea în poziţie şezândă sau aşezat pe masa de examinare într-o atitudine relaxată; În general nu este necesară sedarea deoarece testul nu este dureros, de obicei apărând o discretă senzaţie de disconfort nazal sau faringian de scurtă durată; Examinatorul introduce un tub (electrod) de unică folosinţă, foarte subţire şi flexibil prin nas în esofag, după o anesteziere locală prealabilă; Pentru a uşura introducerea electrodului trebuie să faceţi mişcări adânci de înghiţire, iar uneori puteţi fi invitat să beţi puţină apă; La vârful tubului există un senzor care monitorizează pH-ul prin măsurarea acidităţii. Tubul este petrecut şi legat în spatele urechii şi apoi adus în jos la un dispozitiv de înregistrare montat în jurul taliei. Electrodul plasat la nivelul esofagului, sfincterului esofagian inferior sau stomacului, transmite imagini dispozitivului de înregistrare şi stocare a informaţiilor, pe care pacientul îl poartă la brâu sau montat pe piept; În cursul investigaţiei (aproximativ 24 ore) subiectul examinării se poate mişca liber şi-şi poate continua activitatea, poate mânca, bea sau dormi; În funcţie de scopul pH-metriei, pacientul îşi poate lua sau nu tratamentul antiacid obişnuit; Cu ajutorul unor butoane şi comutatoare bolnavul va informa înregistratorul de pH ori de câte ori: o simte arsuri pe gât (pirozis), regurgitaţii şi mai ales durere retrosternală (în piept), o când stă culcat sau în picioare, o când mănâncă; După finalizarea procedurii, medicul vizualizează şi interpretează pe calculator curbele de pH înregistrate, le corelează cu durerile semnalate de bolnav, precum şi perioadele de clinostatism (poziţie orizontală), ortostatism (poziţie verticală) sau cu perioadele de prânz alimentar şi ulterior formulează diagnosticul endoscopic. Electrodul explorator care se conectează la înregistrator are aspectul unui tub flexibil cu un diametru de 2-3 mm care se introduce printr-o nară în faringe şi apoi în esofag sau stomac. La vârful tubului există un senzor care sesizează pH-ul şi transformă informaţiile despre aciditatea mediului în unde electromagnetice care vor fi trimise la înregistrator. După conectarea electrodului la pH-metru, se calibrează aparatul prin scufundarea succesivă a cateterului pentru 5 minute în soluţiile de calibrare standardizate (bazică, neutră şi acidă);

Reactii de latex-aglutinare: sunt teste serologice care se bazeaza pe reactia antigen-anticorp – microparticule de latex invelite in molecule de antigen/anticorp aglutineaza in urma cuplarii cu anticorpul, respectiv antigenul corespunzator din serul de testat. Latex-aglutinarea a fost adaptata pentru teste cantitative care utilizeaza turbidimetria/nefelometria, asigurand cresterea sensibilitatii. 4

Modulul 5 – Biochimie Aplicatii

in

laboratoarele

Synevo:

determinarea

ASLO,

CRP,

factor

reumatoid.

Cromatografia reprezinta un grup de metode de laborator care se bazeaza pe adsorbtia selectiva, prin care componentele unui amestec complex pot fi identificate si/sau purificate (adsorbtia reprezinta aderenta moleculelor la suprafata unei alte substante). Metoda a fost utilizata initial de botanistul rus Mikhail Tsvett pentru separarea de produsi intens colorati, de unde denumirea de cromatografie. Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri , care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare, se deplasează prin golurile primei faze). Indiferent de natura chimică sau starea de agregare, faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. Amestecul strabate sistemul cromatografic , fiind antrenat de către faza mobilă. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze, fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Cromatografia in coloana implica o faza mobila (lichid sau gaz) care curge peste o faza stationara (solida sau lichida). In cromatografia in coloana un amestec de molecule este separat pe baza afinitatii fiecarei molecule pentru faza mobila sau stationara: daca o molecula are o afinitate mai mare pentru faza stationara decat o alta molecula, atunci cea din urma va migra prin coloana mai rapid decat prima molecula. Solutia de analizat este adaugata prin partea superioara a coloanei si este apoi eluata cu solvent; fractiunile sunt colectate prin partea inferioara a coloanei. Exista mai multe varietati de cromatografie in coloana: cromatografia cu gel filtrare (excludere moleculara), cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu faza inversa, cromatografia cu gaz-lichid, cromatografia cu interactiuni hidrofobe, cromatografia cu afinitate, cromatografia cu separare. In cromatografia cu gel-filtrare (excludere moleculara) moleculele dintr-o solutie sunt separate in functie de marimea lor pe masura ce trec printr-o coloana de bile legate intre ele intr-o retea tridimensionala. Aceste bile polimerice (dextran, agaroza sau acrilamid) prezinta pori de anumite dimensiuni. Pe masura ce o proba trece prin coloana, moleculele mai mari decat dimensiunile porilor nu vor patrunde in ochiurile retelei ramanand in solutie, astfel incat ele vor elua primele din coloana. Moleculele mai mici vor patrunde prin pori in ochiurile retelei si astfel se vor deplasa mai lent prin coloana si vor elua ultimele din solutie. Pe masura ce proba elueaza la capatul coloanei fractiunile sunt colectate in tuburi. Fractiunile eluate sunt apoi testate pentru determinarea compozitiei si cantitatii componentelor respective prin spectrofotometrie, electroforeza sau teste functionale. Cromatografia cu gel filtrare este utilizata in primul rand pentru a purifica proteine sau alte molecule si poate fi utilizata pentru estimarea marimii unor proteine necunoscute (coloane calibrate cu proteine 5

Modulul 5 – Biochimie cu GM cunoscuta). In cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza incarcaturii lor ionice. Faza stationara este reprezentata de o rasina cu incarcatura fixa; daca aceasta incarcatura este negativa (carboximetil celuloza), procesul se numeste cromatografie cu schimb de cationi, iar daca incarcatura este pozitiva (dietilaminoetil celuloza), este cromatografie cu schimb de anioni. Faza mobila este reprezentata de o solutie tampon. Atunci cand o proteina trece prin coloana se poate lega de matrice si poate fi in continuare eluata prin cresterea concentratiei ionice a solutiei tampon (elutia poate fi privita ca o competitie pentru situsurile de legare ale matricei; pe masura ce puterea ionica a tamponului creste, o sare ionica din tampon va ocupa un situs al matricei si proteina va fi eluata din coloana). pH-ul solutiei tampon este critic in cromatografia cu schimb de ioni. Exista doua cai de efectuare a elutiei: prin gradient, in care concentratia salina creste constant si gradual in timpul procesului de elutie si elutia brusca, in care modificarea in concentratia salina este abrupta. Electroforeza, ca si cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizata ca un instrument eficient pentru analiza unui amestec de ioni. O fasie de hartie sau gel polimeric saturata cu un electrolit este asezata astfel incat sa traverseze doua solutii care contin electrozi. Amestecul de analizat este aplicat pe hartie/gel si cei doi electrozi sunt conectati la o sursa de inalta energie (~5000 volti). Ionii pozitivi vor migra intr-o directie, iar cei negativi in cealalta directie. Cu cat este mai mare incarcatura ionului, cu atat va migra mai departe. Metoda este in mod special utila pentru separarea amestecurilor proteice. In cromatografia cu faza inversa moleculele sunt legate de o matrice hidrofoba (hidrocarburi cu lant lung legate de o matrice de silicon) intr-un tampon hidrofil. Moleculele pot fi apoi eluate prin scaderea polaritatii tamponului, de exemplu prin cresterea concentratiei de alcool sau alt solvent nepolar din tampon. Cromatografia cu afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare; moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport, din care este efectuata o coloana; peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii continuti in coloana; proteina este apoi eluata, fie prin modificarea conditiilor din coloana (modificarea pH-ului sau concentratiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra in competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de liganzi in functie de substanta de purificat: substrat, inhibitor, cofactor (pentru enzime), antigene (pentru anticorpi), secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). Cromatografia lichida de inalta performanta utilizeaza pompe care furnizeaza presiuni inalte care imping solventii prin coloane metalice. Aceasta creste viteza procesului de separare si previne raspandirea solutiilor care poate aparea in cromatografia in coloana gravitationala. Separarea are loc in minute in loc de ore si este net superioara. Utilizand cromatografia cu faza inversa pot fi separate doua proteine a cate 100 aminoacizi fiecare care difera printr-un singur aminoacid. Cromatografia cu gaz utilizeaza un lichid cu punct de fierbere inalt impregnat intr-un suport solid inert ca faza solida si heliu ca faza mobila, intregul sistem fiind incalzit. Solutul este injectat in coloana si se volatilizeaza imediat, heliul indepartand componentele din coloana, fiecare component fiind inregistrat de un detector care determina cantitatea relativa a acestuia. Polaritatea si volatilitatea componentelor determina timpul cat acestea sunt retinute de coloana. Capacitatea coloanei in cromatografia cu gaz fiind foarte mica, aceasta este utilizata in principal ca un instrument analitic. In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie coloana este inlocuita cu un strat adsorbant (silicon, aluminiu, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu. 6

Modulul 5 – Biochimie Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe placuta prin actiune capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite. In final se aplica un agent oxidant, astfel incat fiecare component apare ca o pata intunecata pe placuta, localizarea si marimea fiecareia dintre acestea servind pentru identificarea si masurarea cantitatii relative a componentelor. Aplicatii ale cromatografiei in laboratorul Synevo: determinarea acidului vanilmandelic, metanefrinelor si 17-cetosteroizilor urinari. Electroforeza Electroforeza este una din metodele eficace pentru studiul proteinelor serice (separarea si identificarea diferitelor fractiuni proteice). Crearea unui camp electric intr-o solutie care contine particule coloidale incarcate electric determina migrarea acestora spre anod sau spre catod, in functie de sarcina electrica. Fenomenul poarta denumirea de electroforeza. Electroforeza bidimensională (2-DE) este o tehnică care combină focusarea izoelectrică (metoda în care separarea se face pe baza sarcinii totale) cu SDS-poliacrilgelelectroforeza (metoda în care proteinele sunt separate pe baza masei moleculare). Combinarea celor două metode conduce la îmbunătăţirea rezoluţiei separărilor amestecurilor complexe de proteine. Proteinele astfel separate pot fi observate sub forma unor spoturi situate în geluri . Această tehnică este indispensabilă pentru cercetătorii care lucrează în domeniul proteomicii, disciplină care vizează studiul structurii, interacţiunilor, şi a funcţiilor biologice a proteinelor rezultate în urma expresiei genomului (sub forma proteomului) unui organism. De asemenea, această tehnică permite separarea izoenzimelor, proteine a căror masă moleculară este apropiată şi au funcţii asemănătoare, dar care se diferenţiază prin compoziţia acestora în aminoacizii componenţi (din structura primară a proteinei).

7