Cuantificacion De Proteinas

Carrera de Bioquímica. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Curso de Bioquímica I.

Informe trabajos prácticos I y II Técnicas y conceptos para el laboratorio de Bioquímica; Cuantificación de la concentración de proteínas.

Consuelo Contreras F. Francisco Guajardo G. Grupo I 10 de Abril del 2019

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INTRODUCCIÓN

Las proteínas desempeñan un papel extremadamente importante en muchos procesos biológicos, actuando como enzimas, hormonas, neurotransmisores, transportadores a través de la membrana celular.

El desarrollo de metodologías y estudios comparativos de metodologías espectrofotométricas para la determinación de proteínas siempre fueron de gran interés para profesionales, tanto ligados a la industria de alimentos, laboratorios de análisis clínicos, como también para investigadores de diversas áreas [3].

La medición de una concentración de proteína solubilizada en solución es un ensayo importante en los laboratorios de investigación y aplicaciones bioquímicas que van desde estudios enzimáticos hasta el suministro de datos biofarmacéuticos.

Los ensayos espectrofotométricos de cuantificación de proteínas son métodos que utilizan UV y espectroscopia visible para determinar rápidamente la concentración de proteína, en relación con un estándar, o usar un coeficiente de extinción asignado. Cuando se necesitan mediciones para múltiples muestras, y/o el volumen y la concentración de la muestra son limitados, se pueden usar preparaciones del colorante Coomassie comúnmente conocido como el ensayo de Bradford. [2]

Las proteínas muestran un espectro de absorción ultravioleta (UV) característico alrededor de 280 nm predominantemente de los aminoácidos aromático tirosina y triptófano. La absorbancia UV se usa rutinariamente para dar una estimación de la concentración de proteína, pero si se conoce el coeficiente de extinción molar de la proteína, entonces se puede usar la ley de Beer-Lambert para cuantificar con precisión la cantidad de proteína por absorbancia UV, asumiendo que la proteína es pura. 𝐴 = 𝜀𝑙C Donde 𝜀 = Coeficiente de extinción, l= Longitud de trayecto y C= Concentración

La ventaja de la cuantificación de la proteína de absorbancia UV es que la muestra se puede recuperar y es relativamente cuantitativa si se conoce su coeficiente de extinción preciso.[2]

Para la cuantificación de la concentración de proteína se utilizarán dos técnicas las cuales se basan en los siguiente; El mecanismo básico del ensayo Bradford es la unión del colorante a pH ácido a los residuos de arginina, histidina, fenilalanina, triptófano y tirosina, y las interacciones hidrofóbicas. Al unirse a la proteína se observa un cambio metacromático de 465 a 595 nm debido a la estabilización de la forma aniónica del colorante. [2] 1

Mientras que el mecanismo básico del ensayo de Biuret, en la reacción se forma un complejo de quelación coloreado con los enlaces peptídicos en presencia de una solución alcalina de sulfato cúprico.

Los tripéptidos y los polipéptidos o proteínas más grandes reaccionarán para producir el complejo de azul claro a violeta que absorbe la luz a 540 nm. Un ion cúprico forma el complejo de coordenadas coloreadas con 4 a 6 enlaces péptidos cercanos. La intensidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos que participan en la reacción. [1]

Este informe, tiene por objetivo, abordar diversos aspectos de los métodos espectrofotométricos utilizados para la determinación de proteínas. 2

MATERIALES Y MÉTODOS • • • • • • • • •

Micropipetas p20, p200 y p1000. Solución stock K2Cr2O7 6.8 mM. Solución stock HClO4 0,07 M. Espectrofotómetro* Tubos de ensayo de vidrio. Cubeta de plástico de paso óptico de 1 cm. Solución de Reactivo de Bradford. Solución de Reactivo de Biuret. Muestra problema de concentración desconocida.*

Trabajo Práctico n°1: Con el fin de conocer el uso correcto del material volumétrico, instrumentación fotométrica y del método de curva de calibración, se prepararon 10 soluciones patrón de K2Cr2O7 a partir de la solución stock de la misma, las cuales se encontraban en un rango de 0 a 3,5 mM de K2Cr2O7. Posteriormente, para asegurar una buena medición, se calibra el espectrofotómetro con una solución blanco, compuesta solo por HClO4 y agua destilada a una longitud de onda de 380 nm. En la misma longitud de onda, se miden las soluciones patrón hasta la obtención de las absorbancias correspondientes.

Trabajo Práctico n°2: Para este segundo práctico, se aplica el concepto desarrollado en el práctico anterior de curva de calibración y se ejecutan dos métodos de cuantificación de proteínas, Bradford y Biuret. Para ambos métodos se preparan 5 soluciones patrón de la proteína BSA con rangos entre 1

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a 10 µg/ml para Bradford y 0,5 a 5 mg/ml para Biuret. Cada solución patrón debe tener un volumen final de 1 ml.

Para el método de Bradford, luego de agregar la concentración estimada de BSA, se agrega 200 µl de la solución entregada de reactivo Bradford. Se ajustó la longitud de onda del equipo a 623 nm y se midió por triplicado las 5 soluciones patrón preparadas. Luego se obtener la curva de calibración correspondiente, se procede a diluir la muestra problema. Se realiza un triplicado de la absorbancia de la dilución preparada y calcular de concentración de la muestra problema.

Para el método de Biuret, luego de agregar la concentración estimada de BSA, se agrega 500 µl de la solución entregada de reactivo Bradford. Se ajustó la longitud de onda a 518 nm y se procede de igual forma al método de Bradford. Se realiza una medición por triplicado de 5 soluciones patrón preparadas. Se obtiene una curva de calibración y luego se diluye la muestra. Se realiza un triplicado de la absorbancia de la dilución preparada y se calcula la concentración de la muestra problema mediante la ecuación de la recta de la curva de calibración previamente obtenida. .

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RESULTADOS

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DISCUSIÓN

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CONCLUSIÓN

Al momento de realizar la cuantificación de proteína por medio de los distintos métodos efectuados, da cuenta de la ventaja de sus usos, ya que estos son fáciles de utilizar, requieren de poco tiempo, tienen una alta sensibilidad, precisión y exactitud.

Se debe analizar varios factores al momento de elegir una de estas metodologías para la determinación de concentración de proteínas, como las limitaciones instrumentales, las propiedades fisicoquímicas de la proteína, la naturaleza de su cadena aminoacídica, su concentración y la interacción con el solvente, la sensibilidad del método, el volumen de muestra disponible, el coste de metodología, el grado de confiabilidad de los resultado, pero uno de los mas esenciales, el conocimiento lo más preciso posible de la naturaleza de los constituyentes de la muestra, esto permitirá identificar posible interferentes.

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El uso de más de un método en soluciones nos permitirá contraponer lo valores obtenidos y verificar una correcta cuantificación o al contrario, sobre todo en soluciones que pudiesen tener algún interferente. Pudiendo obtener de esta manera valores experimentales cercanos al valor real. 6

REFERENCIAS

[1] Krohn, R. I. (2011), The Colorimetric Detection and Quantitation of Total Protein. Current Protocols in Cell Biology, 52: A.3H.1-A.3H.28. doi:10.1002/0471143030.cba03hs52 [2] Noble, J. (2014). Quantification of Protein Concentration Using UV Absorbance and Coomassie Dyes. Middleex, Inglaterra: Elsevier. doi:http://dx.doi.org/10.1016/B9780-12-420070-8.00002-7 [3] Zaia, Dimas A. M., Zaia, Cássia Thaïs B. V., & Lichtig, Jaim. (1998). Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, 21(6), 787-793. https://dx.doi.org/10.1590/S010040421998000600020

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