Cromatografia En Columna

Cromatografía, técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva (no confundir con absorción). La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930. Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que la disolución va filtrándose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente.

En la cromatografía en columna la fase estacionaria se mantiene dentro de una tubo angosto y la fase móvil es forzada a pasar a través del tubo bajo presión o por gravedad. La cromatografía en columna utiliza un amplio espectro de adsorbentes sólidos, incluidas la sílice, la alúmina y la sílice gelatinosa. También los líquidos pueden ser adsorbidos en estos sólidos y a su vez sirven como adsorbentes (un proceso denominado cromatografía de reparto) permitiendo al químico elaborar columnas de diferentes propiedades para diversas aplicaciones. En la cromatografía con líquidos de alto rendimiento, una variante de esta técnica de uso frecuente hoy en día, se utilizan líquidos adsorbidos en partículas muy pequeñas y uniformes, lo cual proporciona una sensibilidad bastante alta. Para llevar la mezcla a través de la columna se precisa una bomba.

El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar : peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna

La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna. La elución comprende el lavado de un soluto a través de una columna por agregado del disolvente fresco. El movimiento del soluto puede ocurrir solo en la fase movil, la velocidad promedio a la cual un soluto migra depended de la fraccion de tiempo que gasta en esa fase; esta fraccion es pequeña para los solutos que son retenidos energicamente por la fase estacionaria y grade donde la retencion en la fase movil es de mayor afinidad.

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor

La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.

En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico).