Crecimiento Microbiano-parte2

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CRECIMIENTO MICROBIANO

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

ENERGÉTICA DE CRECIMIENTO. 1. NATURALEZA Y ORIGEN DE LA ENERGÍA UTILIZADA EN EL CRECIMIENTO.

Desde el punto de vista energético, un organismo en crecimiento es un sistema en el que la energía producida por las reacciones catabólicas se transfiere a la cadena de reacciones anabólicas.

De acuerdo con el segundo principio de termodinámica, sólo una parte de la energía total proporcionada por el sustrato, es decir, del calor de la reacción (▲H) correspondiente al calor de la transformación del sustrato en productos metabólicos, es teóricamente convertible en trabajo, lo que se expresa por la reacción clásica: ▲H = ▲F + T ▲S

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Fig 91. Representación esquemática del intercambio energético en la célula en crecimiento (vease explicación del texto) - Variación total de energía durante la transformación del sustrato energético en productos metabólicos: ▲H= ▲F + T ▲S (▲H: calor de reacción; ▲F: variación de energía libre; T ▲S : variación de entropía del sistema a la temperatura absoluta T) - Enu: energía biológicamente no utilizable. - En: energía biológica utilizable por el ATP, los piridinnucleotidos reducidos (PNH2), etc.… (Eu < ▲F). - E1 y E2: energía biológicamente utilizable disipada en forma de calor en las reacciones anabólicas de síntesis de los monómeros celulares y de su polimerización. - Ec: energía biológicamente utilizable que queda incorporada en la sustancia celular: variación positiva de entalpía del crecimiento. Ec= Eu – (E1+E2)

2. NECESIDADES ENERGÉTICAS Y ENTALPÍA DE CRECIMIENTO EN LOS MICROORGANISMOS HETEROTRÓFICOS. La importancia del ATP como vector de energía ha llevado a Sokatch y Gunsalus (1957) y a Beauchop y Elsden, a referir el rendimiento no a la cantidad del sustrato metabolizado, como solía hacerse, sino a la ganancia neta de ATP proporcionado por el sustrato (Y ATP). Estas determinaciones se han realizado en anaerobiosis y para fermentaciones cuyos mecanismos enzimáticos son conocidos, a fin de calcular con exactitud la cantidad de ATP producida. Además, los organismos se han cultivado en medios complejos, en cantidades elevadas de peptona y de extracto de levadura.

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TABLA 21 Rendimiento del crecimiento por mol de ATP Organismo

Medio

Sustrato

Vía

Y

metabólica Streptococcus faecalis

parcialmente

YATP

glucosa

E.M

22

11

definido -----------

complejo

glucosa

E.M

23

11.5

-----------

parcialmente

arginina

A.D

10.5

10.5

definido ----------

complejo

arginina

A.D

10

10

Saccharomyces

parcialmente

glucosa

E.M

21

10.5

cerevisiae

definido

Zymomonas mobilis

complejo

glucosa

E.D

8.6

8.6

Desulfovibrio

complejo

piruvato

P.D

10.2

10.2

------------

sintético

piruvato

P.D

9.6

9.6

------------

sintético

lactato

P.D

9.9

9.9

desulfuricans

Rendimiento expresado en gramos (peso seco) de células formadas por mol de sustrato consumido (Y) o por mol de ATP producido (YATP). Vías metabólicas: E.M: Embden-Meyerhof; A.D: arginindihidrolasa; E.D: EntnerDoudoroff; P.D: descarboxilación fosforoclastica.

Esta notable constante de Y ATP tiene varias consecuencias importantes. Significa que, en los organismos en cuestión, la polimerización de las macromoléculas

celulares

(proteínas,

ácidos

nucleicos,

lípidos

y

polisacáridos) se lleva a cabo mediante procesos energéticos equivalente a, sin duda, idénticos o muy parecidos. Significa, asimismo, que toda la energía biológicamente utilizable producida en forma de ATP es utilizable para el crecimiento, existe un acoplamiento energético estricto entre las reacciones catabólicas y anabólicas.

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La nueva constante biológica Y ATP proporciona un procedimiento muy sencillo y elegante para determinar el rendimiento de las fosforilaciones que se producen en cualquier proceso metabólico. Basta dividir el rendimiento molecular del crecimiento por Y ATP, es decir por 10.5 para obtener la ganancia neta de ATP por mol de sustrato metabólico valiéndose de este método. Elsdene ha demostrado que en varias bacterias aerobias, y principalmente Eschirichia coli, el rendimiento de la fosforilización oxidativa es, como en las mitocondrias de tres moles de fosfato eterificada y de ATP producidos por par de electrones transportadores (P/O= 3).

Basándose en datos ya publicados sobre la composición de la célula bacteriana y sobre los mecanismos de polimerización de las distintas macromoléculas, Gunsalus y

Shuster (1961) han calculado el consumo

teórico de ATP para el crecimiento en un medio nutritivo complejo, encontrando que la polimerización de un gramo de células (tabla 22) necesita unos 30 mili equivalentes de ATP, lo que teóricamente correspondería a la producción a la producción de 33 g de células por mol de ATP. Por tanto, el rendimiento experimental (Y ATP = 10.5) es sólo la tercera parte del resultado teórico, otros procesos en los que se producen cantidades importantes de ATP. Como pueden ser el transporte activo de los metabolitos a través de la membrana citoplasmática.

La locomoción es el caso de organismos móviles y algunos procesos de la división celular todavía mal conocidos. Por ultimo, se ha demostrado (F.Gross, 1965) que por cada siete moléculas de proteínas sintetizadas por la célula tiene que formarse una molécula de ARN mensajero. La energía libre incorporada en la materia viva, queda reducida a la de los enlaces covalentes que se forma entre los monómeros de las macromoléculas.

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TABLA 22 Gasto teórico de ATP en la polimerización de las macromoléculas celulares Sustancia

Peso

Monómeros

Equivalentes

de ATP

para la

polimerización

seco (por 100) Peso

m moles

por

M moles por g

molecular

por gr de

monómero

de células

medio

células

Proteínas

60

110

5.45

3

16.35

Ácidos

20

300

0.666

5

3.33

Lípidos

10

60

1.66

3

4.98

Polisacáridos

10

166

0.60

2

1.20

nucleicos

Según Gunsalus y Shuster (1961)

Y los valores del calor de hidrólisis de las uniones peptidicas y fosfóricas, que son respectivamente de -6 y -9 kcal/mol. El valor así obtenido de 38.8 calorías por gramo de células, mientras que la ATP consumido corresponde a un gasto energético real de unas 760 calorías.

Es evidente que unas de estas consideraciones teóricas, sólo tiene significado aproximativo. Sin embargo, concuerdan con algunos datos experimentales obtenidos por milicalorimetría. Sin embargo, se ha observado que incluso en la condiciones experimentales más favorables y utilizando del crecimiento bacteriano no llega a rebasar ni en un 1 por 100 a la energía metabólica total, valor demasiado pequeño para poder medirlo de modo experimental.

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3. Crecimiento energéticamente desacoplado.

Como se ha señalado antes, la constancia de Y ATP indica que en las condiciones de cultivo particulares en las que se ha medido esta magnitud, toda la energía biológicamente utilizable que se produce en las reacciones catabólicas es utilizada para el crecimiento.

Tabla 23 Crecimiento energéticamente desacoplado para la fuente de nitrógeno

Organismo

Sustrato

Fuente de

carbonado

nitrógeno

D.

Proporción

Tasa de crecimiento

celular de

Rendimiento

actividad

(r)

catabólica

lactato

NH4

0.216

0.065

1.77

Lactato

N2

0.097

0.033

1.72

glucosa

NH4

0.666

0.268

9.55

glucosa

NO3

0.387

0.136

10.20

desulfuricans

A. aerogenes

Existen sin embargo, otras condiciones de cultivo en las que se produce el desacople energético durante el crecimiento (Semez, 1962). En la tabla anterior, se exponen dos ejemplos. La tasa de crecimiento de las bacterias sulfatoreductoras

(Desulfovibrio

desullfoficuns)

se

reduce

aproximadamente a la mitad cuando estos organismos fijan N2 en vez de asimilar NH4, su fuente de nitrógeno usual. La reducción de la Tasa de Crecimiento (r) va acompañada de una disminución prácticamente equivalente del Rendimiento Ponderal (K) respecto al Sustrato carbonatado (lactato).

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En cambio la Tasa Celular de Actividad Catabólica (A), es decir, la cantidad de sustrato metabolizado por unidad de células y de tiempo, es idéntica en los dos tipos de cultivo (Le Gall y Senz, 1960). Se observan hechos análogos cuando se cultiva Aerobacter aerógenes en anaerobiosis en un medio glucosado que contiene como fuente de nitrógeno nitrato, en lugar de amoniaco, o cuando (Roseemberg y F. Laden, 1960) Strepptococcus faecalisse cultiva en quimiostato, con la tasa de crecimiento limitada por un aminoácido esencial (triptofano). Por tanto, la Energía Libre utilizada para el crecimiento (Eu) sólo puede proceder de la energía libre así definida. Además, dado que esta energía ha de producirse en forma biológicamente utilizable, la energía útil representa sólo una fracción de la Energía Libre Total (Eu < ▲F).

En el transporte biológico de energía, el adenosintrifosfato (ATP) desempaña una función capital

En efecto, el ATP interviene directa o indirectamente en la síntesis de la mayoría de los componentes celulares a partir de las fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, etc. Y como se verá más adelante.

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La cantidad total de la energía transportada por el enlace ATP ha sido determinada con exactitud por Meyorhof y Lohmmann (1932) midiendo el calor de hidrólisis del ATP hasta adenosintrifosfato (ATP).

▲H = -12.5 Kcal/mol

ATP + H2O = ADP + PO4H3

En cambio, la variación correspondiente de energía (▲F), es decir, la energía utilizada transportada solo se conoce de forma aproximada, pues aunque se sabe que depende de varios parámetros, especialmente de la ++

concentración en iones Mg, se ignora su valor a nivel de los sitios intracelulares donde se intercambia la energía por medición del ATP, los valores obtenidos oscilan según los autores, ente -7.4 a -10.1 Kcal/mol, considerándose en la actualidad como más probable el de -8 Kcal.

Estos cálculos están realizados sobre el valor de 8 Kcal para la energía libre de la fosforilación del ADP en ATP y considerándose que el rendimiento de la Fosforilización Oxidativa es, como en las mitocondrias, de tres enlaces Anhidro Fosfórico por cada par de electrones transportados entre los Pirínucleótidos (PNH2) y el oxigeno (relación P/O= 3).

Los rendimientos son de un sólo 30 por 100 en las fermentaciones y no sobrepasan las proporciones máximas de la energía libre catabólicas que puede utilizarse para el crecimiento de los organismos heterótrofos que se desarrollan en medios orgánicos complejos.

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Tabla 20 Ganancia neta de ATP y rendimiento de la energía biológica útil en la respiración y en los distintos tipos de fermentación de la glucosa. ▲F

ATP

Formado

(Kcal/mol) Ganancia neta

F

Rendimiento

(moles por mol de

(Cal)

energético

sustrato

(por 100)

metabolizado) fermentación alcohólica *

-55.9

2

16

28.6

-49.7

2

16

32.2

-688.2

38

399

67.3

-51.9

3

24

46.2

(glucosa = etanol +2 CO2 Fermentación

homoláctica

(glucosa = 2 lactato) oxidación aerobia

completa

de

la

glucosa ** (glucosa + 6 O2= 6 CO2 + 6 H2O) Fosforilación oxidativa de

los

piridinnnucleotidos

(PN) y con una relación P/O=3 PNH2 + 0.5 O2= PN + H2O

*Por la vía de Embden-Meyerhof. **Por la vía de Embden-Meyerhof, acoplada con el ciclo tricarboxilico y la fosforilación oxidativa. Los rendimientos energéticos de las fosforilaciones se han calculado sobre la base de 8 Kcal para la hidrólisis de ATP a ADP y ortofosfato.

En general los factores limitantes influyen en la tasa de crecimiento sólo cuando sus concentraciones son muy pequeñas y en el caso de los sustratos carbonados, mucho menores que las utilizadas en los medios de cultivo usuales.

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Por ejemplo en el caso ya citado de E. coli y de la Glucosa la concentración que corresponde a la mitad de la tasa máxima de crecimiento -5

(0.5 Rmáx) es de 2.2 x 10 M, o sea 3.9 ug/ml.

Los demás factores limitantes (fuente de nitrógeno, sales minerales, vitaminas y aminoácidos, etc.) actúan sobre la tasa de crecimiento a dosis aún menores que los sustratos carbonados y como en el caso de la figura 86. R = r máx ___C C1 + C

En el que r es la tasa de crecimiento observada; r máx. la tasa máxima; C la concentración de factor limitante, y C1 la concentración del factor limitante para que la tasa de crecimiento sea la mitad de la máxima.

Temperatura: A temperaturas próximas al óptimo térmico, una elevación de 10º C hace que se duplique la tasa de crecimiento (Q10 = 2) y principalmente la actividad enzimatica, sigue la ley de Arrhenius:

d loger = P dT RT²

En esta expresión exponencial, r es la velocidad de la reacción considerada (en este caso, la tasa de crecimiento exponencial).

T es la temperatura absoluta; R la constante de los gases perfectos y u el incremento crítico de temperatura.

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La temperatura de Arrehenius toma la forma siguiente, donde C es la constante de integración:

Log10 r = -u (1) + C 4600 T

En esta fórmula se ve que dentro de la gama de temperaturas en que la que el crecimiento sigue la ley de Arrehenius, el logaritmo de r es una función lineal respecto a la inversa de la temperatura absoluta (1/T) y que la pendiente de la recta representativa permite determinar gráficamente el valor de u.

Fig 87. Influencia de la temperatura sobre el crecimiento y sobre la actividad respiratoria de Aerobacter aerogenes, cultivado en aerobiosis en un medio sintético (J. C Senez. Revs, 26, 95, 1962). Parte superior de la figura: rendimiento del crecimiento (G= miligramos de peso seco de bacterias por miligramo de glucosa consumida. Parte inferior: en ordenadas, logaritmos de la tasa de crecimiento (r) y de la actividad respiratoria (QO2). En abscisas: inversa de la temperatura absoluta (1/T)

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En la tabla 19, se exponen los valores de Rmáx y de tg de algunas bacterias cultivadas en las condiciones más favorables, es decir, temperatura óptima (por lo común, +37Cº) y en medios ricos (caldo peptonado o extracto de levadura). Por ejemplo, en el caso de E. coli, tg es de una hora con xilosa. En general, los actinomicetos se desarrollan mucho más lentamente que las eubacterias y algunas bacterias autótrofas,

como las nitrificantes (Nitrosococcus,

Nitrobacter), que tienen tiempos de división de varios días. En las levaduras, los tiempos de división son del orden de una hora para las especies más activas y en condiciones óptimas.

La tasa máxima de crecimiento de las bacterias representa un potencial de multiplicación considerable. En Efecto, es la masa de una bacteria esférica 18

de una micra de diámetro, que contenga aproximadamente 5-10 g, aplicando la ecuación de crecimiento, se tiene que a partir de una de estas células se formará una equivalente a la de la tierra 27

-13

(6-10 g, n= log2 Xt = 3.322 (log10 6-10 - log10 5-10

))

es decir, unas ciento treinta y dos divisiones. En fase exponencial, este número de divisiones se alcanzaría tan solo en veintidós horas para las bacterias marinas Pseudomonas matriengens, cuyo tiempo degeneración es de diez minutos (Eagond, 1962), y en 44 horas para E.coli y la mayoría de los enterobacterias (tg= 20 min).

Entre los factores que influyen en la velocidad de crecimiento dos, de ellos, la concentración del Factor Limitante y la Temperatura son de particular interés.

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Concentración del Factor Limitante. En la fig 85 se representa la velocidad de crecimiento de E. coli en función de este sustrato es el factor limitante mientras que los demás componentes se encuentran en exceso.

Tabla 19 Velocidad máxima de crecimiento de diversas bacterias en medios ricos y a temperaturas óptimas. Tg (minutos)

Rmáx

Pseudomonas natriegens

9.8

6.1

Coli-aerogenes

20

3

Salmonella, Proteus, Vibrio

20-30

3-2

Staphylococcus,

25-30

2.4-1.7

Pseudomonas sp

30-40

2-1.5

Corynebacterium

35-40

1.7-1.5

Clostridium

40-80

1.5-0.7

100

0.6

Azotobacter

30-240

2-0.25

Phytomonas

75-165

0.8-0.36

1620 (27 horas)

0.037

Streptococcus

Lactatobacillus

Mycobacterium tuberculosis

Cualquiera que sea la naturaleza del factor limitante, se obtienen curvas análogas, tal sucede, por ejemplo, con la influencia de la concentración del triptofano sobre la tasa de crecimiento de un mutante de E. coli autrofo para este aminoácido.

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Fig 85. Tasa de crecimiento de Escherichia coli en función de la concentración de glucosa. (Según J. Monod, Recherches sur la coinsance des cellules bactereriennes, Hermann. Paris, 1942).

Fig. 86 Tasa de crecimiento, en función de la concentración de Triptofano, de un mutante de Escherichia coli, auxotrofo para este aminoácido. (Según A. Novick. Ann. Rev. Microbiol. 9, 97,1955).

La viabilidad de los microorganismos se prolonga de forma considerable, mediante la liofilización, procedimiento que consiste en una desecación a vacío y en estado de congelación por sublimación del agua.

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