Columna-de-winogradskky.pdf

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CIANOBACTERIAS, BACTERIAS PÚRPURAS, BACTERIAS VERDES: PREPARACIÓN DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY I.

INTRODUCCION

El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede realizarse mediante una columna de Winogradsky, que es un instrumento útil para estudiar y demostrar las relaciones entre diferentes tipos de microrganismos en comunidades mixtas, y constituye una forma de observar como los microespacios altamente específicos, de acuerdo con sus tolerancias medio ambientales y sus necesidades vitales, como los requerimientos de carbono, energía y oxígeno, así como la interdependencia, de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa.

La columna de Winogradsky se preparan con muestras de lodo residual, las cuales son enriquecidas con compuestos orgánicos e inorgánicos y finalmente es expuesta a una fuente de luz en todo el proceso. Transcurrido tres o cuatro semanas se empieza a observar cambios en la columna, es decir aumenta la cantidad de los distintos tipos de microorganismos, mismos que de acuerdo con sus características fisiológicas se establecen en las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo que se conoce como sucesión. De esta forma, el resultado es una columna estratificada (zonas de diferente color) tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se relaciona con un proceso químico-biológico. En la zona inferior de lodos se desarrollan organismos fermentadores que producen alcohol y ácidos grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos constituyen el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato, las cuales como resultado de su metabolismo liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias púrpuras que no utilizan el azufre y que obtienen su energía de reacciones luminosas, pero que emplean ácidos orgánicos como fuente de carbono para su síntesis celular. Finalmente, en la zona aerobia crecen las Cianobacterias y algas las cuales como producto de su metabolismo liberan oxígeno. También pueden crecer bacterias que oxidan compuestos del azufre y del nitrógeno hasta sulfatos y nitratos respectivamente. Todos estos grupos sintetizan su materia orgánica a partir del CO2.

II.

OBJETIVOS  Demostrar mediante la columna de Winogradsky como los microorganismos ocupan microespacios específicos de acuerdo a sus necesidades ambientales y vitales  Comparar y relacionar la diversidad microbiana presente en microambientes de la columna de Winogradsky.

III.

MARCO TEÓRICO

Una vez establecida la columna, se pueden diferenciar tres zonas características en base a su concentración relativa de oxígeno: 1) zona aeróbica, es la más superficial, dispone de una alta concentración de oxígeno; 2) zona microaerófila, inmediatamente debajo de la anterior, con una menor concentración de oxígeno; 3) zona anaeróbica, que constituye el lecho de lodo. a) Zona aerobia (rica en Oxígeno) La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente en los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos contaminados, etc.). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse

y

establecerse

en

nuevas

áreas.

Puede

desarrollarse

también

microorganismos fotosintéticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxígeno que producen estos productores primarios difunde desde la superficie, creando condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes. b) Zona anaerobia (sin Oxígeno) Hay dos tipos de organismos que pueden crecer en condiciones anaerobias: los que fermentan la materia orgánica o los que realizan la respiración anaerobia. La fermentación es un proceso en el que los compuestos orgánicos son degradados de forma incompleta (por ejemplo, las levaduras fermentan los azúcares a alcohol). La respiración anaeróbica es un proceso en el que los sustratos orgánicos son completamente degradados a CO2, pero usando una substancia distinta del oxígeno como aceptor terminal de electrones (Algunas bacterias, por ejemplo, utilizan nitratos o iones sulfato en vez del oxígeno). En el nivel más bajo de la columna, en un ambiente con alta concentración de H2S, aparecen varios grupos diferentes de bacterias:

En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una capa de color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de gas. Una especie característica es Amoebobacter. En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium. Estas bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a continuación, fermenta la glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido succínico, etc.) como productos finales de esa fermentación. Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una profunda capa negra y están representadas por la bacteria Desulfovibrio, pueden utilizar estos subproductos de la fermentación para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando grandes cantidades de H2S en el proceso. Este SH2 reaccionará con cualquier hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, que da color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros. Sin embargo, no todo el H2S es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas cantidades difunde hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros organismos que crecen en las zonas superiores. Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente coloreadas, inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias verdes del azufre (como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen

en

una

franja

verdosa.

En

otras

zonas

cercanas,

bacterias

como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se forma justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto de las altas concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras del azufre, como Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura. Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas y producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de manera muy similar a cómo lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una diferencia esencial: no producen oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como elemento reductor sino SH2. Las ecuaciones simplificadas que siguen muestran el paralelismo de ambos procesos:

6CO2 + 6H20 6CO2 + 6SH2

C6H12O6 + 6O2 (fotosíntesis de las plantas)

C6H12O6 + 6S (fotosíntesis de las bacterias anaerobias)

Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no del azufre, como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojoanaranjado. Su mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que se haya producido y de la cantidad que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia arriba, ya que su presencia inhibe a estas bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico.

Esquema de una columna de Winogradsky típica.

IV.

MATERIALES

Material biológico

Material de laboratorio

Papel mojado

Mortero y pilón

Hojas secas

Papel aluminio

Aserrín fino

Probeta de 20 mL

Yema de huevo

Vaselina

Alas de insectos

viales estériles

Lodo residual

Láminas porta objeto y cubre objeto Batería Gram

Reactivos

Microscopio

CaSO4

Mechero

CaCO3

Guantes

Extracto de carne

V.

PROCEDIMIENTO

a) Preparación de la columna de Winogradsky En un mortero triturar las hojas secas, las alas de insectos, papel remojado, aserrín y yema de huevo.

Luego agregar el lodo residual se está muy espeso agregar agua residual, mezclar hasta que se haya formado una masa fluida.

Adicionar los reactivos: CaSO4, CaCO3, extracto de carne para enriquecimiento.

Colocar aproximadamente el 1/3 del tubo con lodo enriquecido.

Luego Colocar lodo no enriquecido en proporción de 2 a 3 cm. Evitando en todo momento la formación de burbujas.

Colocar el agua residual hasta completar los 2/3 del tubo.

Tapar con una capa de vaselina liquida por lo menos dos centímetros y posteriormente cubrir con papel aluminio y amarrar la boca del tubo con hilo pabilo.

Incubar en ambiente luminoso y controlar diariamente en un tiempo de dos a cuatro semanas, para observar el crecimiento de las bacterias.

b) Identificación de las bacterias presentes en la columna de Winogradsky. 

Observar si ha habido variación del color en la columna esto indicara la presencia de bacterias.



Utilizando una pipeta larga de vidrio, tomar muestras a distintos niveles de la columna entre 1-3 mL y depositarlos en viales estériles.



Realizar de cada muestra una preparación en lámina en fresco y otra fijada. -

Preparaciones húmedas: Colocar una gota de muestra en un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Observar al microscopio.

-

Preparaciones fijas y teñidas: Tomar una gota de muestra y realizarle una tinción Gram. Observar al microscopio.

VI.

RESULTADOS

Cianobacterias Bacterias Púrpuras Bacterias verdes

Bacterias anaerobias estrictas

Columna de Winogradsky

Observaciones Microscópicas de la columna de Winogradsky

a) CIANOBACTERIAS Y ALGAS

Oedogonium sp

Internet

Encontrado

Chlamydomonas sp sp.

Internet

Encontrado

Pinnularia sp.

Internet

Encontrado

Pinnularia viridis

Internet

Encontrado

Nostoc sp.

Internet

Encontrado

Scenedesmus sp.

Internet

Encontrado

Coelastrum sp.

Internet

Encontrado

Chroococus sp.

Internet

Encontrado

b) BACTERIAS VERDES

Prosthecochloris sp sp.

Internet

Encontrado

Pelodictyon sp.

Internet

Encontrado

c) BACTERIAS PÚRPURAS

Dechlorospirillum sp.

Internet

Encontrado

Rhodopseudomonas sp.

Internet

Encontrado

d) BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS -

Bacterias reductoras de sulfato

Desulfovibrio sp.

Internet

-

Encontrado

Bacterias fermentadoras de celulosa

-

Clostridium sp.

Internet

Encontrado

VII. 

CONCLUSIONES Mediante la columna de Winogradsky se logró observar los distintos niveles que macroscópicamente se pueden observar en la columna (variación de color) que vendrían hacer los microespacios que ocupan microorganismos específicos categorizados funcionalmente.



Los microorganismos observados crecen a lo largo de la columna en diferentes lugares y tiempos, debido a las necesidades vitales y ambientales. Todos los microorganismos cumplen un papel fundamental a lo largo de todo el proceso, es decir por ejemplo los microorganismos aerobios degradan compuestos y los convierten en metabolitos microorganismos anaerobios.

que sirven como fuente de alimentación de los

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Madigan, M.T., J.M. Martinko y J. Parker. 1997. La Herencia de Winogradsky. En “Brock: Biología de los microorganismos”. 8ª edición. Prentice Hall. p. 493. Duró, A y J. Urmeneta. 2007. Manchas cromáticas o diversidad de microorganismos. Investigación y Ciencia. nº 366. Marzo. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.html