Clasebm Hibridacion

Hibridación de ácidos nucleicos

Desnaturalización y renaturalización del ADN por la temperatura

Agentes desnaturantes: - Temperatura - Moléculas polares (con grupos amino y carbonilo que compitan por la formación de puentes hidrógeno)

- Condiciones alcalinas

Alteración Alteración de de las las propiedades propiedades físicas físicas del del ADN ADN por por desnaturalización desnaturalización

Estructura Estructura de de los los ácidos ácidos nucleicos nucleicos yy su su absorción absorción óptica óptica

Curvas de Desnaturación

-Las curvas de desnaturación son específicas para cada molécula de ADN y dependen de la composición nucleotídica -La curva sigmoidal muestra que las interacciones que mantiene la doble hélice son cooperativas (la separación en un punto estimula la separación consecutiva de otros puntos en la molécula) -De esta curva se obtiene la Tm (temperatura media de fusión) -La Tm muestra una correlación lineal con el contenido de G+C

Curvas de Desnaturación

Aplicación Aplicación de de la la hidridación hidridación de de ácidos ácidos nucleicos nucleicos en en el el análisis análisis molecular molecular - Formación de híbridos de DNA:DNA o DNA:RNA durante un proceso de renaturación - El apareamiento de los híbridos dependerá de la complementariedad de bases y de las condiciones químicas y térmicas del proceso de renaturación

Astringencia o rigor (Stringency): grado de especificidad en el apareamiento de los híbridos. Experimentalmente se regula cambiando la temperatura, tiempo, longitud y composición de las cadenas a hibridar y ambiente químico (pH, cationes (Na+), moléculas polares(formamida))

Ensayos de hidridación

- Slot blot y dot blot Hibridación en fase sólida - Hibridación Southern - Hidridación Northern Hidridación en fase líquida

Hibridación in situ

Dot blot y Slot blot

Permite analizar ácidos nucleicos sin purificar (x ej: provenientes de muestras biológicas: sangre, heces, esputo)

Southern blot

La técnica de Northern blot es idéntica en procedimiento pero se utiliza para analizar muestras de RNA (aplicado al estudio de la expresión de genes).

Métodos paralelos de análisis molecular

Marcaje de sondas 1) Marcaje por síntesis con DNA polimerasa Traslado de la mella: Nick translation

Marcaje de sondas 2) Marcaje terminal Marcaje con polinucleótido quinasa

Tipos de marca: 1) Directa: Radiactiva (32P)

2) Indirecta: Grupo indicador

Fluorocromo

2) Marca Indirecta:

Resumen de marcadores y métodos para su detección

Micromatrices Micromatrices de de ADN: ADN: DNA DNA microarrays microarrays Técnica revolucionaria que permite monitorear la expresión de múltiples genes en forma simultánea

Permite estudiar los genes que están activos en tejidos particulares

POLIMORFISMOS

Variaciones en la secuencia del genoma. Pueden ser producidas por: - Recombinación no homóloga (duplicación de genes) Ej: isoformas de la fosfatasa alcalina - Transposición y retrotransposición Ej. Secuencias LINE y SINE, secuencias Alu.

Polimorfismo en regiones génicas (génico) - Polimorfismo del grupo sanguíneo ABO - Polimorfismo de la galactosemia - Polimorfismo del CFTR

Polimorfismo en regiones no génicas (genético) Utilizado para la identificación de individuos (huella dactilar de ADN) -DNA mini-satélite Repeticiones de 10 a 65 pb, ricas en C+G agrupadas en tandem formando bloques grandes de cientos y miles de repeticiones repartidos en todo el genoma Ej: GGGCAGGANG (N=cualquier nucleótido), secuencias de DNA minisatélite hipervariable de elevado polimorfismo -DNA microsatélite Repeticiones de unidades menores a 7 pb, agrupadas en tandem hasta 50 repeticiones Ej: secuencias teloméricas

FRLP Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism)

Cada muestra genera diferentes fragmentos de longitud diferente en función de los sitios de restricción presentes Se utiliza una sonda que hibrida en una posición cercana al sitio polimórfico y se analizan los resultados por Southern

Ejemplo: La secuencia de corte de la enzima de restricción está ausente en un alelo

FRLP en el diagnóstico de la anemia falciforme Anemia falciforme: enfermedad hereditaria por presencia de HbS, generando un deficiente transporte de O2 La β-globina situada en el cromosoma 11 presenta una mutación de cambio de sentido.

La mutación genera la ausencia del sitio de corte para la enzima de restricción Mst II

FRLP en el diagnóstico de la anemia falciforme

Estas Estas determinaciones determinaciones pueden pueden ser ser aplicadas aplicadas como como diagnóstico diagnóstico prenatal prenatal

Polimorfismo en el número de repeticiones en tandem: VNTR (variable number of tandem repeats)

La sonda hibrida con la secuencia repetida y permite la identificación del grado de repetición del polimosfismo (una carácterística única para cada individuo (salvo en gemelos unicigóticos))

Obtención de una huella dactilar de ADN empleando una sonda VNTR

El intrón 1 del gen de la mioglobina posee 4 secuencias repetidas formando un loci de VNTR (VNTR1)

El esquema muestra el resultado del Southern blot al utilizar la sonda de 33 pb descrita, para analizar a tres diferentes individuos

← Sonda

El polimorfismo VNTR utilizado en criminalística

Aplicaciones de los polimorfismos: FRLP y VNTR

-Diagnóstico de paternidad biológica -Seguimiento de árboles genealógicos -Identificación de sospechosos en procedimientos penales -Identificación post-mórtem de individuos (casos judiciales y catástrofes) -Diagnóstico de patologías hereditarias -Compatibilidad de transplantes -Análisis de la inestabilidad genética de cierto tumores

Hidridación in situ Tisular Aplicada a cortes de tejidos o células intactas fijados con formalina e incluidos en parafina La sondas utilizada tiene una marca radiactiva o fluorescente (FISH) y son analizada por el examen de una película fotográfica (autorradiografía) o en un microscopio de fluorescencia respectivamente. FISH: hibridación in situ fluorescente (fluorescent in situ hybriditation). Permite estudiar cambios en la expresión génica analizando el mRNA (por ej: durante el desarrollo) Es utilizada para detectar virus patógenos en células infectadas. Es utilizada en investigación para la detección de la expresión específica de genes en algunas patologías.

Detección del mRNA para el gen tailless en un embrión de Drosophila.

Hidridación in situ Cromosómica Se realiza en cromosomas metafásicos fijados, tratados con proteasa y desnaturalizados por calor y álcali. La sonda utilizada generalmente está asociada a una marca fluorescente (FISH) y analizada en un microscopio de fluorescencia.

Coloreado de cromosomas mediante FISH

El coloreado de cromosomas permite identificar la localización de secuencias específicas en cada uno de los cromosomas utilizando sondas especificas para cada uno de ellos marcadas con diferentes fluorocromos Permite la detección de cromosomopatias aneuploidías (monosomías, trisomías) o variaciones estructurales (deleciones, inversiones). Permite observar cambios grandes de reorganización cromosómica (por ej. en células cancerosas). FISH para la detección del gen de una proteína muscular (Lichter el al., Science 247, 1990, 64).