Capitulo Ii

Capítulo II Método Experimental

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2. Método experimental 2.1 Lugar de ejecución El experimento se ejecutó en el Laboratorio de Microbiología del Centro Médico Naval “Santiago Tavara” en el distrito de Bellavista, Lima. 2.2 Materiales 2.2.1 Materiales utilizados en la preparación de medios de cultivo: -

60 placas petri de plástico de 10cm de diámetro

-

40g de agar Muller Hinton

-

Balanza mecánica ± 0,1g

-

Mechero Bunsen

-

Autoclave (Marca Senco automatic, modelo grande)

-

Gradilla

-

Jarra de metal

-

Espátula

-

100ml de agua destilada

-

4 vasos precipitados de 500ml

-

20mL de solución buffer (ph ácido 4,01)

-

20mL de solución buffer (ph neutro 7,01)

-

20mL de solución buffer (ph alcalino 10,01)

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2.2.2 Materiales utilizados en la siembra y observación -

Cultivo de hongo Penicillium notatum

-

Cultivo de la bacteria Staphylococcus aureus

-

60 hisopos largos

-

pipeta Pasteur

-

Asa de coli

-

4 tubos pequeños con 5mL de agua destilada

-

Inoculum Water with Pluronic-D ( Turbidímetro marca Dade Behring, modelo B1015-7)

-

120 discos de papel filtro de 2cm de diámetro

-

Estufa (Incubadora de 37ºC, modern Laboratory, marca THELCO)

-

Refrigeradora (Marca Westinghc)

-

Regla graduada

-

Pinza

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2.3. Procedimiento 2.3.1. Preparación de los medios de cultivo: Para preparar los medios de cultivo se utilizó 100mL de agua destilada. Se puso a hervir el agua en una jarra de metal utilizando el mechero bunsen. Luego se pesó en la balanza mecánica 40g de agar Muller Hinton que se agregaron a la jarra. Con la espátula se agitó la solución para que no se produzcan grumos, y después de hervir se vació en cuatro vasos precipitados. Vaso 1

400mL de agar

Vaso 2

200mL de agar y se agregó 20ml de ph 4,01

Vaso 3

200mL de agar y se agregó 20ml de ph 7,01

Vaso 4

200mL de agar y se agregó 20ml de ph 10,01

Los cuatro vasos fueron llevados a la autoclave para esterilizarlos por 10 minutos. Luego se dejó enfriar los vasos por 15 minutos. En 30 placas petri se vaciaron 15mL aproximadamente del vaso 1. En otras 10 placas se vació el agar del vaso 2 (aprox.20mL por placa). El agar del vaso 3 se vació en 10 placas petri (aprox. 20mL por placa). El agar del vaso 4 se vació en 10 placas (aprox.20mL por placa). Todas las placas fueron marcadas y enumeradas según el ph que contenían y se llevaron a la refrigeradora a una temperatura de 10ºC por 24 horas.

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2.3.2 Siembra de la bacteria y del hongo: Para realizar la siembra de la bacteria y del hongo, primero se debe preparar la inoculación de ambos microorganismos. Para esto se trabajó cerca al mechero, se raspó el cultivo del penicillium notatum con la asa de coli, y se disolvió en un tubo con 5mL de agua destilada (ver anexo 1). Se realizó este procedimiento cuatro veces hasta que se observó que el agua estaba turbia. El grado de turbidez del inóculo de un hongo debe ser de 0,30 NTU (Nephelometer Turbidity Units). Para comprobarlo se colocó el tubo en el orifico de muestra del turbidímetro, y en el otro orifico se colocó un tubo con agua destilada. La lectura dio 0,31 NTU por lo que el grado de turbidez era cercano a la escala recomendada. Foto Nº 2.3.1

Turbidímetro con el tubo con penicillium notatum

Seguidamente se realizó la preparación del inóculo de la bacteria Staphylococcus aureus. Para esto se trabajó cerca al mechero, se raspó la cepa de la bacteria con el asa de coli y se disolvió en un tubo con 5mL de agua destilada. Se repitió tres veces este procedimiento hasta que el agua se volvió turbia. El grado de turbidez debe de ser de 0,08 NTU, por lo que se comprobó con el turbidímetro.

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Foto Nº 2.3.2

Turbidímetro con el tubo con Staphylococcus aurus

Una vez preparadas las dos suspensiones, se procede a sembrar en las placas la bacteria. Previamente se retiraron las 60 placas de la refrigeradora y se colocaron cerca al mechero para que no estén a una temperatura tan baja. Para inocular las placas, se utiliza un hisopo largo que se remoja en la suspensión de la bacteria y se frota en el medio de cultivo en tres direcciones diferentes (ver anexo 2). Se siembra la bacteria en las 60 placas y se dejan secar por 5 minutos para que el agar absorba cualquier exceso del inóculo. Luego utilizando una pinza se coloca dos discos de papel filtro (de 2cm. de diámetro) en extremos opuestos de las 60 placas, y manipulando una pipeta pasteur se agrega dos gotas de la suspensión del penicillium a cada disco. (Ver anexo 3 y 4) Para determinar la temperatura óptima en que crece el hongo y hace efecto sobre la bacteria, 10 placas se llevaron a la refrigeradora a una temperatura de 10ºC, 10 placas se dejaron en el medio ambiente a una temperatura de 23ºC y 10 placas se llevaron a la estufa a una temperatura de 37ºC. (Ver anexo 5, 6 y 7).

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Para determinar el ph óptimo en que crece el hongo y su efecto sobre la bacteria, se dejaron 30 placas que contenían distintas soluciones buffer, 10 placas con ph ácido, 10 placas con ph neutro y 10 con ph alcalino, a medio ambiente. En los resultados se consideró el diámetro de crecimiento (en centímetros) del hongo pasado las 24 y 48 horas en las 60 placas.

2.4. Evaluaciones 2.4.1. Determinación del diámetro del hongo. Pasada las 24 horas se procedió a observar el efecto del hongo sobre la bacteria, para esto se midió el diámetro de crecimiento del penicillium notatum de los discos de cada una de las 60 placas, utilizando una regla. Pasada las 48 horas se volvió a medir las 60 placas. Los resultados fueron anotados en centímetros. (ver anexo 8)

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Capítulo III Resultados

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3. Resultados 3.1. Resultados de la prueba de temperatura Cuadro Nº 3.1.1 Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 10ºC Número de placas sometidas a una temperatura de 10ºC 10

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 24 horas 0

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 48 horas 0

Cuadro Nº 3.1.2 Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 23ºC Placas sometidas a una temperatura de 23ºC

Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10

Diámetro del crecimiento Diámetro del crecimiento del hongo en del hongo en centímetros pasada las centímetros pasada las 24 horas 48 horas Disco1: 2,5 Disco1: 3 Disco2: 3 Disco2: 3.3 D.1: 2,3 D.1: 2,6 D.2: 2,4 D.2: 3,1 D.1: 2,2 D.1: 2,5 D.2: 2,0 D.2: 2,2 D.1: 2,2 D.1: 2,5 D.2: 2,3 D.2: 2,6 D.1: 2,2 D.1: 2,5 D.2: 2,2 D.2: 2,6 D.1: 2,6 D.1: 2,7 D.2: 2,3 D.2: 2,5 D.1: 2,4 D.1: 2,8 D.2: 2,3 D.2: 2,7 D.1: 2,5 D.1: 2,9 D.2: 2,4 D.2: 2,6 D.1: 2,4 D.1: 2,8 D.2: 2,3 D.2: 2,7 D.1: 2,2 D.1: 2,6 D.2: 2,3 D.2: 2,5

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Cuadro Nº 3.1.3 Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a 37ºC Placas sometidas a una temperatura de 37ºC

Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 24 horas Disco1: 2,1 Disco2: 2 D.1: 2,1 D.2: 2,2 D.1: 2,2 D.2: 2,3 D.1: 2,1 D.2: 2,1 D.1: 0,0 D.2: 2,0 D.1: 2,2 D.2: 2,2 D.1: 0,0 D.2: 0,0 D.1: 0,0 D.2: 0,0 D.1: 2,1 D.2: 2,0 D.1: 2,2 D.2: 2,0

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 48 horas

Foto Nº 3.1.1 Placas sometidas a distintas temperaturas

Izquierda: placa a 10ºC Centro: placa a 23ºC Derecha: placa a 37ºC 30

Disco1: 2,5 Disco2: 2,3 D.1: 2,4 D.2: 2,5 D.1: 2,4 D.2: 2,5 D.1: 2,3 D.2: 2,1 D.1: 0,0 D.2: 2,1 D.1: 2,2 D.2: 2,3 D.1: 0,0 D.2: 0,0 D.1: 0,0 D.2: 0,0 D.1: 2,2 D.2: 2,1 D.1: 2,2 D.2: 2,1

3.2. Resultados de la prueba de pH.

Cuadro Nº 3.1.4 Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a pH 4,01 Placas con pH 4,01

Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 24 horas Disco1: 2,4 Disco2: 2,3 D.1: 2,2 D.2: 2,5 D.1: 2,5 D.2: 2,3 D.1: 2,3 D.2: 2,2 D.1: 2,4 D.2: 2,3 D.1: 2,3 D.2: 2,5 D.1: 2,4 D.2: 2,5 D.1: 2,5 D.2: 2,4 D.1: 2,2 D.2: 2,5 D.1: 2,3 D.2: 2,5

31

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 48 horas Disco1: 2,5 Disco2: 2,6 D.1: 2,4 D.2: 2,6 D.1: 2,7 D.2: 2,6 D.1: 2,6 D.2: 2,5 D.1: 2,9 D.2: 2,7 D.1: 2,6 D.2: 2,6 D.1: 2,5 D.2: 2,7 D.1: 2,6 D.2: 2,8 D.1: 2,5 D.2: 2,7 D.1: 2,5 D.2: 2,6

Cuadro Nº 3.1.5 Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a pH 7,01 Placas con pH 7,01

Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 24 horas Disco1: 2,3 Disco2: 2,2 D.1: 2,2 D.2: 2,4 D.1: 2,5 D.2: 2,4 D.1: 2,3 D.2: 2,3 D.1: 2,4 D.2: 2,2 D.1: 2,5 D.2: 2,4 D.1: 2,6 D.2: 2,5 D.1: 2,2 D.2: 2,3 D.1: 2,6 D.2: 2,4 D.1: 2,5 D.2: 2,0

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 48 horas Disco1: Disco2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2: D.1: D.2:

2,3cm 2,4cm 2,4 2,5 2,7 2,5 2,6 2,7 2,8 2,4 2,6 2,7 2,7 2,7 2,5 2,4 2,6 2,5 2,6 2,3

Resultados obtenidos al medir el diámetro de crecimiento del hongo considerando el disco de papel filtro, de las placas sometidas a pH 10,01 Cuadro Nº 3.1.6 Número de placas con pH 10,01

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 24 horas

10

0,0

32

Diámetro del crecimiento del hongo en centímetros pasada las 48 horas 0,0

Foto Nº 3.1.2

Placa con pH 4.01

Foto Nº 3.1.3.

Placa con pH 7.01

Foto Nº 3.1.4

Placa con pH 10.01

33

Gráfica Nº 3.1.1 Comparación del crecimiento del hongo a las 24 horas cm 2,5

2,35

2 1,59 1,5 Crecimiento del hongo

1 0,5 0

0

10

23

37

ºC

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

Gráfica Nº 3.1.2 Comparación del crecimiento del hongo a las 48 horas cm

3

2,685

2,5 2

1,71 Crecimiento del hongo

1,5 1 0,5 0

0 10

23

37

ºC

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

34

Gráfica Nº 3.1.3 Comparación del crecimiento del hongo a las 24 horas cm 2,5

2,375

2,355

2 1,5

Crecimiento del hongo

1 0,5 0

0 4,01

7,01

10,01

pH

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo. Gráfica Nº 3.1.4 Comparación del crecimiento del hongo a las 48 horas cm

3 2,61

2,5

2,545

2 1,5

Crecimiento del hongo

1 0,5 0

0 4,01

7,01

10,01

pH

Observación: Crecimiento del hongo expresado en cm, obtenido del promedio de medir el diámetro de crecimiento de las 10 placas de cada grupo.

35

3.3.



Discusión de Resultados A la temperatura de 10ºC no se observó crecimiento en las placas con el

hongo en estudio. En cambio, a 23ºC se observó crecimiento del hongo en todas las placas, ocurriendo algo similar en las placas sometidas a 37ºC, pero en este caso en menor cantidad; inclusive en algunas placas no hubo desarrollo del hongo.



El hongo creció a 23ºC y 37ºC, pero se observó que en la segunda temperatura la bacteria se desarrolló mejor que el hongo. En cambio a 23ºC hubo un crecimiento mayor del hongo, compitiendo por espacio y nutrientes a la bacteria.



Con respecto al pH, se observó que el hongo tolera pH ácido (4,01) y neutro (7,01), porque hubo un crecimiento en ambos grupos, sin embargo, hay una diferencia en el promedio del diámetro de crecimiento pasado las 48 horas de 0.065 cm.



En las placas con pH alcalino (10,01) se observó que no hubo crecimiento del hongo, ni de la bacteria.

36

Capítulo IV Conclusiones y Recomendaciones

37

4. Conclusiones y recomendaciones 4.1. Conclusiones



A partir de la hipótesis de que el hongo tiene un efecto sobre la bacteria a una temperatura óptima de 23ºC, los resultados confirman que es cierta. El hongo se desarrolló pasada las 48 horas con un diámetro de crecimiento promedio de 2,685cm a 23ºC a diferencia de 1,71cm a 37ºC, por lo que la temperatura óptima fue de 23ºC, esto debido a que el Penicillium es un hongo ambiental. Sin embargo se observa una competencia por sobrevivir entre el hongo Penicillium notatum y la bacteria Staphylococcus aureus, porque a 23ºC el hongo ganó mayor espacio y por lo tanto nutrientes a la bacteria, al aumentar más su diámetro de crecimiento. A 37ºC el hongo no creció con la misma intensidad como a 23ºC porque la bacteria se desarrolla óptimante a esta temperatura, mientras que el hongo no.



A partir de la hipótesis de que el hongo se desarrolla a un pH ácido, después de experimentar se confirma que es cierto. Su promedio de crecimiento en las placas con pH ácido fue de 2,61cm, siendo éste el mayor. Se observó que el hongo también se puede desarrollar a un pH neutro porque hubo un crecimiento promedio de 2,545cm. Ninguna de las dos especies tolera un pH alcalino (10,01).



El hongo Penicillium notatum puede desarrollarse si se encuentra en condiciones óptimas de temperatura y pH, y de esta forma es capaz de crecer y eliminar bacterias como el Staphylococcus aureus que son dañinas al ser humano.

38

4.2. Limitaciones



Debido a que no se contaba con el equipo adecuado en el laboratorio, en el proceso de este experimento no se tomó en cuenta el factor de la humedad ni el tiempo de exposición a la luz



Por no contar con el material adecuado, no se realizó un proceso cuantitativo en la siembra del hongo y de la bacteria.



Debido a que las placas fueron expuestas al medio ambiente al momento de ser sembradas puede que se hayan contaminado con algún organismo externo, lo cual puede que haya producido la muerte del hongo y por lo tanto no creció en algunas placas.

4.3. Recomendaciones



Para realizar un trabajo más detallado se recomienda tomar en cuenta el factor de la humedad midiéndola con un

higrómetro. El

tiempo de exposición a la luz también se debería cronometrar para determinar la influencia de estos factores sobre el moho Penicillium notatum.



Sería recomendable realizar el conteo de las bacterias que hay en la colonia por lo cual se necesitarían discos de papel filtro que contienen reactivos que determinan la población de la colonia para realizar un debido conteo. Se haría el mismo procedimiento con el hongo.



Se recomienda para estudios posteriores utilizar distintas bacterias como el Streptococcus para realizar comparaciones bajo el efecto del hongo. Así mismo comparar con distintos tipos de Penicillium como el Penicillium chrysogenum, también utilizado en la industria farmacéutica.

39

Bibliografía Bibliografía consultada en libros: 1. ALEXOPOULOS, J. Introducción a la Micología. Editorial Eudeba. Buenos Aires 1966.

2. AUDESIRK, T., AUDESIRK, G. BYERS, B. Biología la Vida en la Tierra. Editorial Pearson. México, 2003.

3. BASUALDO, J. COTO, C. DE TORRE, R. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante. Buenos Aires 1996.

4. BILAI, V. Antibiotic- Producing Microscopio fungi. Editorial Elsevier Publishing Company. Washington D.C, 1963.

5. BOLD, ALEXOPOULOS, DEVELORYAS. Morfología de las plantas y los hongos. Editorial Omega. Barcelona 1989.

6. CHRISTENSEN, Martin. Los Hongos y el Hombre. Editorial Limusa. México D.F, 1965.

7. DEACON, J. Introducción a la Micología Moderna. Editorial Limusa. México D.F, 1993.

8. HENDERSON, B., WILSON, M., MACNAB, R., LAX, A. Cellular Microbiology, Bacteriahost interaction in health and disease. Editorial John Willey & Sons. England 1999. p. 4

9. KINGSBURY, D. WAGNER, G. SEGAL, G. Microbiología médica. Editorial Limusa, México D.F, 1989. p.127

40

10. MADIGAN, T., MARTINKO, J., PARKER, J. Brock Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Iberia. Madrid, 1999.

11. SACSAQUISPE, R. Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por el método de Disco Difusión. Instituto Nacional de Salud. Lima, 2002.

12. SMITH, George. Introducción a la Micología Industrial. Editorial Acribia. Zaragoza 1963. Bibliografía consultada en internet y en enciclopedia virtual: 13. Biblioteca de Consulta Microsoft Encarta 2005. Artículo penicillium notatum. 14. Estafilococo, en Internet:http://translate.google.com/translate?hl=es&sl=en&u=http://textbookofbacterio logy.net/staph.html&prev=/search%3Fq%3Dstaphylococcus%2Baureus%2B%26hl%3 Des%26lr%3D%26sa%3DN (14 de agosto 2005)

15. La penicilina, en internet: http://www.educar.org/inventos/Penicilina.asp (14 de agosto de 2005)

16. Monografías, en Internet: http://www.monografias.com/trabajos15/micrococcaceae/micrococcaceae.shtml (14 de agosto de 2005)

17. Penicilina, en Internet http://members.tripod.com/fotografia/textos/penicilina.htm (14 de agosto de 2005) 18. Penicillium notatum, en Internet:http://www.schoolscience.co.uk/content/4/biology/sgm/images/penicillin.jpg(14 de agosto de 2005)

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Anexos Anexo 1

Preparación de la suspensión del hongo Anexo 2

Inoculación de la bacteria en el medio de cultivo

42

Anexo 3

Inoculación del hongo en los discos de papel filtro

Anexo 4

Inoculación del hongo en los discos de papel filtro

43

Anexo 5

Placas en la refrigeradora a 10ºC

Anexo 6

Placas sometidas a 37ºC en la estufa

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Anexo 7

Placas al medio ambiente a 23ºC

Anexo 8

Medición del diámetro de crecimiento del hongo

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46

47