Capitolul 2_surse Elementare.pdf

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

1

2. SURSELE ELEMENTARE DE CAMP ELECTRIC si MAGNETIC din ORGANISM 2.1 Fenomene electrice la nivelul celulelor excitabile. Transportul ionic pasiv in cazul membranei polarizate GENERALITATI DESPRE CELULELE EXCITABILE – MEMBRANE, REPARTITII DE IONI Celulele excitabile sunt generatoarele elementare de campuri electrice (si magnetice asociate) din organismele vii. Campul electric este produs prin distributia contolata a sacinilor electrice (ioni pozitivi si negativi) in interiorul si exteriorul celulelor, iar campul magnetic apare datorita fluxurilor dirijate de ioni (liniile de camp magnetic se inchid in jurul curentilor ionici). Semnalele electrice (tensiuni si curenti transmembranari) apar ca razultat al dinamicii sarcinilor electrice prin membrane. Principalele tipuri de celule excitabile sunt: * neuronii (celulele sistemului nervos) * celulele senzitive (formeaza receptorii senzoriali si sunt specializate in receptarea si conversia in semnal electric al unui anumit tip de stimul) * celulele musculare (musculatura striata, neteda si miocardul) Structura membranei celulare Membrana celulara joaca rolul unei frontiere izolante electric intre doua medii electrolitice relativ bune conductoare (medii apoase cu un bogat continut de ioni liberi): citoplasma si fluidul interstitial (exteriorul celulei). Membrana are o structura de dublu strat lipidic, iar din loc in loc se gasesc proteine continute in dublul strat, unele integrate (se regasesc pe ambele fete ale membranei), altele periferice. Lipidele care formeaza in cea mai mare parte membrana celulara sunt fosfolipide si sunt la randul lor compuse din: * acid fosforic (capetele polare, hidrofile) * gliceride sau acizi grasi (catene hidrocarburice, hidrofobe). Caracterul hidrofil al capetelor polare si cel hidrofob al catenelor hidrocarburice explica asezarea lipidelor in structura de dublu strat, cat si consistenta si stabilitatea structurii. Fosfolipidele - formeaza un strat izolant electric, pentru care se poate determina cu aproximatie capacitatea specifica, considerand permitivitatea electrica εr ≈ 3 (similar uleiului) si grosimea membranei d = 30 Å: Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

€

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

Cm = ε

A εε = r 0= l A=1 d

3⋅

2

1 ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ 4 ⋅ π ⋅9 ⋅10 9 = 0,009 ⎢ F ⎥ ≅ 1 ⎢ µF ⎥ ⎣ m2 ⎦ ⎣ cm2 ⎦ 30 ⋅10−10

Proteinele integrate - sunt aglomerari amorfe macromoleculare inglobate in statul lipidic, dar avand € oarecare mobilitate; astfel, prin proteine se pot forma canale hidrofile (pori) cu deschiderea de (1 … 10) Å, prin care circula ionii; ele sunt de mai multe categorii: - canale ionice (active sau pasive) - pompe ionice - schimbatoare de ioni Canalele ionice asigura selectivitatea membranei prin capacitatea de a controla trecerea ionilor in procesele de transport pasiv. Acest tip de transport este desfasurat sub actiunea campului electric si a diferentei de concentratie intre interiorul si exteriorul celulei. Densitatea de repartitie a canalelor ionice este de ordinul a sute de canale pe o suprafata de membrana de 1 µm2 = 10-12 m2. Sunt cunoscute cca. 50 tipuri de canale ionice care se clasifica astfel: * canale pasive – in cazul acestora, controlul circulatiei ionilor se realizeaza doar prin dimensiunile porilor in raport cu ale ionilor. Exemple de dimensiuni caracteristice pentru ionii hidratati care circula prin membrane: 3,5 Å → Na + 2,5 Å → K+ si Cl 2+ 4,5 Å → Ca 5,9 Å → Mg 2+ * canale active – in cazul acestora, controlul se realizeaza prin modificari ale formei si dimensiunilor canalelor (reconfigurari ale structurii si distributiei spatiale a componentelor macromoleculare ale proteinei), provocate de cele mai multe ori prin procedee electrice si chimice; astfel, canalele ionice active se pot la randul lor clasifica in: - canale active controlate in tensiune prin valoarea diferentei de potential intre fetele membranei (ex.: se gasesc in lungul axonilor neuronali); - canale active controlate chimic prin mediatori chimici de tipul acetilcolinei si acidului gama-aminobutiric (ex.: in zonele sinapselor). Pompele ionice si schimbatoarele de ioni asigura transportul activ al ionilor, care are rolul de a mentine (a reface) echilibrul ionic corespunzator starii de repaus a membranei (considerata stare stabila de minima energie) si se desfasoara cu consum de energie provenita din procese metabolice. Asa numitele pompe ionice sunt enzime care functioneaza pe baza descompunerii compusului chimic adenozintrifosfat in adenozindifosfat, cu eliberare de fosfor si de energie, dupa relatia: ATP → ADP + P + energie . Principalele tipuri de ioni care populeaza mediile interior si exterior celulei excitabile sunt:

Na+ ,K+ ,Cl− pentru celulele nervoase, respectiv Na+ ,K+ ,Ca 2+ pentru celulele musculare. MEMBRANA IN STARE POLARIZATA (sau in repaus)

€

€

Concentratiile de ioni caracteristice celulelor excitabile in repaus (membranele polarizate) in

mediile

intracelular

(i)

si

extracelular

(e)

satisfac

relatiile:

[Na+ ]i << [Na+ ]e ,

[K+ ]i >> [K+ ]e , [Cl− ]i << [Cl− ]e , [Ca2+ ]i << [Ca2+ ]e . In tabelul urmator sunt prezentate

cateva exemple.

€ €

€

€ Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

In plus, in interiorul celulelor se gasesc ioni negativi, rezultati din descompunerea unor substante macromoleculare organice. Acestia au dimensiuni caracteristice mari si nu pot trece prin canalele ionice, deci nu ajung in mediul extracelular. In aceste conditii, in interiorul celulei predomina sarcinile negative, iar in exterior predomina sarcinile pozitive. Astfel, in mediul intracelular se stabileste un potential electric negativ (Vi < 0) , iar in mediul extracelular un potential electric pozitiv (Ve > 0) . Tensiunea de membrana (transmembranara) se defineste ca diferenta dintre € V si V (in acest sens) si are valoare i e

€

€

3

d

negativa in starea de repaus a membranei U m = Vi − Ve . Incarcarea fetei interioare a membranei cu sarcina negativa si a fetei exterioare cu sarcina pozitiva este specifica starii de membrana polarizata.

€

Observatii 1. Membrana polarizata (in repaus) nu este inertă; ionii circula, dar circulatia se face preponderent prin canalele pasive (necomandate) si corespunde in cea mai mare parte circulatiei ionilor de K+ si Cl-. 2. Pentru membrana polarizata este semnificativa circulatia ionilor de K+ si Cl-, pentru care exista canale permanent deschise (necomandate sau pasive) prin care pot trece acesti ioni de mici dimensiuni; circulatia celorlalti ioni este mult mai redusa. De aceea se poate spune ca membrana in repaus este permeabila la ionii de K+ si Cl- si este impermeabila la celelalte tipuri de ioni. 3. Din punct de vedere electric, starea de repaus este un regim electrocinetic (curenti ionici constanti); stabilitatea (stationaritatea) este asigurata de regenerarea permanenta a concentratiilor ionice prin transportul activ. Transportul activ se desfasoara in paralel cu cel pasiv, dar dupa alte mecanisme si pe alte cai (canale ionice) decat acesta. Cele doua tipuri de mecanisme de transport pot fi analizate independent unul fata de celalalt. Transportul pasiv al ionilor prin membranele excitabile reprezinta miscarea dirijata a ionilor prin membrana, sub actiunea campului electric, sau a gradientului de potential electric Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

4

(forte Coulombiene) si sub actiunea gradientului de concentratie (forte de difuzie); transportul se face in sensul echilibrarii fortelor Transportul pasiv se desfasoara atat in cazul membranei polarizate (in repaus sau in echilibru, in regim stationar) cat si pentru cea depolarizata (activa, in regim dinamic), dar legile si mecanismele dupa care se desfasoara in cele doua regimuri prezinta diferente, ce vor fi puse in evidenta in continuare.

MODELE PENTRU MEMBRANE POLARIZATE Modelul NERNST – valabil pentru circulatia unei singure categorii de ioni Se presupune ca intr-o incinta se gasesc doua compartimente (i) si (e), populate cu ioni si separate printr-o membrana permeabila in mod selectiv, numai la ionii pozitivi. In compartimentul (i) se afla initial un exces de ioni pozitivi.

Datorita diferentei de concentratie, ionii pozitivi din (i) tind sa treaca prin membrana in (e), in sensul descresterii concentratiei. Miscarea este guvernata de legea difuziei (legea I a lui FICK), pentru un sistem termodinamic izoterm si izobar.

⎡ mol ⎤ jd = −DgradC ⎢ 2 ⎥ ⎣m s⎦ jd - fluxul molar de difuzie (rata densitatii curentului ionic de difuzie) D - constanta de difuzie (constanta lui Fick) [m2/s] € C - concentratia ionica [mol/m3]

Acumularea de ioni (+) in (e) creaza un camp electric imprimat de concentratie E orientat (e) → (i); sub actiunea sa ionii (+) au tendinta sa revina in (i), dupa legea

je = −u

⎡ mol ⎤ Z C gradV ⎢ 2 ⎥ Z ⎣ m s⎦

je - fluxul molar sub actiunea campului electric (rata densitatii curentului ionic Coulombian) € u – mobilitatea ionilor in camp electric [(m/s)/(V/m)] Z - valenta (numarul de valenta cu semn) V - potentialul electric [V]

Fluxul molar total prin membrana rezulta prin insumarea celor doua componente

jm = jd + je = −DgradC − u

Z C gradV , Z

expresie care se mai poate prelucra daca se tine seama de relatia stabilita in 1905 de catre Einstein

u FD , unde F = 96487 [C/mol] reprezinta constanta lui Faraday, R = 8,314 = Z RT €

[J/(mol K)] este constanta universala a gazelor, iar T este temperatura absoluta. Rezulta astfel,

jm = jd + je = −DgradC −

€

FD ZC gradV , RT

expresie care este cunoscuta sub numele de ecuatia Nernst-Planck. Densitatea de curent ionic prin membrana se poate exprima cu ajutorul fluxului molar astfel:

€

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

F 2D 2 J m = jm FZ = −DFZ gradC − Z C gradV RT

5

[A/m2 ].

Starea de echilibru termodinamic se atinge atunci cand Jm = 0, adica

−gradC −

F ZC gradV = 0 . RT

€ echilibru Jm = 0 se asociaza unei anumite valori a tensiunii de membrana definita Conditia de d

€

ca U m = Vi − Ve ; expresia tensiunii de membrana in conditiile echilibrului termodinamic (definit de modelul Nernst) € se poate determina prin integrarea ecuatiei stabilite. Integrarea se face pe grosimea membranei, adica intre suprafata sa interioara si cea exterioara, tinand seama ca atat concentratia, cat si potentialul electric variaza intre cele doua suprafete, dupa directia transversala membranei, notata de exemplu cu (x).

1 FZ gradC = − gradV , C RT

1 dC FZ dV , =− C dx RT d x

[C ] e €

V [C ] FZ e 1 FZ ∫ C dC = − RT€∫ dV , ln [C]e = − RT (Ve − Vi ) . i Vi [C ] i

Rezulta asa numita expresie a tensiunii NERNST pentru o anumita categorie de ioni

€ RT [C ]e . ln U m = Vi − Ve = FZ [C ]i

€

Observatii.

€

(1) Restrictia principala care sta la baza modelului NERNST este aceea ca existenta altor categorii de ioni este neglijata, sau, cu alte cuvinte, fiecare categorie de ioni circula pe canale separate si nu se influenteaza reciproc. (2) Diferenta de potential NERNST aplicata membranei exprima marimea intensitatii campului electric pentru care un ion (de un anumit tip) este in echilibru cu forta sa de difuzie. Schema electrica echivalenta in modelul NERNST pentru un element de suprafata a membranei cuprinde elemente pasive de circuit electric pentru membrana (element capacitiv) si pentru canalele ionice (element rezistiv/conductiv).

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

6

La curent nul prin membrana (Jm = 0), tensiunea de membrana egaleaza tensiunea NERNST

U m0 = Vi − Ve = U =

RT [C ]e ln FZ [C ]i

Um – tensiunea de membrana U – tensiunea Nernst a canalului ionic respectiv € Jm – densitatea de curent transmembranar Cm – capacitatea specifica a membranei [F/m2] Gm – conductanta specifica a canalului transmembranar [S/m2]

Aplicatia 1. In tabelul urmator sunt prezentate concentratiile ionice determinate experimental pentru axonul neuronal la un preparat de calmar. Se cere determinarea tensiunilor NERNST pentru canalele ionice de K, Na si Cl.

Tensiunile Nernst au valori in gama (1… 100) mV, iar polaritatea este influentata de tipul ionilor si de gradientul de concentratie. Aplicatia 2. Se cere sa se determine solicitarea dielectrica asupra unei membrane aflate in stare de repaus (intensitatea campului electric transmembranar), considerand valori uzuale pentru tensiunea de membrana in repaus si pentru grosimea membranei. Sa se compare apoi aceasta solicitare cu rigiditatea dielectrica (valoarea intensitatii campului electric de strapungere) a unor materiale izolante cunoscute. Exemplu:

d ≈ 30A = 30 ⋅10-10 m , U m = 60mV E=

€

U m 60 ⋅10−3 = = 20 ⋅10 6 V/m −10 d 30 ⋅10 €

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

€

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

7

Pentru comparatie: Estr aer = 3⋅10 6 V/m, Estr ulei = 15⋅10 6 V/m , Estr cauciuc = 40 ⋅10 6 V/m . Dupa cum se observa, membrana este supusa, chiar in stare de repaus, unei solicitari dielectrice ridicate, comparabila cu rigiditatea dielectrica a materialelor izolante. € controlata si regenerativa € € (electroporarea) este o procedura Strapungerea a membranelor utilizata pentru introducerea de substante chimice (medicamente) in interiorul celulelor. Modelul DONNAN - pentru circulatia a doua sau mai multe categorii de ioni Modelul DONNAN reprezinta o generalizare a modelului NERNST in ipoteza ca prin membrana circula mai multe categorii de ioni, fara insa a se influenta intre ei. La echilibru, densitatile de curent ionic se anuleaza, J m = J K + J Na + JCl = 0 ⇔ J K = 0; J Na = 0; JCl = 0 , astfel ca tensiunile NERNST ale diferitelor categorii de ioni sunt egale intre ele si egale cu tensiunea de membrana; de exemplu pentru ioni de K+, Na+ si Cl- relatia intre tensiuni corespunde conditiei:

€

UK =

RT [K]e RT [Na]e RT [Cl]e ln = U Na = ln = UCl = − ln = U m0 F F F [K]i [Na]i [Cl]i

Observatie. Modelul Donnan reprezinta pentru celulele excitabile o idealizare exagerata, dar se potriveste bine pentru hematii.

€

Modelul GOLDMAN (1943) - HODGKIN - KATZ (1949) - pentru circulatia a doua sau mai multe categorii de ioni In cadrul acestui model, conditia de echilibru a membranei referitoare la densitatatea curentului transmembranar nu se realizeaza neaparat prin anularea celor trei componente ale curentului ionic

J m = J K + J Na + JCl = 0 ,

€

chiar daca J K ≠ 0; J Na ≠ 0; JCl ≠ 0.

Modelul G-H-K conduce la stabilirea expresiei tensiunii de membrana in starea de echilibru J m = 0 , prin integrarea ecuatiilor de tip Nernst-Planck scrise pentru fiecare tip de ioni, € o membrana de grosime finita si cu o variatie liniara a potentialului electric pentru transmembranar (respectiv, dupa directia coordonatei x); membrana este infinit extinsa dupa coordonatele y si z. Astfel, ecuatia Nernst-Planck pentru ionii de K are forma

F [K] gradV − DK grad[K] = RT ⎛Z F dV d[K] ⎞ + = −DK ⎜ K [K] ⎟e x dx dx ⎠ ⎝ RT jK = −Z K DK

unde, datorita variatiei liniare a potentialului,

dV V ( d ) − V (0) U = =− m , dx d d

€

ecuatia se poate pune sub forma integrabila

€

d[K] = dx, j U F − K + m [K] DK RTd (e)

care se integreaza intre fetele membranei fluxului molar al ionilor de potasiu

€

d d[K] ∫ jK U m F = ∫ d x si rezulta expresia + (i) − [K ] 0 DK RTd

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

€

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

8

⎛ Um F ⎞ ⎟ DKU m ⎝ RT ⎠ jK = . ⎛ Um F ⎞ RTd 1− exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠ Concentratiile ionice la nivelul suprafetelor membranei [K ] d si [K ] 0 sunt in relatie de

[K] d − [K] 0 exp⎜ F

proportionalitate cu concentratiile din solutie (care sunt mai usor masurabile): [K] d = βK [K]e , respectiv [K] 0 = βK [K]i ; factorul de proportionalitate βK are valoare

€

constanta, care nu depinde de concentratie (se verifica experimental) si este specific tipului € € de ioni. Densitatea curentului ionic de K are expresia

€

€

2

J K = j K FZ K =

DKU m F β K RTd

⎛U F ⎞ ⎟ ⎝ RT ⎠ , ⎛ Um F ⎞ 1− exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠

[K]e − [K]i exp⎜ €m

Unde valenta ionilor de K este ZK = 1. Se poate defini permeabilitatea membranei la ionii de d

D β K prin relatia: PK = K K si rezulta d

€

P U F JK = K m RT

€

2

⎛ Um F ⎞ ⎟ ⎝ RT ⎠ . ⎛U F ⎞ 1− exp⎜ m ⎟ ⎝ RT ⎠

[K]e − [K]i exp⎜

In mod similar se deduc expresiile densitatilor de curent pentru ionii de sodiu si clor

⎛ Um F ⎞ ⎟ PNaU m F ⎝ RT ⎠ J Na = , € ⎛ Um F ⎞ RT 1− exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠ ⎛ Um F ⎞ ⎟ 2 [Cl]i − [Cl]e exp⎜ PClU m F ⎝ RT ⎠ JCl = . ⎛ Um F ⎞ RT € 1− exp⎜ ⎟ ⎝ RT ⎠ Conditia de echilibru pentru membrana polarizata, J m = J K + J Na + JCl = 0 , aplicata 2

[Na]e − [Na]i exp⎜

expresiilor densitatilor de curent, conduce la formarea unei ecuatii ce permite exprimarea tensiunii de membrana de repaus

€

Um = Um 0 =

PK [K]e + PNa [Na]e + PCl [Cl]i RT , ln € PK [K]i + PNa [Na]i + PCl [Cl]e F

care poarta denumirea de ecuatia GOLDMAN - HODGKIN – KATZ.

Comentarii si concluzii: € G-H-K se poate aplica atat membranei in repaus (echilibru), cat si celei active 1. Ecuatia (excitate), dar numai cand J m = 0 (de exemplu în momentul în care tensiunea de membrana atinge o valoare de maxim, sub actiunea unui stimul si dU m /d t = 0 . 2. Modelul G-H-K nu ia in considerare transportul activ (pompele ionice), care se desfasoara in paralel cu cel pasiv. € 3. In general, pentru membrana in stare de repaus (echilibru), € >> K si Na << Na , iar P >> P K . Prin canalele ionice pasive (deschise) [ ]i [ ]e [ ] i [ ] e K Na Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

€

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

9

ies din membrana ionii de K+ si intra ionii de Na+. Datorita mobilitatii mai mari a ionilor de K+ si datorita prezentei in celula a ionilor negativi mari (anioni organici) care nu pot trece prin porii membranei, se produce polarizarea electrica a membranei prin acumularea de sarcini pozitive pe fata sa exterioara si de sarcini negative pe cea interioara. Aceasta situatie caracterizeaza starea de polarizare a membranei, iar tensiunea de membrana in stare polarizata (in repaus) este U m = Vi (−) − Ve(+) < 0 . 4. Valoarea tensiunii de membrana in repaus are ordinul de marime al zecilor de milivolti, dar este caracteristica fiecarui tip de celule in parte si poate fi influentata de temperatura sau prin administrarea de substante chimice. € 5. Daca ecuatia G-H-K se particularizeaza pentru un singur tip de ioni, se regaseste ecuatia Nernst. 6. Una dintre ipotezele de baza ale modelului G-H-K este considerarea variatiei liniare a potentialului electric intre fetele membranei sau considerarea intensitatii campului electric constanta in membrana, ceea ce reprezinta o idealizare rezonabila (nu exista modele care sa lucreze cu alta ipoteza). 7. Transportul pasiv pentru membrana polarizata depinde de: - concentratiile ionice intra si extracelulare - tensiunea de membrana (care poate fi impusa prin conditiile experimentului, de ex. in tehnicile “voltage clamp”) - permeabilitatea membranei la anumite tipuri de ioni (selectivitatea) Schema electrica echivalenta a unui element de suprafata a membranei in modelul GOLDMAN – HODGKIN – KATZ (G-H-K) Ecuatiile atasate schemei electrice a modelului G-H-K se obtin prin aplicarea legii lui Ohm pe laturile circuitului, unde elementele de circuit sunt: capacitatea de membrana (Cm), rezistentele electrice (R) sau conductantele electrice (G=1/R) si generatoarele ideale de tensiune (U) corespunzatoare canalelor ionice pentru fiecare tip de ioni (Na+, K+, Cl-).

dU m , ( JC = 0 daca U m = const.) dt U − U Na J Na = m = (U m − U Na )GNa , RNa U − UK JK = m = (U m − U K )GK , RK U − UCl JCl = m = (U m − UCl )GCl . RCl

JC = Cm

€ € €

Conditia de echilibru J m = J Na + €J K + JCl + JC = 0 , conduce la expresia tensiunii de membrana de repaus sub forma

U m0 = €

U NaGNa + U KGK + UCl GCl . GNa + GK + GCl

€

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

10

Schema electrica cu trei conductante (rezistente) in paralel se poate reduce la o schema echivalenta mai simpla prin echivalarea celor trei ramuri cu o ramura avand o conductanta (rezistenta) echivalenta Gm = GNa + GK + GCl si o sursa de tensiune echivalenta, cu tensiunea Umo.

€

Observatie. Schema echivalenta redusa la care s-a ajuns in modelul G-H-K are aceeasi structura ca si schema echivalenta a unui canal ionic stabilita in cadrul modelului Nernst (vezi pg. 6), dar semnificatia elementelor schemei – Gm si Um0 - este diferita.

Aplicatie. Se cere determinarea tensiunii de repaus a membranei considerand concentratiile din tabel cu permeabilitatile membranare PK : PNa : PCl = 1: 0,12 :1,44 . * tensiunea pentru membrana polarizata (modelul G-H-K):

€

PNa P [Na]e + Cl [Cl]i RT PK PK ln = Um = Um 0 = P P F Na Cl [K]i + [Na]i + [Cl]e PK PK

[K]e +

25 ln # Aplysia este o specie de melc de apa, folosit ca preparat de laborator, pentru neuronii de dimensiuni mari ce pot fi usor extrasi si studiati

10 + 0,12 ⋅ 480 + 1,44 ⋅ 45 = −50,37 mV 10 + 0,12 ⋅ 61+ 1,44 ⋅ 490

€ canal ionic sunt urmatoarele: Tensiunile Nernst pentru fiecare

[ K ]e RT 10 ln = 25 ln = −83,3 mV , ZK F 280 [ K ]i [Na]e RT 480 ln = 25 ln = 51,57 mV , U Na = Z Na F 61 [Na]i UK =

€

UCl =

[Cl]i RT 490 ln = −25 ln = −59,69 mV . ZClF 45 [Cl]e

iar schema electrica echivalenta pentru un element de suprafata a membranei polarizate are € forma

€

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

11

Se observa urmatoarele: * densitatile de curent JNa, JK si JCl sunt orientate (conform legii lui Ohm) dupa orientarea caderilor de tensiune pe elementele rezistive RNa, RK si RCl ; ele semnifica fluxuri de sarcini pozitive, asadar: - ionii Na+ intra in celula - ionii K+ ies din celula - ionii Cl- intra in celula * circulatia ionilor de Cl este redusa, canalele fiind aproape in echilibru, deoarece caderea de tensiune pe rezistenta canalelor de Cl este redusa, desi PCl este mare * circulatia ionilor de K este favorizata de PK de valoare ridicata, iar circulatia ionilor de Na este favorizata de tensiunea mare pe rezistenta (conductanta) canalului respectiv.

2.2 Transportul pasiv in cazul membranei depolarizate. Relatia stimul-raspuns DEPOLARIZAREA MEMBRANELOR EXCITABILE Depolarizarea membranei se produce prin deschiderea canalelor ionice active, comandate in tensiune si/sau chimic, sub influenta unui factor stimulator (stimul). Stimulul poate fi: un curent electric injectat local pe o fata a membranei, variatia fortata a tensiunii de membrana, un semnal electric receptionat de la o alta celula excitabila, prezenta locala - in vecinatatea membranei - a unei substante chimice adecvate, etc. Starea electrica a membranei polarizate este ilustrata sintetic in figura urmatoare, asa cum a fost prezentata si anterior. Repartitia concentratiilor de ioni de o parte si de cealalta a membranei in stare de repaus (echilibru electrodinamic) face ca pe fata interioara sa existe un exces de sarcina negativa, iar pe fata exterioara un exces de sarcina pozitiva. Ca urmare, potentialul electric interior Vi < 0, iar cel exterior Ve > 0. Tensiunea de membrana de repaus Um0 este negativa, avand valori uzuale (-90,…-50) mV. Depolarizarea membranei este initiata de actiunea unui stimul, care creaza conditiile favorabile pentru deschiderea canalelor ionice de Na+, comandate in tensiune sau chimic.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

12

Depolarizarea (numita si strapungere regenerativa a membranei) este un proces foarte rapid de patrundere in celula a ionilor de Na+ (care in repaus sunt in exces in exteriorul celulei). Ca urmare a transferului (e) → (i) de sarcini pozitive, potentialul interior Vi creste la valori pozitive, iar potentialul exterior Ve scade; rezulta o crestere rapida a tensiunii de membrana la valori pozitive. Inchiderea ulterioara a canalelor de Na+ se face temporizat. Tensiunea de membrana pozitiva reprezinta comanda pentru deschiderea canalelor de K+, ceea ce declanseaza un flux de ioni de K+ care sunt transferati (i) → (e). Ca urmare, potentialul interior Vi scade din nou spre valori negative, iar cel exterior Ve creste. Membrana se repolarizeaza prin revenirea tensiunii de membrana la valoarea de repaus Um0. Observatii. 1. In procesul de depolarizare-repolarizare, la unele celule excitabile si la procesele de transmisie sinaptica intervin si ionii de Ca2+, ceea ce se va discuta mai tarziu. 2. Din punct de vedere al fenomenului de depolarizare, celulele excitabile sunt traductoare ale unui semnal de stimulare (STIMUL) de natura oarecare, intr-un semnal electric, reprezentat de o variatie a tensiunii de membrana Um sub forma unui impuls electric (impuls de depolarizare). In cazul celulelor nervoase si musculaturii striate stimulul este de natura chimica (neurotransmitator) si este receptionat la nivelul sinapselor. Celulele musculaturii cardiace (miocard) sunt legate prin canale ionice intercelulare si isi transmit direct de la una la alta stimulul de natura electrica. Celulele senzitive primesc stimuli de naturi diferite (termic, de presiune, chimic, sonor, luminos, etc.). IMPULSUL DE DEPOLARIZARE (POTENTIALUL DE ACTIUNE) Impulsul de depolarizare este un semnal electric si reprezinta variatia tensiunii de membrana, in sensul cresterii ei de la valoarea de repaus, (-90 … -50) mV pana la o valoare de varf, (10…50) mV, respectiv pe un interval de cca. 100 mV, urmata de revenirea la valoarea de repaus, prin modificarea controlata a permeabilitatii membranei la Na+ si K+. In lucrarile de biofizica (care au introdus acest fenomen), el este cunoscut sub denumirea de potential de actiune. La celulele musculare intervine si efectul cresterii permeabilitatii membranei la ionii de Ca2+, fenomen ce intervine in decursul repolarizarii. Forma impulsului de depolarizare evidentiaza o depolarizare rapida a membranei, urmata de o repolarizare mai lenta si eventual o hiperpolarizare.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

13

Etapele depolarizarii pentru membrana neuronului (1) - aplicarea stimulului (2) - cresterea tensiunii de membrana de la valoarea de repaus Um0, pana la valoarea de prag Up, prin injectie de sarcini electrice aduse prin curentul de stimulare (3) - depolarizarea = strapungerea regenerativa a membranei prin deschiderea masiva a canalelor ionice de Na+ comandate in tensiune; cresterea permeabilitatii la Na+ este brusca si scurta, dureaza cca. 0,1 ms pentru neuron (ionii de Na+ intra in celula), apoi scade brusc (4) - incheierea depolarizarii corespunde inchiderii canalelor de Na+ prin comanda temporizata, simultan cu deschiderea canalelor de K+ comandate in tensiune, pentru valoarea corespunzatoare tensiunii de varf a impulsului de depolarizare; constanta de timp de actionare a canalelor de K+ este considerabil mai mare decat cea a canalelor de Na+ si permeabilitatea membranei la K+ creste lent (5) - repolarizarea incepe la pct. (4) si continua cu iesirea ionilor de K+ din celula; dureaza (1,5 - 2) ms, apoi permeabilitatea membranei la K+ scade lent, iesirea ionilor de K+ din celula continua chiar daca Um a scazut la Um0 si poate continua cu o scadere si mai mare a Um, provocand hiperpolarizarea membranei. Forma de unda standard a impulsului de depolarizare pentru neuron. In figura urmatoare este reprezentata forma de unda pentru un impuls de depolarizare (potential de actiune) sincronizat cu stimulul, aplicat sub forma unui curent de tip treapta.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

14

* timp de strapungere regenerativa = intervalul de timp de la declansarea depolarizarii (trecerea tensiunii de prag), pana la atingerea tensiunii de varf; in acest interval canalele ionice de Na+ sunt deschise si creste conductanta corespunzatoare; coincide cu perioada refractara absoluta; dureaza cca. 1ms pentru neuron * tensiune de varf = tensiunea de membrana la sfarsitul strapungerii regenerative, cand s-a incheiat intrarea ionilor de Na+ in celula si urmeaza repolarizarea * repolarizarea corespunde revenirii tensiunii de membrana spre valoarea de repaus; creste conductanta corespunzatoare canalelor ionice de K+ care se deschid si lasa ionii de K+ sa iasa din celula * GNa variaza abrupt, sub forma unui impuls rapid, iar GK are o variatie mai lenta, cu panta de crestere si de descrestere mai mare; valoarea maxima a GK este mai putin de jumatate fata de valoarea maxima a GNa * desi tensiunea de membrana revine la valoarea Um0, distributia concentratiilor ionice nu corespunde starii de repaus, astfel se explica perioada refractara; prin transportul activ concentratiile se regenereaza si permite refacerea conditiilor de repaus * revenirea la Um0 se poate produce dupa o usoara hiperpolarizare Comentarii (1) Cresterea tensiunii de membrana intre valoarea de repaus Um0 si valoarea de prag Up se face in conditiile in care membrana isi pastreaza proprietatile din starea polarizata, respectiv conductantele GNa si GK raman constante; circuitul conductantelor (rezistentelor) paralel poate fi redus la o latura echivalenta Gm (respectiv Rm) si Um0 (conform modelului GoldmanHodgkin-Katz, unde schema cu conductante in paralel este reprezentata pentru o suprafata elementara a membranei).

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

15

(2) Cresterea tensiunii de membrana de la valoarea de repaus la cea de prag, Um0 → Up corespunde incarcarii condensatorului Cm in circuit de tip RC. (3) La aplicarea unui curent de stimulare care variaza in rampa (nu treapta), timpul de raspuns, respectiv reobaza au valori mai ridicate, deoarece intervine fenomenul de acomodare a membranei la stimul. (4) Daca membrana este mentinuta fortat la tensiune constanta mai redusa decat Um0, adica in stare de hiperpolarizare, este posibil ca in momentul intreruperii acesteia, tensiunea de membrana sa cresca brusc, similar unui impuls de depolarizare; are loc asa numita depolarizare spontana (anode break excitation). Principii specifice fenomenului de depolarizare (1) Declansarea depolarizarii depinde de: intensitatea, forma de unda si durata stimulului; desfasurarea depolarizarii din momentul depasirii tensiunii de prag nu mai depinde de stimul - principiul tot-sau-nimic; de altfel, forma de unda a impulsului de depolarizare dupa trecerea tensiunii de prag are o evolutie standard pentru fiecare tip de celula excitabila. (2) Membrana are proprietatea de autoexcitabilitate, in sensul ca dupa ce s-a produs local o depolarizare, in jurul zonei respective se transmite o unda de depolarizare care cuprinde, din aproape in aproape, zonele vecine, fara sa fie nevoie de aplicarea de noi stimuli exteriori; transmiterea in spatiu a impulsurilor de depolarizare se face fara atenuare; astfel se explica transmiterea semnalelor electrice pe caile sistemului nervos, ca suport informational; depolarizarea din aproape in aproape a miocardului este un proces similar (dar nu identic, deoarece miocitele sunt intim conectate intre ele prin canale ionice, astfel ca transferul ionilor se face direct intre celule fara sa mai fie implicat si spatiul extracelular). (3) Pentru tensiuni de membrana mai mici decat tensiunea de prag, adica in stare polarizata, membrana are comportament electric liniar (regimul de incarcare a condensatorului in circuit RC). (4) Dupa producerea unui impuls de depolarizare, zona respectiva de membrana are nevoie de un timp de regenerare (perioada refractara) pentru a fi capabila de o noua depolarizare. Comparatie intre impulsurile de depolarizare caracteristice pentru diferite tipuri de celule excitabile Asa cum s-a aratat in figurile anterioare, impulsul de depolarizare pentru neuron (mai precis pentru axonul neuronal), este un semnal rapid, cu panta de crestere mare (cca. 100 mV/ms) si revenire aproape tot atat de brusca; dureaza 2-3 ms. In cazul celulelor ce formeaza cordul, forma de unda este diferita. Tesutul excitabil cardiac prezinta doua tipuri de celule, care difera si prin activitatea electrica, respectiv forma de unda a impulsului de depolarizare.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

16

Impulsul rapid, este prezent la celulele musculaturii cardiace de lucru (miocite). Tensiunea de membrana creste brusc in etapa depolarizarii (similar cazului axonului neuronal), apoi de la valoarea de varf scade usor si se mentine la valori pozitive un interval indelungat (de cca. 200-300 ms), urmand apoi repolarizarea. Palierul de valori pozitive, care prelungeste repolarizarea se datoreaza, interventiei ionilor de Ca2+, care ca si ionii de K+, sunt admisi in celula in aceasta etapa, prin canale comandate in tensiune. Impulsul lent este caracteristic celulelor autoritmice ale cordului (prezente in nodurile sinoatrial si atrio-ventricular, ramurile Hiss si reteaua Purkinje), cele care se depolarizeaza spontan, monitorizate de sistemul nervos autonom. Cresterea tensiunii de membrana care marcheaza depolarizarea este lenta, iar dupa atingerea valorii de varf urmeaza repolarizarea la fel de lenta. Atat impulsul rapid, cat si cel lent dureaza cca. 200-300 ms, deci de aproximativ o suta de ori mai mult decat impulsul in cazul axonului neuronal.

LEGEA EXCITABILITATII MEMBRANELOR (Relatia STIMUL - RASPUNS) Raspunsul membranei la un stimul, prin declansarea depolarizarii, depinde de intensitatea, forma de unda si durata stimulului. Depolarizarea poate fi declansata fie de un stimul slab mentinul timp indelungat, fie de un stimul puternic si mai scurt. Intensitatea si durata stimulului sunt intr-o relatie de proportionalitate inversa. In figura sunt reprezentate raspunsurile la curenti de stimulare sub forma de treapta, cu diferite amplitudini. Cazul: (a) – la limita depolarizarii (reobaza) (b) – depolarizare reusita (c) – sub limita de depolarizare (d) – hiperpolarizare Un stimul suficient de puternic (cazul b) produce depolarizarea daca este mentinut un timp suficient de lung. Dupa initierea impulsului de depolarizare, stimulul poate fi intrerupt; el nu mai influenteaza forma de unda a tensiunii de membrana (principiul tot-sau-nimic). Amplitudinea unui stimul care se afla la limita dintre valorile care asigura depolarizarea si cele care nu pot produce depolarizare (cazul a), se numeste reobaza. Cu alte cuvinte, reobaza este amplitudinea minima a stimulului de forma treapta, care mentinut timp nedefinit de lung, produce depolarizarea. Un stimul cu amplitudine mai mica decat a reobazei (cazul c) nu va produce depolarizare. Tensiunea de membrana creste similar cu tensiunea de incarcare a condensatorului in circuit RC atata timp cat este mentinut stimulul, apoi scade exponential la intreruperea acestuia. Daca se aplica membranei un stimul de polaritate opusa (cazul d), membrana se hiperpolarizeaza. Comportamentul electric este tot ca al unui circuit RC. Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

17

Legea excitabilitatii reprezinta dependenta dintre amplitudinea stimulului (sub forma de treapta) si timpul de raspuns. Pentru determinarea experimentala a legii excitabilitatii se repeta cicluri de stimulare si inregistrare a raspunsului, similar experimentului descris anterior. Perechile de valori amplitudine stimul – timp de raspuns se reprezinta grafic. Graficul are o asimptota orizontala, la valoarea reobazei (Ir). In procedurile bio-medicale de stimulare electrica se obisnuieste sa se lucreze cu un stimul de amplitudine dubla fata de reobaza (2Ir). Timpul de raspuns in acest caz poarta denumirea de cronaxie (tc). In 1909, Lapicque a exprimat legea excitabilitatii

⎛ t ⎞ prin relatia: Is ( t ) = Ir ⎜1+ c ⎟ , punand in evidenta ⎝

t⎠

proportionalitatea inversa stimulului si timpul util.

dintre

amplitudinea

€

Aplicatie. Determinarea cronaxiei pentru o membrana celulara oarecare (model idealizat) Se studiaza comportamentul membranei sub pragul de depolarizare; membrana este reprezentata prin circuitul liniar RC cu elementele corespunzatoare suprafatei elementare a membranei. Cursa tensiunii de membrana intre Um0 si Up corespunde, asa cum s-a mai spus, formei de variatie in timp a tensiunii la incarcarea unui condensator cand este injectat curent constant, reprezentat in schema prin densitatea curentului de stimulare Js.

)[

]

U m ( t ) = U m0 + U p − U m0 1− e−t / τ m , C ε unde τ m = RmCm = m = m . Gm σ m

(

Membrana este tot timpul in stare polarizata, deci Jm = 0, iar la sfarsitul procesului (teoretic la t → ∞ ), rezulta U p − U m0 = −J s /Gm . Astfel, ecuatia tensiunii Um(t) se poate rescrie

€ €

U m ( t ) = U m0 −

Js 1− e−t / τ m . Gm

[

]

Asupra acestei ecuatii se impun conditiile experimentului cu stimul de nivelul reobazei € ( J s = J r ) si de nivel dublu fata de reobaza ( J s = 2J r ):

€

Jr Gm € t = tc ; rezulta U p = U m0 − 2J r 1− e−t c / τ m * J s = 2J r , asadar U m → U p pentru Gm € € ε Din expresiile obtinute pentru tensiunea€de prag rezulta tc = τ m ln2 = 0,693 m , adica σm € € valoarea cronaxiei este caracteristica pentru fiecare tip de membrana, deoarece depinde de €

* J s = J r , asadar U€ m → U p pentru t → ∞ ; rezulta U p = U m0 −

€ € €

[

proprietatile electrice ale acesteia.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism €

]

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

18

Pentru ilustrare, in tabelul de mai jos sunt date valori tipice ale cronaxiei pentru cateva tipuri de celule excitabile si cateva specii de animale.

Observatii Modelul excitabilitatii prezentat prin dependenta stimul-timp de raspuns si analizat prin functionarea circuitului RC este in mare masura idealizat, deoarece: - ignora influenta temperaturii si a altor factori, de ex. chimici; - circuitul electric este considerat liniar, inclusiv pentru tensiunea de prag; in realitate, incepand cu o tensiune de membrana de cca. 85% din valoarea de prag incepe sa se simta efectul neliniaritatilor circiutului (deschiderea canalelor de Na nu se face simultan pentru toate canalele, la o valoare fixa a tensiunii de comanda, astfel GNa variaza treptat); - membranele naturale prezinta proprietatea de acomodare la stimul, iar stimulii reali nu sunt tip treapta, ci au o panta finita de crestere; acomodarea intervine si in cazul aplicarii repetate a stimulului.

2.3 Transportul activ prin membrane excitabile. Pompele ionice Regenerarea concentratiilor ionice intra si extracelulare, asigurata prin procesele de transport activ, este necesara pentru mentinerea activitatii celulare in starea de repaus si pentru repolarizarea membranei in urma unui impuls de depolarizare. Transportul activ este realizat prin intermediul unor proteine transportoare, cu rol de enzime, care stabilesc legaturi chimice cu ionii de pe o fata a membranei, ii transporta pe cealalta fata si apoi ii elibereaza; ele se numesc POMPE IONICE. Transportul activ se desfasoara impotriva “tendintei naturale” explicata prin procesele electrochimice care au tendinta de a mentine echilibrul termodinamic, de aceea are loc cu consum de energie furnizata de metabolism. Aceasta energie este stocata prin legaturile chimice (legaturi fosfatice) ale compusilor macromoleculari de tip ADENOZINTRIFOSFAT ATP. Functionarea pompelor s-a studiat experimental cu inhibitori metabolici, iar ritmul in care se desfasoara transferul ionilor s-a studiat prin marcarea ionilor cu trasori radioactivi. De exemplu, pentru pompa Na/K s-a stabilit ca la 3 ioni de Na+ eliminati din celula, corespund 2 ioni de K+ introdusi in celula. Functionarea pompei Na / K Relatia stoichiometrica atasata functionarii pompei Na/K are forma

3Na+(i ) + 2K+(e) + ATP(i ) → 3Na+(ei ) + 2K+(i ) + ADP(i ) + P(e) + energie pentru transport

€

Mecanismul pompei este sustinut de enzima transportoare specifica de tip ATP-aza, care se prezinta cu doua stari conformationale: X - are locuri de legare pentru ionii de Na+ de pe fata (i) a membranei Y - are locuri de legare pentru ionii de K+ de pe fata (e) a membranei

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

19

Comutarea enzimei intre cele doua stari permite transportul ionilor impotriva gradientului de concentratie natural, de aceea se face cu consum energetic. Figura urmatoare sugereaza un ciclu de functionare a pompei.

Comentarii (1) Mecanismele de functionare a pompelor ionice nu sunt complet elucidate la nivelul legaturilor chimice care identifica exact locul de legare a ionilor de enzima si la nivelul reactiilor chimice care explica schimbarea locului de legare la trecerea enzimei din forma X in Y si invers, cand ionul este mutat de pe o fata pe alta a membranei. (2) In mod similar functioneaza si pompele de Ca2+ care sunt intalnite la nivelul reticulului endoplasmatic in cazul celulelor musculare. (3) Daca pompa de Na / K si pompa de Ca sustin asa numitul transport activ primar, adica ionii sunt transportati numai in sens opus gradientului de concentratie, exista si pompe care sustin transportul activ secundar, in care cel putin o categorie de ioni este transportata in sensul gradientului de concentratie; acel gradient de concentratie este mentinut printr-un alt proces de transport activ primar. (4) Transportul activ secundar se desfasoara cu consum energetic mai redus. (5) Un exemplu de transport activ secundar este pompa Na / Ca care functioneaza la nivelul celulelor miocardului si controleaza concentratia (scazuta) a ionilor de Ca2+ in aceste celule (10-4 mol/m3 in interor fata de 2 mol/m3 in exterior). (6) Desfasurarea transportului activ ca proces stationar (cu rata constanta) compenseaza transportul pasiv la nivel statistic (in medie si pe intervale lungi de timp), dar instantaneu este nesemnificativ. (7) Pentru comparatie, in transportul pasiv densitatea de canale ionice este de ordinul 102 canale/µm2, iar capacitatea canalelor permite o rata de transfer a ionilor de cca. 106-108 ioni/s. (8) Activitatea de transport activ explica perioada refractara (necesara regenerarii concentratiilor ionice) care urmeaza unei depolarizari.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

20

2.4 Modele electrice pentru membranele excitabile. MODELUL HODGKIN – HUXLEY Fiziologii britanici Alan Lloyd Hodgkin si Andrew Fielding Huxley au primit in anul 1963 premiul Nobel pentru fiziologie, ca recunoastere a contributiilor pe care le-au avut la studiul experimental si teoretic al proceselor de transport ionic pasiv, in cazul membranei depolarizate a axonului neuronal. Cei doi au elaborat un model pentru comportamentul electric al axonilor nemielinizati, folosind in experimentele lor axoni de calmar, la temperatura de 6,30C. Cercetarile lor se bazeaza pe un bogat program experimental care a permis stabilirea schemei electrice echivalente pentru celule excitabile cilindrice si modelul matematic care simuleaza comportamentul electric al neuronului. Programul experimental introduce tehnica “voltage clamp” (la tensiune fixata), in cadrul careia, pentru depolarizarea membranei este aplicata o tensiune de membrana care se mentine constanta pe toata suprafata membranei, iar curentul ionic transmembranar rezultat este masurat si analizat. Ecuatiile modelului matematic verifica rezultatele experimentale si permit anticiparea comportarii unei celule de tipul studiat. Ulterior, a fost introdusa si o corectie pentru temperatura. Desi modelul este conceput cu date referitoare la axonul de calmar, configuratia lui se poate adapta si la alte tipuri de celule, ceea ce a fost demonstrat prin aparitia, in deceniile care au urmat, a unui lung sir de modele similare, pentru alte tipuri de celule. Descrierea programului experimental Metoda “VOLTAGE CLAMP” (la tensiune fixata) impune membranei un comportament sincron si uniform, pe toata suprafata sa (space clamp), din punct de vedere al tensiunii de membrana. Aceasta premiza de lucru reduce problema la o singura dimensiune si anume cea transversala membranei. La Um = const. ⇒ Jm = Cm·dUm/dt = 0 si ramura cu Cm poate sa dispara din circuitul electric echivalent pentru un element de suprafata a membranei. Prin acest procedeu se impun valori ale “tensiunii fixate” care blocheaza pe rand canalul de Na, apoi pe cel de K si se identifica formele de unda ale curentilor prin canalele respective. Figura alaturata prezinta principiul metodei experimentale “voltage clamp”.

(dupa J. Malmivuo, R. Plonsey Bioelectromagnetism. Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields, Oxford Univ. Press, 1995)

Circuitul real utilizat de Hodgkin, Huxley si Katz in 1952, in experimentele “voltage clamp” executate pe preparatul de axon gigant de calmar (cca. 0,5 mm diametru) este prezentat in schema alaturata. (dupa J. Malmivuo, R. Plonsey - Bioelectromagnetism. Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields, Oxford Univ. Press, 1995)

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

21

Componentele schemei si rolul lor in experiment sunt urmatoarele: - un amplificator unitar (cu impedanta mare de intrare) preia tensiunea de membrana Um intre electrozii (b) si (c); - Um si tensiunea impusa Uc (asa numita tensiune fixata) sunt comparate, iar diferenta dintre ele (amplificata cu factorul K) corecteaza valoarea densitatii curentului prin membrana Jm (injectat de sursa de curent), in sensul mentinerii tensiunii Um la valoarea fixata; - curentul prin membrana Jm, injectat intre electrozii (a) si (e) este masurat cu ajutorul rezistentei calibrate (shunt) Rc; - electrozii interiori (a si b) sunt de fapt fire conductoare rasucite impreuna pe un suport izolant. Exemple de rezultate in experimente de tip “voltage clamp” (dupa J. Malmivuo, R. Plonsey - Bioelectromagnetism. Principles and Applications of Bioelectric and Biomagnetic Fields, Oxford Univ. Press, 1995)

Initial membrana este in echilibru (polarizata), la tensiunea Um0 = -65 mV. In cadrul experimentului “voltage clamp” se aplica transmembranar o treapta de 85 mV, care duce si mentine tensiunea de membrana la valoarea de 20 mV. Densitatea de curent prin membrana este nula cat timp membrana este polarizata (Um0 = -65 mV), apoi se inregistreaza un scurt impuls corespunzator curentului capacitiv la variatia treapta a tensiunii, JC = Cm·dUm/dt ≠ 0. Pentru t > 0 se observa ca densitatea de curent are intai valori negative (curent ionic ce intra in celula), apoi creste cu valori pozitive (curent ionic ce iese din celula). In prezentarea fenomenelor care explica depolarizarea membranei s-a vazut ca acest proces incepe cu un curent al ionilor de Na care intra in celula si continua cu un curent al ionilor de K care ies din celula. Repetarea acestui tip de experiment pentru mai multe tensiuni fixate, conduce la observatia ca densitatea curentului de K are o variatie de acelasi tip, pentru toate cazurile, iar densitatea ionilor de Na variaza in functie de valoarea tensiunii fixate. Daca tensiunea aplicata membranei este de 117 mV, respectiv tensiunea fixata are 52 mV, se observa ca densitatea curentului de Na este anulata, iar forma de unda a curentului transmembranar pune in evidenta doar existenta curentului de K. Explicatia este aceea ca valoarea de 52 mV reprezinta tensiunea Nernst pentru canalele de Na, ceea ce inseamna ca la aplicarea acestei tensiuni se produce blocarea acestor canale, adica anularea fluxului ionilor de Na. Forma de unda a curentului de K (cea obtinuta la tensiunea fixata de 52 mV), se scade apoi din forma de unda a curentului total, rezultand curentul de Na.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

22

Schema electrica echivalenta in modelul HODGKIN - HUXLEY Schema circuitului electric echivalent pentru un element de suprafata a membranei este completata in cadrul modelului H – H cu conductantele neliniare (variabile atat in timp cat si in functie de tensiunea de membrana) ale canalelor ionice de Na si de K. In regimul dinamic, densitatea de curent pe canalul de Cl este constanta si foarte redusa; modelul H-H reuneste toate fluxurile ionice nespecifice (leakage), intr-o contributie echivalenta JL pe un canal cu conductanta GL constanta. Densitatile de curent pentru canalele ionice in regim dinamic (membrana activa, depolarizata) sunt variabile in timp; la Um fixat, J variaza proportional cu G pentru fiecare canal ionic. Astfel, se deduce ca in regimul dinamic, conductantele canalelor ionice de Na si de K sunt variabile, atat in functie de timp, cat si de tensiunea de membrana Um; modelul matematic H - H furnizeaza expresiile acestor conductante, stabilite empiric, prin corelatii rezultate din prelucrarea datelor experimentale. Modelul matematic formulat de HODGKIN si HUXLEY Conductanta canalului de K este exprimata prin expresia analitica 4

GK ( t,um ) = G K ( um ) ⋅ [ n ( t,um )] , unde G K ( um ) este valoarea maxima a conductantei la o anumita tensiune aplicata, um = U m − U m0 , iar n reprezinta parametrul de activare si este exprimat ca solutie a unei ecuatii diferentiale:

€ dn = α n (1− n ) − β n n , respectiv are forma n ( t,um ) = n∞ − ( n∞ − n 0 )e−t / τ n . dt

€ €

Coeficientii care intervin in ecuatii sunt determinati cu expresiile empirice urmatoare:

um

€

€

− 0,01⋅ (10 − um ) αn 1 n∞ = , τn = , α n ( u€m ) = , β n ( um ) = 0,125 ⋅ e 80 . ⎛ um ⎞ α n + βn α n + βn ⎜1− ⎟ e⎝ 10 ⎠ −1

Observatie.€ Pentru tensiunea um masurata in [mV], rezulta coeficientii € αn si βn masurati in [1/ms].

€

Cu aceste expresii, conductanta canalelor de K poate fi reprezentata si grafic, pentru diferite tensiuni um aplicate membranei.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

23

Conductanta canalului de Na este exprimata prin expresia analitica 3

GNa ( t,um ) = G Na ( um ) ⋅ [ m( t,um )] [ h ( t,um )] , G Na ( um ) este valoarea maxima a conductantei la o anumita tensiune, um = U m − U m0 , iar m si h reprezinta parametrul de activare, respectiv parametrul de

unde

dezactivare, si sunt exprimati ca solutii ale unor ecuatii diferentiale de forme similare:

€ dm −t / τ m , = α ⋅ m (1− m ) − β m ⋅ m , a carei solutie are forma m( t,um ) = m∞ − ( m∞ − m 0 )e € dt dh = α h ⋅ (1− h ) − β h ⋅ h , a carei solutie are forma h ( t,um ) = h∞ − ( h∞ − h0 )e−t / τ h . dt Coeficientii care intervin in ecuatii sunt si in acest € caz determinati cu expresii empirice, avand

€

€

formele urmatoare:

u

− m € 0,1⋅ (25 − um ) αm 1 m∞ = , τm = , α m ( um ) = , β m ( um ) = 4 ⋅ e 18 . ⎛ um ⎞ α m + βm α m + βm ⎜ 2,5− ⎟ 10 ⎠ −1 e⎝

€

αh 1 h∞ = , τh = , α€h + β h α h + βh €

€

€

u − m α h ( um ) = 0,07 ⋅ e €20 ,

e

€

€

Observatie. Pentru tensiunea um masurata in [mV], rezulta coeficientii αm , βm , αh , βh in [1/ms].

€

Cu aceste expresii conductanta canalelor de Na poate fi reprezentata si grafic, la diferite valori ale tensiunii de membrana u m.

Exemplu de utilizare a modelului matematic Date:

€ € € € € € € €

1 β h ( um ) = ⎛ um ⎞

Cm = 1 µF/cm2 U Na − U m0 = 115 mV U K − U m0 = −12 mV U L − U m0 = 10,613 mV

G Na = 28 mS/cm2 G K = 13 mS/cm2 GL = 0,3 mS/cm2 θ = 6,3 oC

(dupa Hodgkin A.L., Huxley A. F. - “A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve” , J. Physiol. (London), nr. 117/1952)

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

⎜ 3− ⎟ ⎝ 10 ⎠

+1

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

24

Comentarii si observatii (1) Modelul matematic elaborat de Hodgkin si Huxley este bazat pe corelatii stabilite din datele experimentale, asadar verifica experimentele efectuate pe axonul de calmar, la temperatura de 6,3 0C; modelul nu explica mecanismele de variatie ale conductantelor si nu ia in considerare inchiderea canalelor de K. (2) Pentru alte temperaturi, modelul H-H propune corectii, prin multiplicarea termenilor din dreapta ecuatiilor de definitie a parametrilor de activare si dezactivare cu coeficientul φ, unde θ−6,3 φ = 3 10 , iar θ reprezinta temperatura in 0C.

€

(3) Valabilitatea modelului Hodgkin - Huxley este limitata la preparatul de laborator pentru care a fost elaborat, dar are o mare importanta stiintifica, deoarece acrediteaza o metoda adecvata in cercetarea de specialitate, bazata pe experiment si corelatie matematica; programul experimental desfasurat de Hodgkin si Huxley a introdus si a acreditat metoda “voltage clamp”, utilizata in continuare in studiile de circulatie ionica prin membrane. (4) Similar modului de abordare in cadrul modelului Hodgkin – Huxley s-au analizat si alte tipuri de celule excitabile: * modelul Frankenhauser - Huxley (1964) pentru fibrele nervoase mielinizate * modelul Connor - Stevens (1971) pentru neuronul de gastropode - introduce si pentru canalul de K un parametru de dezactivare * modelul Plant (1976) pentru neuronul de Aplysia - introduce si actiunea pompei ionice de Na/K * modele complexe de neuroni (1991 - 1994) - in care sunt considerate diferite tipuri de canale ionice specifice zonelor structurale ale neuronului * modelul Morris - Lecar (1981) si modelul Gonzales - Fernandez - Ermentrout (1994) pentru celulele musculare, in care se introduce si contributia canalelor ionice de Ca * modelul Di Francesco - Noble (1985) - pentru celule apartinand tesutului conductiv al cordului (reteaua Purkinje), considera 12 tipuri de canale ionice pentru transportul pasiv si activ al ionilor de N, K, Ca si al ionilor nespecifici * modelul Earm - Hilgemann - Noble (1990) - pentru celule cardiace autoritmice din nodul sinoatrial

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

25

MODELUL CELULEI CILINDRICE LUNGI (MODELUL CABLULUI COAXIAL) Acest model este constituit dintr-o schema electrica echivalenta si un model matematic, ambele asociate fenomenelor electrice de membrana in cazul celulelor lungi, sau unor parti ale acestora, de ex. axonul neuronal sau fibra lunga a musculaturii striate. Cu ajutorul acestui model se descrie fenomenul de transmitere a depolarizarii, din aproape in aproape, in lungul celulei. Configuratia cilindrica ce modeleaza axonul prezinta subdomeniile: (i) - mediu intracelular - material conductor, σi = 1...2 S/m (e) - mediu extracelular - material conductor, σe ≈ 10σi (m) - membrana - material izolant σ m este variabila in functie de selectivitatea membranei

€ €

€ Ipotezele modelului electric al celulei cilindrice lungi: * simetria axiala si simetria plan-paralela a domeniului fizic permit reducerea problemei 3D la o problema 1D, dupa directia x, longitudinala a fibrei cilindrice * mediile (i) si (e) sunt omogene si liniare cu conductivitatile σi, respectiv σe constante dupa directia x, respectiv au conductivitati nule dupa directia radiala fibrei cilindrice * membrana (m) este un mediu omogen si liniar sau neliniar (in functie de regimul electric), cu conductivitate σm si permitivitate εm finite dupa directia radiala a fibrei cilindrice si nule dupa directia longitudinala x * schema electrica echivalenta este un circuit cu elemente distribuite * fibra cilindrica este reprezentata prin schema electrica echivalenta a unei linii electrice lungi, infinite, fara elemente inductive; linia infinit lunga nu are fenomene de reflexie, iar lipsa elementelor inductive caracterizeaza deplasarea campului electric in lungul liniei printr-un fenomen de tip difuzie Observatie. Utilizarea expresiei "propagarea undei de depolarizare" este incorecta deoarece avem de a face cu un fenomen de difuzie si nu unul de propagare, lucru dovedit atat prin aspectele fizice ale fenomenului, cat si prin tipul de ecuatii care il descriu. Circuitul electric al unui element Δx de lungime a fibrei este reprezentat in schema din figura urmatoare. Schema electrica reprezentata aici corespunde membranei in stare polarizata; ea este similara cu schemele prezentate in modelele anterioare, dar acum elementele de circuit sunt raportate la lungimea elementara a fibrei cilindrice lungi.

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

26

Elementele din schema sunt definite astfel:

ri =

⎡Ω⎤ 1 1 ⎡Ω⎤ 1 1 , re = << r i ⎢ ⎥ ⎢⎣m⎥⎦ 2 σi πa 2 ⎣m⎦ σe πRext − πa 2

2πa ⎡ S ⎤ 1 = σm , d ⎢⎣ m⎥⎦ rm € ⎡ A⎤ im = J m (2πa) ⎢ ⎥ ⎣ m⎦ gm =

€

c m = εm

2πa ⎡ F ⎤ d ⎢⎣ m⎥⎦

€

€

Generalizare. Schema electrica echivalenta celulei cilindrice lungi contine caseta cu elemente transversale (marcata € in figura urmatoare cu linie punctata); aceasta se inlocuieste cu schema (a) pentru cazul membranei in stare polarizata si cu schema (b) pentru cazul membranei in stare depolarizata. Pentru fiecare caz, este specificata expresia curentului transmembranar.

(a)

im = (U m − U m0 ) gm + c m = um gm + c m

∂U m = ∂t

∂um ∂t

€ Caseta marcata cu linie punctata reprezinta un modul transversal al schemei si cuprinde elementele de circuit care modeleaza membrana. In dreapta sunt reprezentate cele doua variante pentru aceasta schema si expresiile corespunzatoare pentru curentul im: (a) pentru membrana polarizata si (b) pentru membrana depolarizata.

€

(b)

im = (U m − U Na ) gNa + (U m − U K ) gK +

(U m − U L )gL + c m

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

∂U m ∂t

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

27

Ecuatia distributiei spatio - temporale a tensiunii de membrana Pe circuitul electric reprezentat anterior (schema echivalenta elementului Δx de lungime a fibrei cilindrice) se poate aplica ecuatia lui Ohm atat pe latura (i), cat si pe latura (e) :

Vi ( x ) − Vi ( x + Δx ) = ii ⋅ ( ri Δx ) , respectiv Ve ( x ) − Ve ( x + Δx ) = ie ⋅ ( reΔx ) . Aceste ecuatii se pot rescrie, punand in evidenta derivatele potentialelor in raport cu coordonata x, exprimate prin diferente finite:

€

€ Vi ( x + Δx ) − Vi ( x ) V ( x + Δx ) − Ve ( x ) ∂V ∂V = −ri ⋅ ii ≅ i , respectiv e = −re ⋅ ie ≅ e . Δx ∂x Δx ∂x

In mod similar, se poate aplica teorema a I-a a lui Kirchhoff in nodurile circuitului:

€ ii ( x ) − ii ( x + Δx ) = imΔx , respectiv ie ( x ) − ie ( x + Δx ) = −imΔx − isΔx .

€

Prin gruparea convenabila a termenilor si exprimarea derivatelor intensitatilor de curent in raport cu coordonata x, rezulta

ii ( x + Δx ) − ii ( x ) i ( x + Δx ) − ie ( x ) ∂i ∂i = −im ≅ i ,€respectiv e = im + is ≅ e . Δx ∂x Δx ∂x

€

Cu ajutorul ecuatiilor de tensiuni se poate exprima derivata partiala in raport cu x a tensiunii de membrana:

∂U m ∂ ∂V ∂V = (Vi − Ve€ ) = i − e = −ri ⋅ ii + re ⋅ ie . ∂x ∂x ∂x ∂x

€

Daca se deriveaza inca o data ecuatia de mai sus si se inlocuiesc expresiile derivatelor partiale in raport cu x ale curentilor, rezulta

€

∂2U m ∂x

2

= −ri

∂ii ∂i + re e = ri im + re (im + is ) . ∂x ∂x

Ecuatia cu derivate partiale de ordinul al doilea expresia curentului € de membrana:

∂2U m ∂x 2

= ( ri + re )im + reis se completeaza cu

* pentru membrana polarizata (cazul a), im = (U m − U m0 ) gm + c m

€ b), * pentru membrana depolarizata (cazul

∂U m , ∂t

im = (U m − U Na ) gNa + (U m − U K ) gK + (U m − U L ) gL + c m € Se obtine astfel o ecuatie cu derivate partiale de ordinul doi in spatiu si de ordinul intai in timp, care exprima distributia spatio-temporala a tensiunii de membrana; ecuatia are forme specifice pentru membrana€polarizata (cazul a),

∂2U m

⎡ ∂U m ⎤ + reis , = r + r U − U g + c ( ) ( ) i e m m0 m m ⎢ ⎣ ∂t ⎥⎦ ∂x 2

si respectiv pentru membrana depolarizata (cazul b).

∂2U m ∂x

€

2

∂U m − ( ri + re )c m − ( ri + re )[ gNa (U m − U Na ) + gK (U m − U K ) + gL (U m − U L )] = reis . ∂t €

In ambele cazuri se obtine o ecuatie cu derivate partiale, de tip difuzie; in cazul a ecuatia este liniara si are solutie analitica pentru cazuri particulare ale curentului de stimulare is, iar in cazul b este neliniara, cu coeficienti variabili gNa(Um,t) si gK(Um,t) si se poate rezolva numai prin metode numerice in combinatie cu modelele de tip Hodgkin - Huxley. Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

∂U m ∂t

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

28

Aplicatie. Forma generica a ecuatiei pentru cazul a se poate obtine dupa o prelucrare suplimentara a ecuatiei

∂2U m ∂x

2

⎡ ∂U m ⎤ + reis . = ( ri + re )⎢(U m − U m0 ) gm + c m ⎣ ∂t ⎥⎦

Daca se introduce o noua forma pentru exprimarea tensiunii de membrana (similar unei schimbari de variabila pentru tehnica de rezolvare analitica), notand cu um = Um – Um0, se inlocuieste in ecuatie Um = um + Um0 si rezulta

rm ∂2 um ∂um re rm − r c − u = is , m m m ri + re ∂x 2 ∂t ri + re

€

unde se identifica asa-numitele constante de timp si spatiu ale membranei:

λm =

rm = ri + re

€

1 ≈ gm ( ri + re )

rm σi ad = ri σm 2

si

c ε τ m = rmc m = m = m , gm σ m

iar ecuatia cu derivate partiale "de tip difuzie" a tensiunii de membrana, pentru membrana polarizata se poate exprima in forma

€

λ2m

€ ∂um − τm − um = re λ2mis . 2 ∂t ∂x

∂ 2 um

2.5 Campul electric si campul magnetic la distanta fata de sursa

€

Estimarea intensitatii campului electric sau a potentialului electric, si a intensitatii campului magnetic sau a inductiei magnetice la distanta de sursa reprezentata de celula cilindrica lunga este utila in stabilirea legaturii dintre o astfel de sursa si masuratorile ce pot fi executate la distanta (de exemplu extracutanat).

Fenomenele care se studiaza sunt la distanta de celula cilindrica, care poate fi considerata filiforma (2a << L, unde L se considera lungimea celulei dupa axa x). Sursa elementara de curent, (imdx) poate fi considerata punctiforma, respectiv de volum πa2dx → 0. Punctul in care se face estimarea potentialului electric este P(x’,y’,z’) , aflat fata de sursa (imdx) la distanta r = ( x − x')i + y' j + z'k , respectiv r = r =

( x − x') 2 + y'2 +z'2 .

In aceste conditii, densitatea de curent printr-o suprafata sferica, de raza r, ce inconjoara

im d x * e r , iar €sursa elementara si trece prin € punctul de calcul P(x’,y’,z’) este: J m = 4πr 2 intensitatea campului electric corespunzator in acelasi punct, conform legii conductiei * electrice este E =

1 * 1 im d x Jm = e r . Pentru estimarea potentialului electric in punctul σe σe 4πr 2 € Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism

€

Capitolul 2 - Sursele elementare de camp electric si magnetic din organism

P se stie ca

29

dVP* 1 im d x = −E * = − , iar prin integrare in raport cu variabila r se obtine dr σe 4πr 2

i dx VP* ( r) = m , care reprezinta contributia sursei elementare la potentialul electric intr-un 4πσe r

punct P aflat la distanta r de sursa. Pentru a determina contributia fenomenelor electrice de € pe intreaga celula de lungime L, se integreaza expresia anterioara in lungul celulei (dupa x)

€

L

VP (x', y',z') =

πa 2σi

L

i dx

m = ∫ ∫ 4πσ r e

0

0 4πσe

∂2U m

dx ∂x 2 2

( x − x') + y'2 +z'2

2

=

a σi 4σe

∂2U m

L

∫ 0

∂x 2 2

( x − x') + y'2 +z'2

dx ,

unde s-a tinut seama de expresia curentului de membrana din modelul cablului coaxial si s-a considerat ca potentialul la exteriorul membranei este constant. Um intervine sub integrala ca solutie a ecuatiei cu derivate partiale prezentata anterior, in functie de regimul membranei (polarizata – cazul A, sau depolarizata – cazul B). Cu expresia VP se poate determina intensitatea campului electric in spatiul din jurul celulei (un singur potential de actiune produce un camp electric de (0,01 … 0,1) V/m in apropierea celulei).

€

Pentru determinarea campului magnetic la distanta de celula cilindrica se constata ca sursa elementara, curentul prin membrana (imdx), nu produce camp magnetic la distanta de fibra; liniile de camp magnetic inconjoara curentul si raman localizate in membrana. In schimb, curentul care strabate interiorul celulei, in lungul ei, ii, produce camp magnetic la distanta, intr-un punct P(x’,y’,z’).

Conform legii circuitului magnetic (in forma redusa exprimata de teorema lui Ampere)

HP =

1 ii , iar inductia magnetica BP = µ 0 H P , are atunci expresia 2π r ii 1 1 ∂U m µ µ , BP x ,, y ,,z , = 0 =− 0 2 2 2 2 2 2 2π 2π ∂x r i , +y, +z, x−x , +y , +z, €x − x

(

€

unde

ii = − €

s-a

)

tinut

(

seama

)

de

(

expresia

curentului

)

din

modelul

cablului

coaxial

1 ∂Vi 1 ∂(U m + Ve ) 1 ∂U m =− =− , iar Um este solutia ecuatiei cu derivate partiale din ∂x ri ∂x ri ri ∂x

acelasi model, rezolvata in regimul corespunzator.

€

Mihaela MOREGA - Bioelectromagnetism