Cap 6 A

Universidad Nacional del Comahue Escuela Superior de Salud y Ambiente Licenciatura en Enfermería Cátedra de Microbiología y Parasitología Capítulo 6 ANTIMICROBIANOS Objetivos: • Verificar el grado de sensibilidad o la resistencia de los microorganismos frente a distintos agentes antimicrobianos. • Reflexionar acerca de los riesgos que implica la posible dispersión de la resistencia a los antimicrobianos en el ambiente. Introducción: Es un hecho ampliamente documentado que la aparición de resistencia a antibióticos se debe primariamente a su uso excesivo y frecuentemente innecesario en humanos y animales. Los factores de riesgo para la dispersión de la resistencia tanto en centros de salud como en la comunidad en general incluyen sobrepoblación, falta de higiene y prácticas deficientes en el control de las infecciones (Rao, 1998). La resistencia a fármacos por parte de los microorganismos ha sido extensamente estudiada no sólo desde el punto de vista clínico sino desde el punto de vista de la genética molecular. Se sabe que la información relacionada con tal resistencia esta frecuentemente codificada en genes que son portados en plásmidos. Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico, que se pueden replicar en forma independiente del cromo soma bacteriano y que son transmisibles entre bacterias, aún no emparentadas entre sí, por medio del mecanismo de conjugación. Esto hace que la información portada en los plásmidos se disperse con bastante facilidad entre cepas patógenas y aquellas que no lo son. De este modo es posible que bacterias presentes en suelo yagua que habitualmente no presentan resistencia a fármacos puedan adquirir esta capacidad y contribuir de este modo a la dispersión de la misma. Este hecho representa un riesgo para la salud debido a que esta resistencia puede ser transferida a los seres humanos u otros animales (Kelley & col, 1998). Se conoce como antimicrobiano a toda sustancia química que impide el desarrollo de un microorganismo o que provoca su muerte. Los agentas antimicrobianos pueden ser.de tres tipos: A. Desinfectantes: son aplicables a sistemas inanimados. Reducen el número de gérmenes viables, pero no eliminan a los gérmenes esporulados. B. Antisépticos: aplicables sobre piel y mucosas humanas y animales, reducen y controlan la presencia de gérmenes potencialmente patógenos. C. Antimicrobianos de uso clínico-terapéutico: drogas capaces de controlar la presencia de

1

microorganismos patógeno s que han invaqido los tejidos. Aunque en general se los conoce con el nombre de antibiótico, dentro de este grupo se pueden considerar dos categorías: a) Antibióticos: antimicrobianos de origen natural. b) Quimioterápicos: antimicrobianos de origen sintético.

Los antimicrobianos, a diferencia de los desinfectantes y bactericidas, poseen toxicidad selectiva; esto quiere decir que afectan poco o nada a las células del hospedador debido a las diferencias que existen entre éstas y las células microbianas. Los mecanismos de acción de los antimicrobianos son los siguientes: - Sobre la biosíntesis de la pared celular - Sobre la membrana plasmática - Sobre la biosíntesis proteica de los procariotas - Sobre la biosíntesis de los ácidos nucleicos. - Inhibidores de las vías metabólicas Se conoce como antimicrobianos de amplio espectro a aquellos capaces de actuar sobre una amplia gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como también sobre Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia, espiroquetas y actinomycetes (ej: tetraciclinas y cloranfenicol). En cambio, los antimicrobianos de espectro limitado actúan sólo sobre cocos Gram positivos y Gram negativos, bacilos Gram positivos y espiroquetas (ej: penicilina). También existen los de espectro reducido que actúan solamente contra un grupo específico de gérmenes, como lo hace la nistatina sobre Candida. TÉCNICA: ANTIBIÓTICOGRAMA Los antibióticogramas o antibiogramas son pruebas de susceptibilidad in vitro que estudian la sensibilidad de un microorganismo a la acción de los agentes antimicrobianos (ATM). l. - Determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos por el método de Dilución Consiste en una prueba cuantitativa que permite conocer la CONCENTRACIÓN. INHIBITORIA MÍNIMA (CIM) de un antimicrobiano necesaria para inhibir el desarrollo de un microorganismo y se puede realizar tanto en medio líquido como en medio sólido. La prueba en medio líquido consiste en preparar una serie de tubos con un caldo adecuado a los que se les agrega concentraciones crecientes de un determinado ATM, posteriormente se los siembra con una suspensión calibrada del microorganismo aislado a estudiar. Se incuba a 37 grados (en muestras clínicas) durante 16-24 horas, se controla la aparición de turbidez debida al desarrollo y se encuentra la CIM en el primer tubo que no presenta desarrollo microbiano. A partir de la CIM en medio líquido se puede determinar la CONCENTRACION LETAL MÍNIMA (CLM) que es aquella que no sólo inhibe el desarrollo sino que tiene un efecto letal sobre los microorganismos. Para ello se emplean los tubos que no presentaron crecimiento visible y se los subcultiva en placas con medio sin ATM y se los incuba 24 horas. La menor concentración de la droga que no origine crecimiento bacteriano en el sub cultivo se interpreta como CLM.

2

La prueba para determinar la CIM se puede hacer en medio sólido mezclando las diluciones de ATM con el medio de cultivo antes de que solidifique, ya sea en placas de petri o en tubos. La ventaja principal consiste en que se pueden ensayar al mismo tiempo varias cepas diferentes y los resultados son más reproducibles.

2-Determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión en disco (Método de la O.M.S.) Es una prueba de tipo cuantitativo por medio de la que se evalúa la capacidad de un fármaco antimicrobiano para inhibir in vivo el desarrollo de una cepa bacteriana. El método se basa en la aplicación de cantidades definidas de antibióticos en un reservorio (en este caso en discos de papel) sobre la superficie del agar usado para cultivar el microorganismo que se desea estudiar. Sobre el medio agarizado se forma por difusión un gradiente de concentración del fármaco. La sensibilidad del microorganismo se pone en evidencia por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco. Se mide así el diámetro del halo de inhibición, cuyo tamaño depende no sólo de la sensibilidad de la cepa al fármaco sino de la carga del disco, el medio de cultivo, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, tamaño y fase de crecimiento del inóculo. Variables éstas que deben se estandarizadas para obtener un resultado reproducible. 2a. - Medio de cultivo El medio de elección es el agar Mueller-Hinton debido a que presenta buena reproducibilidad de los resultados, carece de inhibidores y es adecuado para la mayoría de las bacterias patógenas. Se prepara disolviendo 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Se calienta hasta hervor y se esteriliza en autoclave (15 minutos a 1,2 atm), luego se controla que el pH esté entre 7.2 y 7.4. Posteriormente se disponen 60 a 70 mI en placas de Petri estériles. Estas placas pueden mantenerse en heladera por una semana. 2b.- Preparación del inóculo A partir del un cultivo puro se prepara una suspensión en caldo Mueller-Hinton y se incuba a 35 grados hasta alcanzar la turbidez adecuada (0.5 de la escala MC Farland). 2c.- Inoculación de las placas Las placas con agar Mueller-Hinton se siembran mediante hisopo estéril. Se introduce el hisopo dentro de la suspensión bacteriana y se lo presiona contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido y se distribuye el inóculo uniformemente sobre la superficie del agar. 2d.- Discos de ATB empleados y su aplicación en las placas. En estos ensayos se emplearán en el trabajo práctico los discos de antibióticos de la firma comercial Britania. A. - serie para estáfilococos B.- serie bacilos Gram negativos BGNl C.- serie bacilos Gram negativos BGN2 Una vez inoculadas las placas, se espera de 3 a 5 minutos y se colocan los discos sobre el agar

3

con pinza estéril aplicando una ligera presión. 2e. - Lectura e interpretación de los resultados: Luego de incubarse las placas por 24 horas, a 35°C para las enterobacterias y a temperatura ambiente para las cepas nativas, se examinan a ojo desnudo y se mide el diámetro de los halos de inhibición, cuyos resultados se interpretan con las tablas correspondientes (que se incluyen junto con las especificaciones de los discos empleados). Según el tamaño de la zona de inhibición se clasifica a los microorganismos como (Rossi, M.A., 1995): 1. sensible: cuando el microorganismo en cuestión responde a la fármacoterapia aplicada en las dosis indicadas. 2. resistente: cuando es altamente probable que el microorganismo no responda a la farmacoterapia cualquiera sea la dosis empleada. 3. sensibilidad intermedia: incluye cepas moderadamente sensibles a un antibiótico que puede aplicarse en el tratamiento en dosis más altas por ser poco tóxico o por que se concentra en el foco de infección. Consiste en una zona de transición entre cepas sensibles y resistentes. BIBLIOGRAFÍA Madigan, M. T, Martinko, G. M., Parker, J., 1998. “Brock, Biología de los Microorganismos”.8ª ed. Editorial Prentice Hall INC. Basualdo J. A., Coto C. E., de Torres R. A.; 1996. Microbiología Biomédica. Editorial Atlantis. Antimicrobianos. Microbiología Clínica. Asociación Argentina de Microbiología. Colegio de Bioq. de la Pcia. de Entre Ríos. Fac. de Bioq. y Cs. Biol. del Litoral. Módu1o4

4