Bissmillah Kimed Fix.docx

RESUME JURNAL MATA KULIAH KIMIA MEDISINAL “ENZIM PEREDUKSI GUGUS KARBONIL SEBAGAI TARGET PEMBAWA AFINITAS OBAT YANG TERIMOBILISASI”

Tugas Ini Disusun untuk Memenuhi Nilai Ujian Akhir Semester Kimia Medisinal Dosen Pengampu: Dwi Koko Pratoko, M.Sc., Apt.

Disusun Oleh: Kelompok 5 Dwi Indah Noviyanti

162210101013

Lathifatul Maulidah

162210101018

Sukma Anora Wahyunia

162210101019

Eka Cahya Kurniawan

162210101075

Monika Tri Wulandari

162210101077

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2018

Enzim Pereduksi Gugus Karbonil Sebagai Target Pembawa Afinitas Obat Yang Terimobilisasi ABSTRAK Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuktikan keserbagunaan dan kemampuan pembawa afinitas yang mengandung ligan oracin terimobilisasi secara selektif mengikat enzim penghambat karbonil. Enzim ini penting dalam jalur metabolisme senyawa endogenik dan xenobiotik. Contoh obat-obatan yang dimetabolisme oleh enzim pereduksi gugus karbonil adalah: doxorubicin, daunorubicin, haloperidol dan obat antikanker model oracin. Fungsionalitas carrier disajikan oleh enzim rekombinan murni (AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 dan CBR3) dan juga dengan dua model sampel biologis: Ekstrak sel dari Escherichia coli yang dimodifikasi secara genetik dan sitosol sel hati manusia yang belum dimurnikan. Enzim yang menunjukkan afinitas terhadap oracin secara efisien ditangkap, dielusi dengan lembut menggunakan 150 mM amonium hidroksida dan kemudian diidentifikasi oleh spektrometri massa. Metode ini sangat selektif dan kuat dan dapat diterapkan untuk pemurnian dan identifikasi berbagai enzim reduksi karbonil dari sampel biologis.

1. PENGENALAN Chemical proteomics merupakan gabungan dari ilmu kimia organik, biologi struktural, biokimia, biologi sel dan spektrometri massa. Teknik CCCP (compound-centric chemical proteomics) memungkinkan identifikasi target molekuler yang berinteraksi dengan molekul kecil yang secara kovalen terikat pada fase padat pembawa (carrier). Metode ini dapat menyerupai lingkungan in vivo untuk mengidentifikasi biomolekul yang berinteraksi dengan molekul obat yang terimobilisasi. Beberapa enzim dari kelompok protein ini memainkan peranan penting dalam metabolisme berbagai senyawa endogen (misalnya, steroid, prostaglandin) dan xenobiotik (misalnya, oracin, anthracyclines) dimana terlibat dalam berbagai proses patologis, seperti kanker yang dipengaruhi hormon dan sindrom metabolik. Dalam penelitian ini mengoptimalkan fungsi protokol pemisahan untuk isolasi enzim reduksi karbonil dan menunjukkan keserbagunaan dan selektivitas dari pembawa afinitas (afinitas carrier) oracin (obat) terimobilisasi untuk mengisolasi molekul bioaktif yang diinginkan, bahkan dari sampel biologis yang kompleks. Pendekatan ini dapat digunakan untuk memperoleh enzim-enzim pada kemurnian dan jumlah yang diperlukan, sehingga bisa dilakukan analisis spektrokopi massa secara rinci.

1

2. METODOLOGI PENELITIAN 2.1 Bahan Penelitian -Oracin

-NADP +

-Gliserol

-Akrilamida

-Bis- (3-aminopropil) amina (BAPA)

- N, N’-metilena-bis-akrilamida,

-N, N, N, N-tetramethylenediamine (TEMED)

- Albumin serum bovin (BSA)

-Garam natrium D-glukosa-6-fosfat

- Garam natrium D-glukosa-6-fosfat

-Asetonitril (HPLC grade)

-Asam trifluoroasetat (TFA)

-Glukosa-6-phos-phate dehydrogenase

-Sequipe-grade tripsin dari Promega

-1-etil-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorida (EDAC) -Garam natrium N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS) -Asam 6-Bromohexanoic dan Coomassie Brilliant Blue G-250 -Standar protein Precision Plus dibeli dari Bio-Rad Yang perlu dipreparasi: 1. 200 µl buffer A untuk sampel murni (60 mM Na-fosfat buffer, 1.1 mM EDTA, 150 mM NaCl , dan 10% (v / v) gliserol, pH 7.4) 2. Buffer B untuk sampel kompleks (60 mM Na-fosfat buffer, 1.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% (v / v) gliserol, dan 0.01% Triton X-100, pH 7.4). Ditambah Triton X-100 2.2 Cara Kerja Percoban dilakukan dengan melakukan tahapan preparasi yaitu preparasi Sampel A dibuat dengan: Melarutkan 17.6 µg enzim rekombinan murni pereduksi gugus karbonil (AKR1A1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 atau CBR3) dalam 200 µl buffer A, sampel B dibuat dengan: Mencampur 5 µg AKR1C3 dan 5 µg CBR1 dalam volume total 200 µl buffer A, Sampel C dibuat dengan: Sel E. coli yang mengekspresikan AKR1C3. Reagen ekstraksi protein dan supernatan yang diperoleh dicampur dengan buffer B. Total volume sampel yang digunakan untuk pemisahan pada pembawa afinitas adalah 200 µl dan Sampel D dibuat dengan cara: 1 mL sitosol hati manusia dipisahkan dengan kromatografi eksklusi ukuran. Kemudian dilanjutkan dengan Mengisolasi fraksi dari masingmasing sampel penelitian dengan melalukan kromatografi eksklusi pada sampel D dengan cara 1 mL sitosol hati manusia (10 mg / ml) dipekatkan dengan sentrifugasi untuk mendapatkan fraksi protein dengan ukuran kurang dari sama dengan 37 kDa. Dengan kondisi analisis sebagai berikut : 1. Kolom / fase diam: Superdex G 75/200 GL 2. Eluen / fase gerak: buffer

2

3. Laju aliran fase gerak: 0,5 ml / menit Untuk sampel A dan sampel B: Dilakukan kromatografi afinitas adalah protokol untuk enzim pereduksi gugus karbonil yang telah dimodifikasi dalam hal komposisi buffer dan kondisi elution (lihat Tabel 1).

Kemudian dilakukan pemisahan afinitas sampel biologis yaitu dengan perlakuan pada sampel C: Dalam pemisahan afinitas sampel biologis kompleks, pembawa afinitas sebanyak 1 mg untuk pemisahan supernatan dari E. coli yang dimodifikasi secara genetik diinkubasi dalam buffer pemblokir/ BSA selama 30 menit. Setelah adsorpsi BSA, pembawa dicuci dengan buffer B, dan sampel C kemudian dimuat pada carrier, sampel D: Untuk pemisahan afinitas sampel biologis kompleks afinitas pembawa sebanyak 12 mg untuk fraksi sitosol hati manusia diinkubasi dalam buffer pemblokir/ BSA selama 30 menit, pembawa dicuci dengan buffer B, dan sampel D kemudian dimuat pada carrier, untuk sampel A dan B: Protokol pemisahan menggunakan pembawa afinitas oracin dilakukan dengan cara 1 mg pembawa afinitas dan sampel diinkubasi di bawah pencampuran lembut pada rotator enzim yang tidak terikat akan dihilangkan. Kemudian dicuci dengan buffer A. Selanjutnya, sampel A atau B dimuat pada kesetimbangan pembawa afinitas. Proses pemisahan dilakukan pada 8° C. Semua fraksi yang diperoleh selama isolasi dianalisis oleh SDS-PAGE, dan aktivitas enzim terhadap oracin diukur. Sampel dicampur dengan 5x buffer sampel terkonsentrasi (250 mMTris-HCl, 10% (w / v) SDS, 30% (w / v) gliserol, 0.02% (b / v) bromofenol biru, dan 5% (b / v) 2 mercaptoethanol) pada rasio 4: 1 (v / v) dan direbus pada 95°C selama 3 menit. Semua gel diwarnai dengan metode pewarnaan Coomassie Brilliant Blue G-250 koloid. Gel Molekuler Imager Doc XR digunakan untuk mengevaluasi gel bernoda. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas metabolik dari enzim yang diuji dan fraksi dikumpulkan ditentukan oleh inkubasi dengan oracin selama 60 menit (30 menit dalam kasus AKR1C3 dan CBR1) pada 37°C. Campuran inkubasi dalam microtubes Eppendorf dengan total voume 100 µl dan berisi 50 µl (10 µl dalam kasus AKR1C3 dan CBR1) dari fraksi enzim, 10 µl oracin (konsentrasi akhir 0.5 mM), 20 µl dari sistem generasi NADPH dan

3

jumlah yang diperlukan dari 100 mM Na-fosfat buffer (pH 7.4). Terjadi reaksi hingga menghasilkan metabolit 11-dihydrooracin (DHO) diekstraksi dengan 1 ml etil asetat. Dan dilakukan sentrifugasi hingga menghasilkan fase organik yang dipindahkan ke microtubes Eppendorf baru dan diuapkan di bawah vakum sampai kering. Sampel kering dilarutkan dalam 100 µl fase gerak dan dianalisis melalui UHPLC. Penentuan metabolit dengan UHPLC 241 tergantung pada Jumlah Total DHO setelah konversi enzimatik terdeteksi

pada sistem kromatografi infinity UHPLC Agilent 1290

dengan detektor fluoresens. Metode yang telah dimodifikasi untuk sistem HPLC dengan kolom Zorbax Eclipse Plus, kolom Rapid Resolution HD C18 (2.1 mm x 50 mm, 1,8 µm). Fase gerak terdiri dari 10 mm hexanesulphonate dengan 0,04 mm trietilamina (pH 3,27). Aktivitas enzim dinyatakan sebagai ng (Nanogram) dari DHO yang dibentuk per 60 menit per fraksi. Preparasi

dilanjutkan

dengan

persiapan sampel untuk

spektroskopi

massa

menggunakan analisis dengan pita dari SDS-poliakrilamid gel elektroforesis yang dipotong dan dilemahkan dengan 25 mM NH4HCO3 40% acetonitrile pada 30 0C. Kemudian ikatan disulfida berkurang dengan penambahan 100 µl dari 10 mM DTT di 25 mM NH4HCO3 dan inkubasi

selama 45

menit

pada

suhu

57

0

C. Residu

sistein

berkurang

yang

kemudian carbamidomethylated oleh 100 µl dari 55 mm Iodoacetamide untuk 20 menit dalam keadaan gelap.Kemudian protein dipecah dengan 50 µl tripsin (konsentrasi akhir dari 4 ng / µl) di 25 mm NH4HCO3 semalam pada 37

0

C. Peptida yang dihasilkan

diekstraksi. Kemudian di keringkan menggunakan vakum, dilarutkan dalam 0.1% TFA di 5% asetonitril dan dihilangkan garamnya dengan Empore ™ C18-SD SPE Cartridge. Kemudian dilarutkan kembali dalam 25 µl 0.1% TFA di 5% ACN untuk analisis spektroskopi massa. Dan yang terakhir adalah analisis hasil spektroskopi massa dan identifikasi protein dengan MALDI-TOF. Masing-masing lima mikroliter sampel dicampur pada rasio 1: 1 (v / v) dengan asam siano hydroxycinnamic pada konsentrasi 271 dari 5 mg / di 50% ACN dan 0,1% TFA. Campuran ini (0,8 µl) tiga kali replikasi pada sampel piring MALDI. Kemudian spektrum

dicatat pada AB 4800 MALDI-TOF /

TOF massa

spectrometer.MS

Spektrum diperoleh diberbagai massa antara 700-4000 m / z menggunakan 2000 laser tembakan per spektrum. Protein yang diidentifikasi menggunakan ProteinPilot 2.0.1 software dengan Paragon mencari algoritma. Karena algoritma hanya menggunakan urutan peptida yang unik untuk identifikasi protein, spektrum dari sampel rangkap tiga di cari bersamaan. Spektrum digeledah terhadap UniProt basis data manusia dan terhadap UniProt E. coli sebagai basis data.

4

3. HASIL DAN DISKUSI Prinsip dasar kromatografi afinitas didasarkan pada pengenalan molekul yang spesifik dimana dapat diterapkan secara efektif untuk mengisolasi dan atau memurnikan hampir semua sasaran analit / biomolekul, melalui aktifitas yang tepat antara ligan (baik dengan berat molekul rendah atau tinggi). Bagian integral dari pengembangan operator bioaffinitas yaitu verifikasi spesifisitas, fleksibilitas, serta fungsi dan parameterisasi kapasitas pengikatan, reproduktifitas, operasi dan stabilitas penyimpanan. Tanpa penentuan parameter-parameter ini, implementasi dari apa pun yang dikembangkan pada afinitas pembawa ke skema pemurnian protein target dari matriks biologis yang kompleks mungkin tidak berhasil. 3.1 Optimasi Kondisi Pemisahan Pembawa afinitas ditunjukkan dengan menangkap model enzim reduksi karbonil AKR1C3 dan CBR1. Namun, hasil dari AKR1C3 murni hanya 46% (E1+E2) (Gambar. 1A), dan aktivitas enzimatik yang ditangkap berkurang. Kemampuan dari 1.1 mm EDTA dalam melindungi enzim dari efek berbahaya dari ion besi pun diuji. EDTA pada konsentrasi 1-5 mM adalah agen pengkelat yang umum digunakan untuk menghindari adanya oksidasi yang disebabkan logam, yang membantu menjaga protein dalam keadaan berkurang.

Penambahan 1.1 mM EDTA untuk buffer secara signifikan meningkatkan penangkapan enzim AKR1C3 pada pembawa afinitas, seperti ditunjukkan pada (Gambar. 1B). Konsentrasi protein dalam fraksi enzim terikat (UE) menurun menjadi 7% (dibandingkan dengan 41% pada pemisahan tidak dioptimalkan (Gambar. 1A)). Hasil total protein AKR1C3 di semua fraksi elusi meningkat dari 46% menjadi 81% (E1+E2+E3+E4) (Gambar. 1B). (Gambar. 1C) menunjukkan bahwa penambahan EDTA dan perpanjangan waktu elusi meningkatkan hasil protein AKR1C3 dalam fraksi E1 dari 37% menjadi 79%. Selain itu, aktivitas enzim dari AKR1C3 terhadap oracin yang ditangkap di fraksi E1 meningkat empat kali lipat dibandingkan dengan hasil yang dijelaskan oleh Škarydova.

5

Matriks padat yang digunakan dalam pembawa afinitas pada penelitian ini memiliki kelemahan, seperti terjadi interaksi non-spesifik yang disebabkan oleh serapan protein pada permukaan sehingga dilakukan optimalisasi pemurnian untuk mengurangi interaksi nonspesifik dengan menggunakan 1% BSA dan 0,01% detergen non-ionik Triton X-100. Dua sampel sitosol hati manusia (1 ml pada konsentrasi akhir 5 mg / ml) dipisahkan oleh pembawa afinitas dengan ada dan tidak adanya penambahan 1% BSA dengan 0,01% Triton X-100 (Gambar 2), yang dimana terdapat penurunan jumlah protein yang ditangkap nonspesifik dalam fraksi elusi (terutama di area 37 kDa).

3.2 Demonstrasi fleksibilitas pembawa untuk enzim reduksi karbonil Sembilan enzim reduksi karbonil yang termasuk dalam superfamili aldo-keto reduktase (AKR) dan dehidrogenase rantai pendek / reduktase (SDR) (AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 dan CBR3) digunakan untuk memverifikasi fleksibilitas pembawa pada kondisi optimal. Dimana enzim-enzim tersebut (kecuali AKR1A1 dan AKR1B1), berpartisipasi dalam konversi metabolik oracin menjadi 11-dihydrooracin (DHO), sehingga pembawa afinitas ini diharapkan dapat mengisolasi enzim-enzim ini. Pada inkubasi enzim AKR1A1 dan AKR1B1 dengan oracin, enzim tersebut tidak dapat memetabolisme oracin menjadi bentuk tereduksi dan kebanyakan dideteksi hanya dalam fraksi pengikatan dan pencucian. Semua enzim dengan aktivitas metabolik terhadap oracin secara efisien ditangkap oleh pembawa afinitas dan dielusi dalam bentuk aktifnya. (Gambar3). Selain itu, kecenderungan antara afinitas (nilai km) dan efisiensi isolasi enzim dapat diikuti. Enzim dengan nilai km terendah (AKR1C1-4 dengan km = 90-160 lM) ditangkap dan dielusi dengan hasil tertinggi (69-79%), sedangkan enzim dengan km lebih tinggi (CBR3 km = sekitar 200 lM, AKR1B10 km = 290 lM dan CBR1 km> 300 lM) ditangkap dengan penurunan efisiensi (65%, 43% dan 8%, masing-masing), yang sesuai dengan nilai km mereka . Hasil ini menunjukkan bahwa pembawa afinitas yang disajikan

6

dapat berfungsi sebagai alat universal untuk pemurnian enzim yang mereduksi senyawa karbonil oracin.

Kemampuan protein target untuk mengikat pembawa afinitas pada rasio afinitas mereka terhadap oracin juga perlu diverifikasi dan dinilai apakah afinitas pengikatan adalah hasil dari kandungan molar enzim dalam sampel asli, terlepas dari nilai km. Dua enzim dengan berat molekul beragam (AKR1C3 (36,8 kDa) dan CBR1 (30,4 kDa)) dipilih untuk eksperimen ini karena evaluasi sederhana mereka melalui elektroforesis SDS-PAGE. Semua anggota superfamili AKR berbagi berat molekul yang sama sehingga tidak mudah diidentifikasi oleh metode SDS-PAGE yang umum digunakan dalam satu fraksi protein. Percobaan yang dilakukan membuktikan bahwa pembawa afinitas dapat menangkap kedua enzim reduksi karbonil terlepas dari beragam afinitas (AKR1C3 km = 110 lM, CBR1 km> 300 lM) enzim target ini ke ligan (Gambar 4). Efisiensi penangkapan CBR1 meningkat di hadapan AKR1C3, dimana hal ini bertentangan dengan hasil sebelumnya. Penentuan mekanisme yang tepat dari interaksi antara enzim kompetitif dan ligan di bawah kondisi pemisahan akan membutuhkan eksperimen yang lebih menuntut.

Berdasarkan penggunaan hilir pembawa afinitas untuk isolasi dan pemurnian enzim reduksi karbonil yang merupakan protein minor dalam sampel biologi kompleks, kemampuan pembawa untuk menangkap enzim yang diinginkan dari campuran yang rumit ini merupakan prasyarat yang signifikan. Ekstrak sel dari E. coli yang dimodifikasi secara genetik yang

7

mengekspresi berlebihan enzim AKR1C3 digunakan untuk verifikasi ini. Semua fraksi terelusi dianalisis oleh SDS – PAGE (Gambar 5).

Hampir semua molekul yang ditangkap secara spesifik dielusi dalam fraksi pertama, yang ditandai E1. Protein sekitar 37 kDa dipotong dari gel, diekstraksi dan diidentifikasi oleh MS sebagai AKR1C3 dengan sedikit ompF dari E. coli. OmpF bertindak sebagai transporter transmembran molekul kecil (misalnya, antibiotik) untuk melintasi membran luar. Obat antikanker oracin mungkin menjadi target molekuler untuk transporter ini, tetapi ompF lebih cenderung berinteraksi secara tidak spesifik dengan pembawa afinitas. EF-Tu1 dan EF-Tu2 juga diidentifikasi dalam fraksi E1 (Tabel 2). Molekul-molekul ini dapat ditargetkan menuju oracin atau diserap secara spontan ke material pembawa murni.

Perbandingan fraksi E1 yang dikumpulkan dari pemisahan pembawa afinitas dengan oracin dan dari pemisahan pembawa tanpa oracin (Gambar 6) dengan jelas menunjukkan bahwa protein dengan ukuran ~45 kDa menyerap ke permukaan mikropartikel magnetik secara tidak spesifik. Spektroskopi Massa mengidentifikasi pita cahaya (~37 kDa) yang terdeteksi dalam pemisahan menggunakan mikropartikel tanpa oracin tak bergerak sebagai ompF dari E. coli. Hasil ini secara positif menunjukkan bahwa ompF tidak spesifik mengikat

8

pada pembawa, sedangkan enzim pengurang karbonil hanya ditangkap oleh interaksi spesifik dengan oracin.

Dalam penelitian ini, sitosol sel hati manusia pertamakali dipisahkan oleh kromatografi eksklusi dapat menghasilkan protein dengan ukuran ≤37 kDa, dan mampu mengurangi kemungkinan interaksi non-spesifik selama isolasi. Semua fraksi yang diperoleh dari pemisahan afinitas dianalisis oleh SDS-PAGE (Gambar. 7). Tiga pita protein utama diamati dalam elusi fraksi E1. Pita protein di area ~37 kDa (1) mewakili campuran AKR1C4, (N (G), N (G) -dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 (DDAH-1) dan ester hidrolase C11orf54. Pita protein 2 dan 3 (~ 40 kDa) diidentifikasi sebagai subunit alkohol dehidrogenase 1 (ADH1) dan 4 (ADH4).

Tiga pita protein utama (1-3) dengan massa yang sesuai dengan enzim penghasil karbonil (30–40 kDa) dianalisis oleh spektroskopi massa (Tabel 3). Protein dalam pita 1

9

diidentifikasi sebagai campuran dari enzim reduksi karbonil AKR1C4 (memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan pembawa afinitas) dan dua hidrolase. Namun belum ada penjelasan tentang interaksi antara hidrolase dengan obat antikanker oracin. Jenis interaksi enzim ini dengan pembawa afinitas mungkin menjadi objek penelitian lebih lanjut. Isolasi AKR1C4 yang berhasil dalam penelitian ini memberikan bukti yang jelas tentang kemanjuran pembawa afinitas dengan oracin terimobilisasi. Sedangkan pita 2 dan 3 diidentifikasi sebagai subunit dari enzim alkohol dehidrogenase 1 (ADH1A, B, C) dan alkohol dehidrogenase 4 (ADH4). ADH mengkatalisis NAD + -dependent oksidasi alkohol menjadi aldehida dan keton yang sesuai. Dengan demikian, mereka dapat secara khusus berinteraksi dengan bagian karbonil atau hidroksil dari molekul oracin. Karena protein ini sangat melimpah di hati manusia, keberadaan mereka dalam fraksi elusi dapat diasumsikan mempengaruhi serapan non spesifik yang ringan.

4.

KESIMPULAN Pembawa afinitas yang mengandung oracin, obat antikanker terimobilisasi terbukti

menjadi alat yang efisien dan universal untuk isolasi enzim reduksi karbonil dengan spektrum yang luas, bahkan dari sampel biologis yang sangat kompleks. Selain itu, selektivitas pembawa terbukti mampu memurnikan enzim AKR1C3 dari supernatan E. coli lengkap dan enzim AKR1C4 dari sitosol hati manusia. Untuk mengisolasi semua enzim reduksi karbonil atau protein target oracin dari sitosol, tingkat serapan non-spesifik dan tingkat kontaminasi protein yang dihasilkan perlu dikurangi melalui penambahan pra-pemurnian langkah klasik (misalnya, pengecualian ukuran kromatografi). Percobaan ini membuktikan bahwa pembawa afinitas magnetik yang terikat oracin cocok untuk pemisahan enzim pereduksi karbonil.

10