Biorremediacion Final Tablas Nuevas.docx

EVALUACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

DEVIT ROJAS 1610865 AURA MOLANO 0580338 ELEINE CARRILLO 1618630 YESENIA MORA 1610978 JORGE FLORIAN 1610075

DOCENTE ROMINA FUENTES

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE INGENIERIA BIOTECNOLOGICA 2017

PROYECTO FINAL DE TRATAMIENTO Y BIORREMEDIACIÓN ELECTIVA III

EVALUACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

DEVIT ROJAS 1610865 AURA MOLANO 0580338 ELEINE CARRILLO 1618630 YESSENIA MORA 1610978 JORGE FLORIAN 1610075

DOCENTE ROMINA FUENTES

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE INGENIERIA BIOTECNOLOGICA 2017

RESUMEN Los problemas de contaminación en suelos se deben principalmente a acciones antropogénicas; entre las que cabe destacar la extracción de recursos naturales, en este caso en particular de hidrocarburos. El impacto ambiental que se genera en Colombia debido a esta situación incluye la contaminación de fuentes hídricas, fauna y flora deteriorada o cambios drásticos en el ecosistema. En el trabajo de investigación realizado durante el semestre, tratamos un suelo franco arenoso contaminado por hidrocarburo, como sabemos los derrames de hidrocarburos de petróleo son una de las principales fuentes de contaminación de suelos, ya que ocasionan perturbaciones en los ecosistemas al afectar su estructura. Para esta investigación se utilizaron cinco (5) composteros, compuestos por canastas de aluminio, estos estaban conformados por los suelos contaminados, a estos se les regaba día de por medio con agua destilada, de una muestra inicial se realizan pruebas de toxicidad, hidrofobicidad, análisis microbiológico y TPH. El objetivo del presente informe es elaborar una síntesis con información sobre la contaminación de suelos por hidrocarburos y evaluar la fitorremediación como estrategia biotecnológica para una posible recuperación de este suelo.

SUMMARY Pollution problems in soils are mainly due to anthropogenic actions; among which we can highlight the extraction of natural resources, in this particular case of hydrocarbons. The environmental impact that is generated in Colombia due to this situation includes the contamination of water sources, deteriorated fauna and flora or drastic changes in the ecosystem. In the research work carried out during the semester, we treated a sandy loam soil polluted by hydrocarbons, as we know the spills of petroleum hydrocarbons are one of the main sources of soil contamination, since they cause disturbances in the ecosystems by affecting their structure. For this research, five (5) composters were used, consisting of aluminum baskets, these were made up of contaminated soils, they were irrigated every other day with distilled water, from an initial sample toxicity, hydrophobicity, microbiological analysis and TPH. The objective of this report is to prepare a synthesis with information on the contamination of soils by hydrocarbons and to evaluate phytoremediation as a biotechnological strategy for a possible recovery of this soil.

INTRODUCCIÓN

La biodegradación es el proceso natural por el cual los microorganismos degradan o alteran moléculas orgánicas transformándolas en moléculas más pequeñas y no tóxicas. Sin embargo, este proceso es muy lento y puede acelerarse introduciendo determinadas bacterias o plantas en los ambientes contaminados. Esta intervención se denomina “biorremediación” o “biocorrección” y se define como el empleo de organismos vivos para eliminar o neutralizar contaminantes del suelo o del agua. En los procesos de biorremediación generalmente se emplean mezclas de microorganismos, aunque algunos se basan en la introducción de cepas definidas de bacterias u hongos. Actualmente se están desarrollando microorganismos, algas (especialmente cianobacterias o algas azules) y plantas genéticamente modificadas para ser empleadas en biorremediación.

OBJETIVO GENERAL  Determinar el efecto de la bioestimulación en un suelo franco arenoso contaminado con hidrocarburos. OBJETIVOS ESPECIFICOS  Estandarizar los diferentes protocolos para reducir la contaminación de un suelo con hidrocarburos.  Evaluar la presencia de los hidrocarburos totales de petróleo (TPH) y sus efectos sobre propiedades del suelo franco arenoso.  Determinar el grado de toxicidad de a muestra de suelo.

MARCO TEORICO El suelo, como resultado de la interacción de la atmósfera, litosfera, hidrosfera y biosfera, tiende en cada circunstancia a alcanzar un equilibrio natural, que sólo se ve modificado cuando uno de estos sistemas varía. Pero es la intervención del hombre, un componente singular de la biosfera, lo que de forma más violenta puede modificar un suelo y degradarlo. Por tanto, la degradación de un suelo, o modificación que produce un deterioro, es consecuencia directa de la utilización en cualquiera de sus vertientes (agrícola, forestal, ganadera, industrial, transporte, etc.) Un tipo especial de degradación es la producida por la presencia de sustancias químicas nocivas y en este caso se la denomina contaminación. Un contaminante es un elemento o compuesto químico situado fuera de lugar, o presente en concentraciones mayores de las normales que en general tiene un efecto adverso sobre algún organismo. Se deben distinguir los 1. Introducción y Objetivos 3 contaminantes de origen natural (los gases nocivos emitidos por un volcán a la atmósfera) de los antropogénicos (. metales pesados en un suelo procedentes de la actividad minera). Los conceptos de contaminación y de contaminante deben ser acordados por quienes los utilizan y pueden variar de una a otra persona según sus intereses. Así, el uso de insecticidas puede ser aceptable para unos si sólo ejercieran el efecto para el que se suministran al suelo y no se movilizaran por debajo de las raíces de los cultivos, o se dispersaran por la superficie, porque entonces podrían considerarse contaminantes, al encontrarse en otros lugares no apropiados y en concentraciones suficientemente altas como para causar daños a organismos; sin embargo, para otros ningún insecticida debe usarse porque todos son contaminantes. El suelo está compuesto por minerales, materia orgánica, diminutos organismos vegetales y animales, aire y agua. Es una capa delgada que se ha formado muy lentamente, a través de los siglos, con la desintegración de las rocas superficiales por la acción del agua, los cambios de temperatura y el viento. Las plantas y animales que crecen y mueren dentro y sobre el suelo son descompuestos por los microorganismos, transformados en materia orgánica y mezclados con el suelo. Los hidrocarburos son compuestos de gran abundancia en la naturaleza integrados por átomos de carbono e hidrógeno. Éstos se clasifican según la estructura de los enlaces existentes entre los átomos de carbono que componen la molécula. Los hidrocarburos estipulan una actividad económica de primera importancia a nivel mundial ya que son los principales combustibles fósiles, además sirven de materia prima para todo tipo de plásticos, ceras y lubricantes. Pero son estas formas de elevado valor económico (petróleo y derivados) las responsables de graves problemas de contaminación en el medio natural.

METODOLOGÍA Para la realización del proyecto de grupo, se menciona a continuación las condiciones de trabajo: En la figura 1 y en la tabla 1 se presenta un diagrama general y las condiciones de proceso para llevar a cabo la Biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos empleando la técnica de bioestimulación.

Suelo Secado y tamizado

Determinación -Textura -Capacidad de campo

Preparación de microcosmos

C 1

C 2

T 1

T 2

T 3

T 4

Evaluación proceso de Biorremediación

%TPH

Hidrofobicidad

Heterótrofos totales

Toxicidad

Figura 1. Diagrama general para la evaluación de un proceso Biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos.



GRUPO DE TRABAJO Suelo franco-arenoso + crudo al 7% TPH, sin materia organica



Composteros (5)



Suelo franco-arenoso + crudo al 7% TPH * 3 replicas



Control (2) * 2 replicas Tabla 1. Información del suelo y composteros del grupo de trabajo.

      

CONDICIONES DE PROCESO C/N = 60 C/P = 800 sin materia orgánica Aireación= 1.5 días. Humedad 60 % Capacidad de campo 90 días de proceso Peso total/microcosmo= 500 gramos

Tabla 2. Condiciones de proceso para la Biorremediación de un suelo contaminado con hidrocarburos. PREPARACIÓN DE LOS MICROCOSMOS Los suelos deben ser pasados a través de un tamiz de poro de 2mm de diámetro, seguidamente contaminados con crudo a una concentración final de 7% (p/p) y mezclados con materia orgánica con el fin de evaluar su efecto en el proceso de biorremediación. De esta forma se constituyen 4 tratamientos correspondientes a T 1, T2, T3 y T4 con 2 controles correspondientes a C1 y C2, tal como se observa en la tabla 2.

TRATAMIENTO

COMPOSICIÓN

C1

Suelo arcilloso

T1

Suelo arcilloso + 7% crudo

T2 C2

Suelo arcilloso + 7% crudo + 10% materia orgánica Suelo franco-arenoso

T3

Suelo franco-arenoso + 7% crudo sin M.O

T4

Suelo franco-arenoso + 7% crudo + 10% materia orgánica Tabla 3. Composición de Tratamientos y controles.

La estabilización del crudo se hizo durante 2 días a temperatura ambiente con el fin de eliminar los componentes volátiles del mismo y así evitar incluir en el análisis las pérdidas inherentes a volatilización. BASE DE CÁLCULO  500g/ Compostero  

Urea = 46%N2 Pureza Sulfato de amonio = 46% Pureza asimilable

Evaluación del proceso Las variables seleccionadas para la evaluación del proceso de Biorremediación y los tiempos de toma de muestra se presentan en la tabla 4. Las muestras deben ser tomadas totalmente al azar con 3 repeticiones por cada extracción.

VARIABLE *TPH

Tiempo de evaluación t0, t1,5, t3

Hidrofobicidad

t0, t1,5, t3

Análisis microbiológico Toxicidad

t0, t1,5, t3 t0, t3

Tabla 4. Variables en evaluación.

EVALUACIÓN DE TOXICIDAD EMPLEANDO SEMILLAS DE Latica sativa (Tarache et al., 2010).

COMPOSTERO

Evaluar la germinación y el efecto del crudo sobre las plántulas.

Tomar las medidas del crecimiento con ayuda de una hoja milimetrada. Apuntar resultados.

Pesar 100g para realizar el análisis de la prueba.

Se incuban en cámara oscura por 5 días.

Se utilizan 5g de muestra incluyendo el control negativo. (Replicas*3).

Se colocan 20 semillas de lechuga.

Se colocan en una caja de Petri.

Se añaden 10ml de H2O destilada.

Finalizado el periodo de incubación, cuantificar el número de semillas germinadas y medir longitud de los hipocótilos de las mismas. Para ello, tomar cada una de las plántulas de la cápsula y estirar el hipocótilo sobre un papel milimetrado.

Parámetro

Condición

Tipo de ensayo Temperatura Calidad de luz Cantidad de muestra Agua de dilución Semillas por réplica Número de réplicas Tiempo de incubación Aceptabilidad de los resultados

Estático 22± 2 °C Oscuridad 5 gramos Agua mineral 20 3 120 h Germinación control negativo (>90%)

Tabla 5. Condiciones de proceso para la evaluación de toxicidad de hidrocarburos en suelos Empleando Lactuca sativa. Evaluación de índice de germinación (Celis et al., 2006) El índice de germinación (IG) posee la ventaja de permitir la evaluación de la toxicidad baja (que afecta el crecimiento del hipocótilo) y la toxicidad pesada que afecta la germinación), a través de la expresión:

Donde IG es el índice de germinación (%), G es el promedio de las semillas germinadas en la muestra, Gc es el promedio de las semillas germinadas en el control negativo, L es el promedio de longitud del hipocótilo en la muestra (mm), y Lc es el promedio de longitud del hipocótilo en el control negativo (mm). Se considera como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.

Figura 3. Esquema de plántulas de Lactuca sativa al finalizar el período de exposición

HIDROFOBICIDAD

Se toman 10g de suelo por cada muestra. (3 réplicas)

Se colocan en una caja de Petri

Se añade una gota y se contabiliza el tiempo que demora en absorberse

El procedimiento se realiza 5 veces en cada caja. (5 gotas)

T(s) Nivel de persistencia de repelencia al agua <5 No repelente al agua 5-10 Ligeramente repelente 60-600 Fuertemente repelente 600-3600 Severamente repelente >3600 Extremadamente repelente Tabla 6: Grado de Repelencia de los Suelos Según los Tiempos Requeridos para la Determinación WDPT PRUEBA DE TPH (EVALUACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS TOTALES DE PÉTROLEO

Muestra teorica

Crudo=0,844 Suelo=10,479

Método de extracción: Soxhlet

Solvente Ciclohexano acetona

PRUEBA DE TEXTURA La textura del suelo constituye una propiedad física muy importante para la ecología de los microorganismos, ya que determina el área de superficie disponible como hábitat para el crecimiento de los microorganismos. La textura del suelo es establecida por la distribución de tamaño de las partículas individuales de suelos, teniendo en cuenta la influencia del tamaño de estas partículas sobre las propiedades físicas, biológicas y químicas del suelo, que se han clasificado por medio del análisis granulométrico.

Figura 4. Triangulo de texturas

1.

Secar la muestra a analizar ( 105ºc/ noche ) pesar 50gr de muestra adicionar 30 ml de oxalato de sodio , mezclar por 15 minutos. Se transfirió a probeta de 1 ml , y se aforó a 1ml con agua destilada

2.

Mezclar tres veces por inmersión , esperar 40s y tomar 25ml d muestra a 10cm de profundidad , se dejó 2h en reposo, se tomó 25ml de muestra de la fase superior. Se secó la muestra a 105ºc

3.

Se calculó el peso seco de la muestra ,se calculó el porcentaje de limo y arena. Se determinó el tipo de suelo de acuerdo al triangulo de textura.

PRUEBA DE HETEROTROFOS TOTALES El método de recuento en placa es muy utilizado para la enumeración de microorganismos viables, especialmente para bacterias y hongos. Las técnicas de recuento en placa se emplean con mayor frecuencia el agar como agente solidificante ya que la mayoría de bacterias carecen de las enzimas necesarias para despolimerizarlo.

5gr de suelo

45ml de s/s (0,85%)

160 rpm / 5"

tomar muestra sobrenadante

diluciones

ANALISIS Suelo Suelo no MICROBIOLOGICO contaminado contaminado

Se toman 5g de suelo

Realizar diluciones 10-6, 10-7, 10-8

Servir 0,10ml en las cajas de petri con agar LB

Se realiza dilucion en solucion salina 0,85g

Tomar muestra del sobrenadante

Con el asa de hockey expandir, sellar, envolver. Preservar por una semana

Se agita en shaker 15minutos a 160rpm

Dejar reposar por 5 minutos

Leer las cajas y reportar resultados

RESULTADOS

Determinación de % TPH (porcentaje de hidrocarburos del petróleo presentes en la muestra) 

Prueba de TPH (En esta prueba se evaluaba el porcentaje de hidrocarburos del petróleo presentes en la muestra de suelo a evaluar, se realizaron 3 evaluaciones.)



C1: Suelo Franco Arcilloso NO contaminado



C2: Suelo Franco Arenoso NO contaminado



T1: S. F. Arcilloso + Crudo 7%.



T2: S. F. Arcilloso + Crudo 7% + Materia orgánica.



T3: S. F. Arenoso + Crudo 7%.



T4: S. F. Arenoso + Crudo 7% + M.O.

 Tiempo Cero

Tabla 7: Prueba de Múltiples Rangos para la Determinación de %TPH. Tiempo Cero

Gráfica 1: Tratamiento vs % TPH. Tiempo Cero

 Tiempo 1.5

Tabla 8. Prueba de Múltiples Rangos para la Determinación de %TPH. Tiempo 1.5

Gráfica 1. Tratamiento vs % TPH. Tiempo 1.5

 Tiempo 3

Tabla 9. Prueba de Múltiples Rangos para la Determinación de %TPH. Tiempo 3

Gráfica 2 Tratamiento vs % TPH. Tiempo 3

MULTIFACTORIAL TEXTURA 0 - 1,5 - 3 Tiempo 0

-

Tiempo 1,5

Variable dependiente: Biorremediación 1,5.TPH Factores: Biorremediación 1,5.Textura Biorremediación 1,5.MO Biorremediación 1,5.Crudo

Tiempo 3

EVALUACIÓN DE HIDROFOBICIDAD  Tiempo Cero

Tabla 10 Prueba de Múltiples Rangos para la Evaluación de Hidrofobicidad. Tiempo Cero

Gráfica 3: Tratamiento vs Grado de Repelencia de los Suelos. Tiempo Cero

 Tiempo 1.5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL TEXTURA 0 – 1,5 – 3 -

Tiempo cero

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación.Hidrofobicidad

2,03 1,83 1,63 1,43 1,23 1,03 0,83 Arcilloso

Franco arenoso

Biorremediación.Textura

-

Tiempo 1,5

Medias y 95,0% de Fisher LSD Biorremediación 1,5.Hidrofobicidad

1,01 0,91 0,81 0,71 0,61 0,51 0,41 Arcilloso

Franco arenoso

Biorremediación 1,5.Textura

-

Tiempo 3

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación 3.Hidrofobicidad

1,01 0,91 0,81 0,71 0,61 0,51 0,41 Arcilloso

Franco arenoso

Biorremediación 3.Textura

MULTIFACTORIAL M.O. 0 – 1,5 – 3 -

Tiempo cero

Medias y 95,0% de Fisher LSD Biorremediación.Hidrofobicidad

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Con

Sin Biorremediación.MO

-

Tiempo 1,5

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación 1,5.Hidrofobicidad

1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0 Con

Sin

Biorremediación 1,5.MO

-

Tiempo 3

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación 3.Hidrofobicidad

1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0 Con

Sin Biorremediación.MO

MULTIFACTORIAL CON CRUDO 0 – 1,5 – 3 -

Tiempo cero

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación.Hidrofobicidad

2 1,6 1,2 0,8 0,4 0 Con

Sin

Biorremediación.Crudo

-

Tiempo 1.5

Biorremediación 1,5.Hidrofobicidad

Medias y 95,0% de Fisher LSD 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Con

Sin

Biorremediación 1,5.Crudo

-

Tiempo 3

Biorremediación 3.Hidrofobicidad

Medias y 95,0% de Fisher LSD 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Con

Sin

Biorremediación 3.Crudo

RESULTADOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO  Tiempo Cero

Tabla 13. Prueba de Múltiples Rangos. Análisis Microbiológicos. Tiempo Cero.

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL TEXTURA 0 – 1,5 – 3

-

Tiempo cero

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL CON M.O. 0 – 1,5 – 3 -

Tiempo cero

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL CON CRUDO 0 – 1,5 – 3 -

Tiempo cero

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

RESULTADOS DE TOXICIDAD

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL TEXTURA. 1,5 – 3 -

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL MO 1,5 – 3

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

MULTIFACTORIAL CON CRUDO 1,5 – 3

-

Tiempo 1,5

-

Tiempo 3

Medias y 95,0% de Fisher LSD

Biorremediación 3.Toxicidad

135 115 95 75 55 35 Con

Sin

Biorremediación 3.Crudo

CONCLUSIONES

ANEXOS