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Debido a la gran diversidad de proteínas extracelulares producidas por las dos especies, no se pudo establecer una relación firme entre la presencia o la ausencia de una banda particular en la SDS-PAGE y las masas moleculares publicadas de los polipéptidos antigénicos secretados. El uso de los anticuerpos monoclonales disponibles dirigidos contra las enzimas purificadas confirmaron la presencia de alanina deshidrogenasa de 40 kDa en el filtrado de cultivo de M. tuberculosis H37Rv , pero este enfoque proporciona poca información sobre la actividad enzimática. Los intentos de revelar las actividades en geles se vieron obstaculizados por la desnaturalización irreversible de las enzimas en SDS-PAGE y la gran dificultad de adaptar la mayoría de las pruebas utilizadas para la detección de gel, en particular las basadas en la medición cinética de los sustratos. En consecuencia, las diez actividades enzimáticas presentes en el fluido de cultivo del bacilo tuberculoso y ausentes de las de la especie saprófita M. srnegmatis se cuantificaron utilizando métodos convencionales.

La Tabla 3 demuestra que una parte significativa de las actividades enzimáticas se encontró en el filtrado de cultivo. Dependiendo de la enzima, el porcentaje de la actividad enzimática total encontrada en el fluido de cultivo varió de 17 a 92 '30. Informaron que el 30% de la glutamina sintetasa de M. tuberculosis Se encontró H37Rv en el filtrado de cultivo, mientras que la porción extracelular de esta enzima se estimó en el presente estudio como el 17% de la actividad bacteriana total de La misma cepa crecida en el mismo medio de cultivo. Las diferentes actividades fueron entre cuatro y 134 veces más concentrado en el líquido extracelular que en el interior de las células. Curiosamente, el fraccionamiento del extracto celular para producir un gránulo de 2OOOOg que consiste principalmente en fragmentos de envoltura celular demostró que esta fracción contenía solo un proporción insignificante de la mayoría de las actividades enzimáticas probadas, lo que confirma aún más que las actividades corresponden a enzimas secretadas en lugar de proteínas que residen en la fracción de la envoltura celular. Actividades de enzimas ubicadas en la superficie de M. smegmatis y M.tuberculosis Para identificar las enzimas que tienen una ubicación en la superficie y por lo tanto poseen un papel potencial en la interacción entre las bacterias y su entorno, el material amorfo que cubre las células de las dos especies de micobacterias fue Se extrajo con perlas de vidrio y se analizó su contenido de enzimas. Las ocho actividades restantes no se detectaron ni en el filtrado de cultivo ni en el material de envoltura celular más externo de M. smegmatis.

Localización en M. smegmatis de algunas actividades enzimáticas extracelulares detectadas en M. tuberculosis.

La ausencia en M. smegmatis de un conjunto de enzimas extracelulares y expuestas a la superficie que se encuentran en M. tuberculosis puede explicarse por una ubicación citosólica o una ubicación capsular interna de estas enzimas en M. smegmatis. Para ubicar estas ocho actividades enzimáticas extracelulares, extrajimos los materiales capsulares que cubren las células de M. smegmatis por etapas con Tween 80 durante 1, 4 o 24 horas y con perlas de vidrio, un método conocido para exponer los constituyentes capsulares internos. El análisis de los materiales extraídos mostró una marcada diferencia en la ubicación de las diversas actividades enzimáticas en los compartimentos de la envoltura celular de M. smegmatis. Las actividades de nicotinamidasa e isonicotinamidasa se encontraron enterradas más profundamente en la cápsula de M.Smegmatis que las otras cinco enzimas, ya que las actividades correspondientes no se pudieron medir antes del tratamiento de los bacilos con Tween 80 durante 24 h. Localización en M. tuberculosis de algunas actividades enzimáticas extracelulares de M. smegmatis. La ubicación de las dos actividades enzimáticas extracelulares de M. smegmatis no detectadas en el fluido de cultivo de M. tuberculosis también fue investigada por Midiendo las actividades en los materiales extraídos del bacilo tuberculoso con Tween 80 y perlas de vidrio. La erosión de las regiones de La cápsula de M. tuberculosis mediante el tratamiento de células con Tween 80 durante 1 o 4 horas y el uso posterior de perlas de vidrio no expusieron las dos enzimas en la bacteria Fue necesario un tratamiento con Tween 80 durante 24 h para extraer la actividad de a-esterasa, pero no se detectó actividad de hidrolasa de Tween 80. Actividad enzimática extracelular y localizada en la superficie de otras especies microbacterianas Para evaluar aún más la importancia biológica potencial de las diez enzimas extracelulares y localizadas en la superficie del patógeno obligado M. tuberculosis comparamos los perfiles de enzimas de M. bovis BCG, un patógeno oportunista de crecimiento rápido y de crecimiento lento, y un patógeno no patógeno adicional. Especies. Esto dio lugar a la clasificación de las cepas examinadas en tres grupos: los patógenos obligados que invariablemente secretan o exponer en sus superficies las diez enzimas enumeradas en la Tabla 4; los no patógenos M. smegmatis y M. phlei, en los cuales la mayoría de estas enzimas no se secretan ni situado en la superficie; los patógenos oportunistas que secretan o exponen en su superficie algunas de estas enzimas. Como las tasas de crecimiento de las especies no están correlacionadas con sus perfiles de enzimas extracelulares, la diferencia en la secreción y / o exposición de enzimas como superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa, La glutamina sintetasa y la alanina deshidrogenasa tienen más probabilidades de estar relacionadas con el grado de patogenicidad de los organismos que con su tasa de crecimiento. Discusión Determinado a lo largo de sus diferentes fases de crecimiento para diferenciar claramente entre las enzimas extracelulares y los derivados de la liberación de superficie o Material citosólico en el filtrado de cultivo. La actividad de la isocitrato deshidrogenasa, un marcador de la lisis celular, y realizar las pruebas de enzimas en condiciones que prevenir la contaminación bacteriana frecuente. Ocho actividades enzimáticas extracelulares fueron Se ha encontrado que está presente en los fluidos de cultivo y / o en el Superficies celulares

de M. tuberculosis y M. bovis, y ausentes. Han sugerido que la glutamina sintetasa extracelular catalizaría principalmente la síntesis de la L-glutamina El componente del polímero de L-glutamato / glutamina se supone que está presente principalmente en la envoltura celular de las cepas virulentas del complejo M.tuberculosis. Además, la glutamina sintetasa, que puede liberar amoníaco de la glutamina, el aminoácido más abundante de las células huésped, puede contribuir a la capacidad de M. tuberculosis para inhibir la acidificación fagosoma y la fusión fagosoma-lisosoma en infectados. Esta hipótesis explicaría el hecho de que la glutamina sintetasa fue más concentrado en el fluido de cultivo de micobacterias patógenas. De manera similar, se ha demostrado que la alanina deshidrogenasa se libera en cantidades sustanciales en el medio de cultivo de cepas virulentas de M. tuberculosis, y encuentro que sugeriría un papel para la alanina deshidrogenasa en la virulencia de M. tuberculosis. Su participación en el metabolismo del nitrógeno, liberando amoníaco de la alanina, el segundo aminoácido más abundante en el fluido extracelular del huésped, también sugeriría un papel para la alanina deshidrogenasa en la inhibición de la acidificación fagosómica. Así mismo, se sabe que los mutantes negativos a catalasa de M. tuberculosis que son frecuentemente resistentes a la isoniacida exhiben una menor virulencia Hacia los conejillos de indias que las cepas parentales. La aplicación de métodos de biología molecular a las micobacterias debería ayudar a establecer el Importancia de las enzimas extracelulares que proponemos como implicadas en la patogenicidad de M. tuberculosis. Estas enzimas no son necesariamente las únicas extracelulares importantes para la patogenicidad micobacteriana, ya que el uso de un medio de cultivo sintético podría evitar la producción de enzimas hidrolíticas inducibles. De hecho, los resultados anteriores han demostrado que al menos gelatinosa, fibrinógeno y elastina hidrolasa, ureasa o fosfolipasa Las actividades pueden ser inducidas o fuertemente estimuladas según el medio de cultivo. El cultivo de los microorganismos en medios que contienen diversos sustratos que imitan el entorno de las células infectadas complementaría el presente enfoque. Finalmente, un aspecto significativo del presente trabajo es el encontrando que algunas enzimas extracelulares de M. tuberculosis Residir en compartimentos internos de la envoltura celular. Ha sido recientemente mostrado por Escuyer et al. Que M. smegmatis, unas especies en las que la superóxido dismutasa es estrictamente citosólica, tras la transformación por el gen de M. avium que codifica la enzima fue capaz de exponer en su célula. Superficie e incluso liberar la enzima en el fluido de cultivo. Este resultado sugiere que M.avium y Las especies micobacterianas patógenas difieren de M. smegmatis en la secreción de superóxido dismutasa A través de la membrana citoplásmica. Que las especies micobacterianas también difieren en la exposición en sus superficies y secreción de algunas proteinas. Mientras que M. tuberculosis y algunas especies patógenas examinadas aquí secretan y / o exponer en su superficie algunas enzimas potencialmente involucrados en la patogenicidad, no secretan ni Exponer otras proteínas, como la aesterasa y Tween 80.