Biological Oxidation Using

Chapter5 Biological Oxidation Zhang Hai-feng Department of biochemistry, Basic medical school of ZhengZhou University

Why should we eat food everyday? Where does the food go finally? Glucose: C6H12 O6

6CO2+6H2O+36(38)ATP

How does the food provide energy for our body? Through biological oxidation

Cycle mode

Tricarboxylic Acid Cycle

logical oxidation ： It refers to the ocess in which chemical substances e completely Oxidized into H20 、 ATP

d CO2

。

ⅠThe formation of H20 —Electron transfer chain (respiratary chain) . Ⅱ The formation of ATP — Oxidative phosphorylation. Ⅲ The formation of CO2 —Decarboxylation

Some terms • H carrier ： Substance that can accept hydrogens . eg: NAD+,FAD • e carrier ： Substance that can accept electrons . eg: Fe3+ • H donor : Substance that can give hydrogens . eg: NADH+H+,FADH2 • e donor ： Substance that can give electrons. eg: Fe2+

The general process of biological oxidation Carbohydrate

TG

Protein

aa

FA+Glycerol

Glucose

Acetyl-CoA

TAC

½ O2 +2e →O22H++ O2- → H2O

ADP+Pi ATP

CO2 2H H++e

ETC

2H

½ O2

H2O

ⅠThe formation of H20 — Electron transfer chain (respiratary chain) .

Electron transfer chain: It refers to a chain of proteins and coenzymes in the inner menbrance of mitochondria in which 2H are sequentially transferred to O2 to generate H2O. (respiratory chain) 。

2H

2H + + 2e

mitochondrion the mitochondrion contained the enzymes responsible for electron transport and oxidative phosphorylation

In inner membrane knobs

Impermeable to ions and most other compounds

1.The components of electron transfer chain • The respiratory chain consists of four large multi-protein complexes (I, II, III, and IV; three being proton pumps) and two mobile electron carriers, ubiquinone (Q or coenzyme Q) and cytochrome c. • Prosthetic groups acting in the proteins of respiratory chain include flavins (FMN, FAD), hemes , iron-sulfur (Fe-S), and copper.

I

II

Four multi-protein Complexes (I, II, III, and IV)

Two mobile Electron carriers

III

IV

The functions of prosthetic groups in electron transfer chain NAD+

FMN 、 FAD Fe—S

NAD

+

+2H -2H

FAD/FMN

+2H -2H

Fe2+

NADH+H+

FADH2/FMNH

-e Fe 3+ +e

The functions of prosthetic groups in electron transfer chain (CoQ)

CoQ

Heme groups Of cytochromes

Cu2+ Cyt ： b 、 c1 、 c 、 a 、 a3

+2H -2H

Fe3+ Cu2+

CoQH2

+e

-e +e

-e

Fe 2+ Cu +

(1). Complex I —NADH dehydrogenase • Also named as NADH:ubiquinone oxidoreductase or NADH-Q reductase. • A “L” shaped 850 kD multimeric protein complex of 42 different subunits . • FMN, Fe-S centers act as prosthetic groups. • Exergonic electron transferring is coupled to endergonic proton pumping ( with 4 H+ pumped from the matrix side to intermembrane space per electron pair transferred), with mechanism unknown. • Final electron acceptor is ubiquinone (coQ).

NADH Dehydrogenase (complex I) NADH→

FMN;

Fe-S

→CoQ

(2). CoQ •Fat soluble ; a mobile electron/proton carrier •can accept electrons, forming QH2 • QH2 diffuses electrons to the next complex (III); •the only electron carrier not bound to a protein.

(3). Complex II —succinate dehydrogenase • Transfers their electrons collected on FADH2 to Q to form QH2. • The energy released from these electron transferring is not high enough to promote proton pumping.

FAD （ Fe-S ）

Succinate

FAD; Fe-S

→CoQ

（ 4 ） Complex III—cytochrome bc1 • Also called cytochrome c reductase or cytochrome bc1 complex. • A 250 kD multiprotein complex of 11 subunits. • Complete 3-D structure was determined in 1997! • The functional core consists of three subunits: cytochrome b; an Fe-S protein; and cytochrome c1 • Accept electron from QH2 and passes electron to cytochrome c.

2Cyt b + Cyt c1 +(Fe-S) Cytb 、 c1 （ Fe-S ）

QH2→

b; Fe-S; c1

→Cyt c

（ 5 ） Cytochrome c

• Cytochrome c, a soluble protein located in the intermembrane space, will move to complex IV.

（ 6 ） Complex IV — cytochrome aa3 • Also called cytochrome oxidase • A 204 kD 13-subunit protein complex, with structure determined in 1996. • Three subunits are probably critical to the function. • Three copper ions , two heme A groups (a and a3) act as electron carriers in complex IV. • Two electrons need to be transferred to reduce ½ O2 molecule at the “Fe-CuB center” of complex IV to form 1 H2O.

2CuA CuB

Heme a

Heme a3

CuA CuA

The three critical subunits of cytochrome oxidase (complex IV)

The electron path in complex IV

Cyt c→CuA→a→a3→CuB →O2

The ranging sequence of respiratory chain Cytc

eⅠ

eⅡ

NADH+H

e

-

Q e-

cytoso l

eⅣ

Ⅲ Fumarate

+

NAD+

Succinate

线粒体内膜

1/2O2+2H+

H2O

Matrix

2.The classification of respiratory chain (1) NADH respiratory SH2

NAD

+

NADH+H

S

+

chain

FMN H2 （ Fe-S)

CoQ

FMN （ Fe-S)

CoQH2

2Cyt Fe2+ b 、 c1 、 c 、 a 、 a3

2Cyt Fe3+

2H+ NADH+H

+

FMN （ Fe-S ）

CoQ

½ o2

Cytb 、 c1 （ Fe-S ）

Cytc

O2H2O

Cytaa3

O2

(2) Succinate respiratory

chain H2O 2H+

SH2 S

Succinate

FAD （ Fe-S) FADH2 （ Fe-S)

FAD （ Fe-S ）

CoQH2

O2-

2Cyt Fe3+ b 、 c1 、 c 、 a 、 a3

CoQ

CoQ

½ o2

2Cyt Fe2+

Cytb 、 c1 （ Fe-S ）

Cytc

Cytaa3

O2

3.Two shuttles • (1) Glycerol phosphate shuttle • (2) Malate shuttle

(1).Glycerol phosphate shuttle Cytosol

NADH + H+ Dihydroxyactone phosphate

NAD+ ①

Dihydroxyactone phosphate ② Mitochondria

Brain Muscle

α-Glycerol phosphate α-Glycerol phosphate

FADH2

FAD CoQ

b

c1

c

aa3

① α-Glycerol phosphate dehydrogenase(NAD+) ②α-Glycerol phosphate dehydrogenase(FAD)

O2

2. 苹果酸 - 天冬氨酸穿梭 内膜

胞液

线粒体

NAD+

NAD+ ①

NADH 草酰 +H+ 乙酸 天冬 氨酸

草酰 乙酸

Ⅱ ②

α- 酮 戊二酸

Ⅲ

α- 酮 戊二酸

①

NADH +H+

②

天冬 氨酸

呼吸链

Ⅳ ① 苹果酸脱氢酶

② 天冬氨酸氨基转移酶

存在部位：肝脏、心肌组织

Mitochondrial Complexes NAD+

I

FMN

NADH Dehydrogenase

FeS FeS

FAD

II Succinate dehydrogenase

ubiquinone Cyt b

Cytochrome Oxidase

ubiquinone Cyt c1

FeS

III CoQ-cyt c Reductase

Cyt c

Cyt a

Cyt a3

IV 1/2 O2

Problem : Acidity During Electron Transport What cellular compartment becomes acidic (high concentration of hydrogen ions) during mitochondrial electron transport? A. Mitochondrial stroma B. Cytoplasm C. Endoplasmic reticulum D. Space between inner and outer mitochondrial membranes E. Thylakoid membranes

Problem: Dinitrophenol[ 二硝基酚 ] Dinitrophenol is an uncoupler, or has the ability to separate the flow of electrons and the pumping of H+ ions for ATP synthesis. This means that the energy from electron transfer cannot be used for ATP synthesis. 50 yrs ago, DNP was given as a drug to help patients lose weight. Why does this work? Why would this be dangerous? A. Uncoupling the electron transport chain would inhibit fermentation and decrease ATP production, a potentially dangerous situation. B. If electron transport doesn't produce ATP, then much more sugar must be metabolized for energy needs. Very low production of ATP would be lethal.

Problem : Effect of pH on Mitochondria If you isolate mitochondria and place them in buffer with a low pH they begin to manufacture ATP. Why? A. Low pH increases the concentration of base causing mitochondria to pump out H+ to the inter membrane space leading to ATP production. B. The high external acid concentration causes an increase in H+ in the inter membrane space leading to increased ATP production by ATP synthetase. C. Low pH increases the acid concentration in the mitochondrial matrix, a condition that normally causes ATP production. D. Low pH increases the OH- concentration in the matrix resulting in ATP production by ATP synthetase.

Answer • B.

The high external acid concentration causes an increase in H+ in the inter membrane space leading to increased ATP production by ATP synthetase. • Mitochondrial production of ATP requires a concentration gradient of H+, with a high concentration at the inter membrane space and a low concentration in the matrix. The inner membrane is impermeable to H+, but the outer membrane of the mitochondria will allow H+ to pass through. Thus, placing mitochondria in a low pH buffer produces a H+ gradient that can generate ATP through ATP synthetase.

O

SCoA ~ CoASH acetyl CoA

CH3 C C

O

COOH

CH2 COOH

oxaloacetate

NADH+H+

H2O

NAD

HO CH

COOH

CH2 COOH

malate H2O

citrate synthase

CH2 COOH

citrate

aconitase

fumarase

fumarate

succinyl CoA syntetase

CH2 COOH

succinate

COOH

cis-aconitate

CoASH GDP+Pi GTP

ADP

ATP

HO CH

COOH

isocitrate

+

NAD

isocitrate dehydrogenase

succinate dehydrogenase

CH2 COOH

CH

H2O

Tricarboxylic Acid Cycle

HOOC CH

FAD

C COOH

The first reaction in TCAC is the aconitase condensation of acetyl-CoA and oxaloacetate to form citrate. The CH2 COOH TCAC is also named citrate cycle. HC COOH

HC COOH

end

CH2 COOH

HO C COOH

malate dehydrogenase

+

FADH2

H2O

CH2 COOH

NADH+H+

+

NAD

NADH+H+

CO2

CH2 COOH

CH2 COOH

CH2

CH2

O C

~ SCoA

succinyl

CO2 O C COOH CoASH CoA α -ketoglutarate alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex

两条电子传递链的比较 丙酮酸 α - 酮戊二酸 异柠檬酸 苹果酸 谷氨酸 β - 羟丁酸

β - 羟脂酰 CoA

α - 磷酸甘 油 脂肪酰 CoA

二、氧化磷酸化 — ATP 的产生 底物水平磷酸化 ATP 的 生成方式 氧化磷酸化 ( 最主 要)

底物水平磷酸化 定义 直接将代谢物分子中的 能量转 能量 移至 ADP （或 GDP ），生成 ATP （或 GTP ）的过程。

糖酵解过程 O

O C

OOPO

HC

OH

H2C

O

3

2-

ADP

ATP

C

OH

HC

OH

H2C

O

HO P

O

P

O

OH

OH

1,3- 二磷酸甘油 酸 (1,3-DPG)

HO

这是糖酵解 中第一次 底物水平 磷酸化反应

3- 磷酸甘油酸

糖 酵 解 过 程

O C

OH

OH

C

O-

P

CH2

+

O

ADP ATP

OH

磷酸烯醇式 丙酮酸

丙酮酸激酶

O C

OH

C

OH

CH2

(Mg2+ , K+ )

烯醇式丙酮酸

糖酵解中第二次底物 水平磷酸化反应

TCA 循环 H2C COOH

HSCoA

CH2 O C SCoA

GDP+Pi

GTP

H2C COOH H2C COOH 琥珀酸

琥珀酰 CoA ATP

ADP 琥珀酰 CoA 合成 酶 琥珀酰 CoA + GDP + Pi 琥珀酸 + GTP + CoA-SH

氧化磷酸化 定义 代谢物脱下的 H ，经呼吸链传递的过程中 ，逐渐产生能量，使 ADP 磷酸化生成 ATP 的过程，称为氧化磷酸化。 SH2 2H(2H +2e) S

+

呼吸链 1

ADP+Pi

2

O2

H2 O

氧化

ATP 磷酸化

偶 联

1. 氧化磷酸化偶联部位

(1) 测 P/O 值 P/O 值是指物质氧化时 , 每消耗 1mol 氧原子需消 耗的无机磷的 mol 数 l 数。 ADP+H3PO4

ATP

消耗 Pmol 数 消耗 ADPmol 数 P/O 值 = = 消耗 Omol 数 消耗 Omol 数 生成 ATPmol 数 = 消耗 Omol 数

质：每消耗 1mol 氧原子所产生的 ATP 的 mol 数

7-3 线粒体离体实验测得的一些底物的 P/O 比 底物

呼吸链的组成

P/O 值 生成 ATP 数

β-1.羟丁酸 NAD+→FMN→CoQ→Cyt→O2 2.4 ～ 2.8

2. 琥珀酸

3. 抗坏血酸 4. Cytc(Fe2+ )

FAD→CoQ→Cyt→O2 1.7 Cytc→Cytaa3→O2 0.88 Cytaa3→O2

0.61 ～ 0.68

2 1 1

比较 1 、 2 ，第一个偶联部位 NADH → CoQ 比较 2之间 、 3 ，第二个偶联部位 CoQ → Cytc 之间 比较 3 、 4 ，第三个偶联部位 Cytaa3 → O 之间

(2) 计算自由能变化 △G0′ <0 放能 △G0′ >0 吸能 △G0′ =0 无能变化 △G0′ = - n F△E0′ ADP+Pi kJ/mol

ATP

△G0′ = 30.5

呼吸链电子传递时 △ G0′ 的变化 部位 NAD+ - CoQ CoQ - Cyt c Cyt aa3 - O2

△ E0′ （ V ） 0.36 0.21 0.53

△ G0′ (kJ/mol) -69.5 -40.5 -102.3

（三）氧化磷酸化的偶联机制 ： 1. 化学渗透假说： • 目前公认的氧化磷酸化的偶联机制是 1961 年由 Peter Mitchell 提出的化学渗 透学说 (chemiosmotic hypothesis) 。

化学渗透假说 H+

外侧 内膜

H+ 内侧 e ADP ATP O +Pi • 电子传递给氧释出的能量推动质子泵 •将 H+ 泵至內膜外侧，形成化学梯度（势 能） •当 H+ 顺梯度回到基质面时，释出的能量使 ADP 磷酸化为 ATP

质子梯度的形成机制： • 质子的转移主要通过氧化呼吸链在递氢或递电 子过程中所形成的氧化还原袢来完成。 • 每传递两个氢原子，就可向膜间腔释放 10 个质 子。

Ⅰ

在线粒体内膜上存在 5 种参与氧化磷酸化的复合 物 其中 复合物 Ⅰ到复合物 Ⅳ组成呼吸链， 复合物 Ⅴ参与 ATP 的合成。

FMN

FMN

Q

FMN

Q

Q

复合体 Ⅰ的氧化还原袢

复合体 Ⅲ的氧化还原袢

复合体 Ⅳ的氧化还原袢

质子梯度的形成

nH+ ++++++

线粒体内 膜（双脂 层）

-------

膜电位形 成的质子 电动势

基质

nH+

H+

H+ H+ + H H+ + H H+

线粒体内 膜（双脂 层）

nH+ 质子浓度 梯度形成 的电动势

H+

H+

nH+

ATP 的合成： • 当质子从膜间腔返 回基质中时，这种 “势能 ”可被位于线 粒体内膜上的 ATP 合酶利用以合成 ATP 。

2. ATP 合酶：

• 嵌于线粒体内膜上 ，其头部呈颗粒状 ，突出于线粒体内 膜的基质侧。

ATP 合酶的分子结构 由亲水部分 F1 疏水 部分 F0 组成。 •F0 ： H+ 通道 •F1

：

催化 ATP 合成

三、影响氧化磷酸化的因素 1. 抑制剂 ① 呼吸链抑制剂 作用：阻断电子传递

FAD NAD+

FMN (Fe-S) 鱼藤酮 阿米妥

CoQ

丙二酸 b

c1

抗霉素 A

c

aa3

O2

H2S CO CN

② 解偶联剂 : 能够使氧化过程与磷酸化过 程脱节的物质称解偶联剂，它对电子传递 没有抑制作用，但能抑制 ADP 磷酸化生成 ATP 的过程 。 作用：使氧化过程与磷酸化过程脱节 举例： 2 ， 4- 二硝基苯酚 ③ 氧化磷酸化抑制剂 作用：抑制氧化磷酸化过程 举例：寡霉素

2. ADP 的调节作用

NADH + H +

+

氧化磷酸化 1 O2 H2O + NAD+ 2 ADP+Pi

ATP

ADP/ATP↓ ： 抑制氧化磷酸化， ATP 生成 ↓ ADP/ATP↑ ： 促进氧化磷酸化， ATP 生成 ↑

3. 甲状腺激素 促进 ATP 生成和分解 甲状腺素 + Na+-K+ ATP 酶 ATP

ADP

ADP/ATP

4. 线粒体 DNA 突变

氧化磷酸化

四、 ATP 高能磷酸化合物 磷酸化合物水解时放出的能量＞ 21 KJ/mol 者 , 称高能磷酸化合物。其所含键 称高能磷酸键。 高能磷酸键 :～ P 或 ～ P

常见的高能化合物 1. 高能磷酸化合物 • 磷酸酐： ATP 、 CTP 、 UTP 、 GTP • 混合酐： 1,3- 二磷酸甘油酸 • 烯醇磷酸：磷酸烯醇式丙酮酸 • 磷酸胍类：磷酸肌酸 2. 高能硫脂化合物 • 乙酰 CoA 、琥珀酰 CoA 、脂酰 CoA

• 能量的储存

C + ATP 肌酸

CK

C ～ P +ADP 磷酸肌酸

ATP 循环

CO2 H2O

ATP

营养物质

氧化磷酸化 ~P 底物水平磷酸化

生物体内能量 的储存和利用 都以 ATP 为中 心

磷酸 肌酸

ADP

~P

机械能 ( 肌肉收缩 ) 渗透能 ( 物质主动转运 ) 化学能 ( 合成代谢 ) 电能 ( 生物电 ) 热能 ( 维持体温 )

五、通过线粒体内膜的物质转运

（一）、胞液中 NADH 的氧化 1.α- 磷酸甘油穿梭 2. 苹果酸 - 天冬氨酸穿梭

1.α- 磷酸甘油穿梭 胞液

线粒体 内膜

脑、骨骼肌

NADH + H+

NAD+ ①

磷酸二羟丙酮

α- 磷酸甘油

磷酸二羟丙酮

α- 磷酸甘油

②

FADH2

FAD CoQ

b

c1

c

aa3

O2

① 胞液中 α- 磷酸甘油脱氢酶 ( 辅酶为 + NAD ) ② 线粒体内 α- 磷酸甘油脱氢酶 ( 辅基为

2. 苹果酸 - 天冬氨酸穿梭 内膜

胞液

线粒体

NAD+

NAD+ ①

NADH 草酰 +H+ 乙酸 天冬 氨酸

草酰 乙酸

Ⅱ ②

α- 酮 戊二酸

Ⅲ

α- 酮 戊二酸

①

NADH +H+

②

天冬 氨酸

呼吸链

Ⅳ ① 苹果酸脱氢酶

② 天冬氨酸氨基转移酶

存在部位：肝脏、心肌组织

两种穿梭系统的比较

α- 磷酸甘油穿梭 苹果酸 - 天冬氨酸穿梭 α- 磷酸甘油 苹果酸、 谷氨酸 磷酸二羟丙酮 天冬 aa 、 α- 酮戊二酸 进入线粒 NADH+ 体后转变 FADH2 H+ 成的物质 进入 琥珀酸 NADH 呼吸链 氧化呼吸链 氧化呼吸链 3 生成 ATP 数 2 肝脏和心肌组织 存在组织 相同点 将胞液中 NADH 的还原当量转送到线

（二）、腺苷酸载体

（三）、线粒体蛋白质 的跨膜转运

第二节 其他氧化体系

一、需氧脱氢酶和氧化酶 1. 氧化酶类 特点：催化底物脱氢后，以 O2 为直接受氢体， 生成 H2O 。 组成：结合酶

辅基：含 Fe 、 Cu

举例：细胞色素氧化酶、抗坏血酸氧化酶等 2H+

RH2 R

2e

2Cu2+

O2 －

2Cu+

1 2O2

2e

H2O

2. 需氧脱氢酶

特点：催化底物脱氢后，以 O2 为直接受氢体， 生成 H2O2 。 组成：结合酶 辅基： FMN 、 FAD RH2 R

2H

FMN /FAD

H2O2

FMNH2/FADH2

O2

2H

3. 不需氧脱氢酶 特点：催化底物脱氢后，不能以 O2 为直接 受氢体 组成：结合酶

辅酶： NAD+ 、 NADP+

辅助因 子

辅基： FMN 、 FAD

2H 3- 磷酸甘油醛

NAD+

乳

2H+ NADH+H

丙

酸 1,3- 二磷酸甘油酸 酮酸

RH2

2H

R

RH2 R

NAD (NADP ) +

XH2

+

NADH+H + X (NADPH+H+) 2H 2H

1 O2 2

H2O

2H 1 XH2 2O2

FMN /FAD FMNH2/FADH2

2H

2H

X

H2O

二、过氧化物酶体中的氧化酶类 作用：清除自由基 O2-. H2O2 . OH 1 、过氧化氢酶

过氧化氢酶

H2O2 + H2O2

2 H2O+ O2

2 、过氧化物酶 RH2 + H2O2

过氧化物酶

R + 2H2O

三、超氧物歧化酶 （ SOD ） 作用：清除自由基 O2-. 在真核细胞胞液中，以 Cu2+ ， Zn2+ 为 辅基线粒体中以 Mn2+ 为辅基

2O2· + 2H+

SOD

H2O2+O2

四、微粒体中的氧化酶类 1 . 加单氧酶（混合功能氧化酶、羟化酶） RH + NADPH + H + O2 +

单加氧酶

ROH + NADP+ + H2O •参与类固醇激素、胆汁酸及胆色素的生成 •参与药物和毒物的转化 •此酶特异性差

2 . 加双氧酶

CH2 CH

COOH

色氨酸加双氧酶

NH2

O2

NH

色氨酸

O C CH2 C NH

CH

COOH

H NH2

O

甲酰犬尿氨酸

二硝基苯酚

AH2

A

RCOOH E CO2+RH 代谢物 氧化产 物

2H α- 磷酸甘 油穿梭

2H

呼吸链

苹果酸穿梭

1 + O2 2

H2O

能量 ADP+H3PO4 线粒体 胞液

ATP+ H2O

氧 化 磷 酸 化