Biologi Presentasi.docx

MAKALAH REKOMBINASI DAN TEKNIK GEN

MATA KULIAH

: BIOLOGI DASAR

DOSEN

:

Disusun Oleh Kelompok 7 Kevin Vina Sasmita Kasumbala (20617007)

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI PROGRAM STUDI : FARMASI UNIVERSITAS PRISMA 2017

A. PENGKLONAN DNA DAN APLIKASINYA Para ahli biologi molekuler dalam mengkaji gen menghadapi suatu tantangan dimana molekul DNA yang terjadi secara alami sangat panjang, dan molekul tunggal biasanya berisi banyak gen. Untuk eukariota multiseluler gen hanya menempati proporsi kecil dari DNA kromosom, selebihnya berupa urutan nukleotida repetitif bukan pengkode. Gen manusia tertentu mungkin hanya 1/100000 dari molekul DNA kromosom yang ditempatinya. Molekul DNA secara struktural dan kimiawi sangat homogen sedangkan perbedaan antara gen dan DNA sekelilingnya menjadi kabur yang hanya terdiri atas perbedaan dalam urutan nukleotidanya. Untuk bekerja langsung dengan gen spesifik para saintis perlu mengembangkan metode untuk mempersiapkan potongan DNA yang terdefenisi dengan baik dan seukuran gen dalam banyak salinan yang identik. Dengan kata lain para saintis membutuhkan teknik – teknik pengklonan gen. Kloning merupakan salah satu bentuk penemuan dari para ilmuwan dalam rangka perolehan keturunan yang sampai sekarang terus – menerus mendapat pro dan kontra dari masyarakat. Beberapa contoh aplikasinya dapat kita temukan pada : kloning pada tumbuhan, kloning pada hewan, dan kloning pada manusia. Kloning pada tumbuhan bisa dilakukan dengan cara memotong organ tumbuhan yang diinginkan. Nama lain dari kloning pada tumbuhan adalah kultur jaringan,yaitu suatu teknik untuk mengisolasi sel, protoplasma, jaringan dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik, sehingga bagian – bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali. Kloning pada hewan adalah suatu proses dimana keseluruhan organisme hewan dibentuk dari satu sel yang diambil dari organisme induknya dan secara genetika membentuk individu baru yang identik sama. Kloning pada manusia sebenarnya tidak memiliki bayak perbedan dengan bayi tabung . Dalam proses ini sperma sang suami dicampur ke dalam telur sang istri dengan proses in vitro di dalam tabung kaca.

Para saintis telah mengembangkan sejumlah cara untuk mengklon potongan DNA dalam laboratorium tetapi hampir semuanya mempunyai ciri umum yang sama. Sebagai gambaran umum untuk pengklonan gen dan aplikasinya kita mempertimbangkan suatu pendekatan yang menggunakan bakteri dan plasmid bakteri tersebut. Untuk mengklonan gen atau potongan DNA plasmid – plasmid terlebih dahulu diisolasi dari sel bakteri. Plasmid merupakan molekul DNA rekombinan yang menggabungkan DNA dari dua sumber. Plasmid ini dikembalikan ke sel bakteri yang kemudian bereproduksi untuk membentuk klon sel. Gen asing yang dibawa oleh plasmid diklon pada waktu yang sama karena bakteri yang sedang membelah terus mereplikasi plasmid rekombinannya, dan pada keadaan yang cocok klon bakteri akan membuat protein yang dikode oleh gen asing tersebut.

Dalam proses kloning DNA melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme

inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentukcovalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan

Kloning DNA dalam plasmid vektor DNA dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu: 1.

Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.

2.

Mengandung marker selektif yang menyebabkan sel yang membawa vektor (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi.

3.

Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya. Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.

Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase.

Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium.

Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk

menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh.

Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda. Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase. Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA). Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmenfragmen hasilnya disambungkan ke dalam vektor.

Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Membran

ditekan

di

atas

koloni

dan

cetakan

koloni

aakan

berada

pada

membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.

Penggunaan yang potensial dari gen hasil klon terbagi dalam dua kategori umum. Tujuan yang pertama : untuk menghasilkan produk protein baik untuk dipelajari ataupun untuk penggunaan praktis, misalnya perusahan farmasi menggunakan bakteri yang membawa gen hormon pertumbuhan manusia untuk menghasilkan sejumlah

besar

hormon

yang

bisa

dimanfaatkan

untuk

mengobati

pertumbuhan yang terhambat. Yang kedua : untuk mempersiapkan banyak salinan dari gen itu sendiri. Seorang saintis mungkin berkeinginan untuk menentukan urutan nukleotida gen atau menggunakan gen itu untuk memberi suatu organisme kemampuan metabolik baru, misalnya gen hasil klon untuk resistensi terhadap hama yang berasal dari satu spesies tanaman bududaya dapat ditransfer ke tumbuhan spesies lain. Sebagian besar gen hanya terdapat dalam satu salinan di dalam tiap genom sekitar satu bagian per sejuta DNA sehingga kemampuan untuk mengklon fragmen DNA yang sangat langka tersebut benar – benar bernilai.

B. PENGGUNAAN ENZIM RESTRIKSI UNTUK MEMBUAT DNA REKOMBINAN Dalam pengklonan gen dan rekayasa genetik telah dimungkinkan oleh penemuan enzim yang bisa memotong molekul DNA pada lokasi – lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim ini disebut enzim restriksi, ditemukan dalam bakteri pada akhir tahun 1960-an . Di alam enzim ini melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim – enzim ini bekerja dengan memotong -motong DNA asing, suatu proses yang disebut restriksi. Sebagian besar enzim restriksi sangat spesifik, mengenali urutan nukleotida pendek dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu didalam urutan ini. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil pada adenin atau sitosin di dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi terebut. Ratusan enzim restriksi telah diidentifikasi dan diisolasi dan banyak yang telah tersedia secara komersial.

C.PENGKLONAN GEN EUKARIOTIK DALAM PLASMID BAKTERI Pengekspresian gen eukariot di dalam ruang lingkup gen prokariot sangatlah sulit, karena kedua gen tersebut susunannya berbeda, selain itu adanya daerah bukan pengkode (intron) di dalam DNA eukariotik yang cukup panjang dapat mencegah ekspresi gen yang benar oleh sel prokariot. Untuk mengatasi hal tersebut, maka ketika enzim restriksi memotong DNA eukariot, di bagian hulu fragmen DNA tersebut harus disisipi oleh promoter prokariot. Pada saat gen eukariot disisipkan, bakteri dapat mengenali promoter, dan langsung mengekspresikan gen tersebut. Untuk hal yang kedua, bisa diatasi dengan merubah mRNA menjadi DNA komplementer (complementary DNA/cDNA) menggunakan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase), yaitu enzim yang diisolasi dari retrovirus. mRNA bisa digunakan karena pada mRNA, intronnya telah dikeluarkan pada saat proses splicing. Setelah DNA ditransplantasi menghasilkan DNA rekombinan, maka DNA tersebut harus dimasukkan kembali ke dalam inang supaya dapat berekspresi. Pemasukan DNA rekombinan bisa dengan cara elektroporasi (memberikan kejutan listrik untuk membuka membran sel) atau dengan cara penyuntikan (mikroinjeksi) atau dengan cara transformasi, yaitu penyerapan DNA rekombinan dari larutan.

D. PCR (polymerase chain reaction)

 Pengertian Reaksi rantau polimerase ( PCR – polymerase chain reaction ) merupakan suatu metode untuk membuat salinan segmen spesifik dari suatu DNA. Metode ini lebih cepat dari pada pengklonan gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro. Materi awal untuk PCR adalah suatu larutan DNA untai-ganda yang mengandung urutan nukleotida yang ditargetkan untuk di salin. Saintis menambahkan jenis DNA polimerase yang resisten panas ( yang mengkatalisis reaksi ), suatu pasokan yang terdiri dari keempat nukleotida (untuk disusun menjadi DNA baru ), dan primer. Primer ini dibutuhkan agar DNA polimerase dapat memulai sintesis DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ini merupakan molekul DNA untai tunggal sintetik yang pendek, primer ini komplementer terhadap ujung – ujung DNA target sehingga menentukan segmen DNA tertentu yang akan diperoleh kuat.

 Tujuan PCR Saat ini PCR juga sering digunakan untuk membuat fragmen DNA spesifik untuk diinsersikan secara langsung ke dalam suatu vektor, sehingga tidak memerlukan tahapan skreening suatu perpustakaan DNA.

 Komponen PCR 1.

DNA

DNA yang dimaksud disini adalah DNA yang berfungsi sebagai cetakan (template). Untuk aplikasi PCR, kemurnian DNA mempengaruhi hasil.DNA yang tidak murni sering menyebabkan masalah reproduksibilitas, tujuan utama juga digunakan untuk diagnosis. DNA yang digunakan harus dimurnikan dahulu sebelum diproses dengan PCR. DNA yang digunakan sebagai cetakan untuk PCR sebaiknya bebas nukleuse, endo-atau eksoprotease, dan DNA-binding protein.

2.

Primer

Primer berfungsi mengawali reaksi replikasi DNA pada reaksi PCR. Primer yang dibutuhkan untuk PCR biasanya satu pasang yaitu primer forward dan backward. Primer PCR sendiri adalah komponen yang sangat menentukan keberhasilan PCR. Ada beberapa program untuk mendesain primer PCR yang dapat digunakan secara gratis, seperti MEDUSA, Primer3, PrimerQuest, FastPCR, dan lain-lain.

3.

Dntp (Deoxynucleotide triphosphate)

dNTP merupakan blok pembangun molekul asam nukleat yang terdiri dari dATP (deoxydenosine

tryphosphatase),

dTTP

(deoxythymidine

triphophatase),

dCTP

(deoxycytosine triphosphate), dan dGTP (deoxyguanosine triphosphatase). Dalam beberapa aplikasi dan protokol PCR, salah satu dari empat dNTP tersebut dapat diganti elemen analog. Modifikasi ini berguna untuk aplikasi yang berbasis pasca-PCR (misalnya : sekuensing, pembuatan probe untuk Southern blotting, dll)

4.

Polimerase DNA

Ketika terjadi sintesis DNA,enzim polimerase DNA akan melakukan seleksi nukleotida yang tepat untuk ditambahkan ke primer untuk melanjutkan DNA sesuai dengan aturan pasangan basa Watson-Crick ( A-T dan G-C ). Oleh karena itu, Polimerase DNA selalu mengkatalis sintresis DNA dalam orientasi 5’ ke 3’. Beberapa polimerase DNA juga memiliki aktivitas eksonuklease atau yang sering disebut dengan aktivitas proofreading yang akan memeriksa basa yang telah ditambahkan untuk menumbuhkan untai DNA. Ketika terjadi penambahan nukleotida yang tidak tepat aktivitas proofreading tersebut akan membuang basa yang tidak tepat tersebut. Mekanisme koreksi ini akan meningkatkan akurasi atau yang disebut juga dengan fidelitas. Ketika membandingkan atau memilih polimerase DNA untuk PCR ada dua hal yang penting yang harus dilihat yaitu fidelitasnya dan efisiensi sintesisnya. Yaitu makin tinggi fidelitas dan efisiensi sintesisnya makin baik polimerase DNA tersebut (dan makin mahal juga harganya).

5.

Bufer reaksi PCR

Bufer reaksi PCR biasanya mengandung Mg2+, kation monovalen, dan beberapa cosolvent. Co-solvent membantu menstabilisasi enzim polimerase DNA, mempengaruhi kerja enzim, dan atau DNA melting temperature ( Tm). Ion Monovalen seperti Na+, K+, dan NH4+ menstimulasi aktivitas polimerase DNA dan melindungi muatan negatif gugus fosfat DNA, sehingga melemahkan kekuatan kekuatan elektronik yang saling menolak antara primer dan DNA target. 

Protokol dasar PCR adalah: 1. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas yang berfungsi sebagai

cetakan.

2. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target. 3. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru. 4. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator.

E. APLIKASI REKOMBINAN GEN DAN TEKNIK GEN Telah lama manusia berusaha untuk mengubah sifat makhluk hidup sesuai dengan yang diinginkan. Mereka melakukan seleksi dan persilangan pada hewan dan tumbuhan yang diperlukan dalam kehidupannya. Dari hasil seleksi dan persilangan tersebut, kini dapat menikmati jeruk yang manis, bunga anggrek yang berwarna-warni, padi yang cepat dipanen, jagung yang tongkolnya besar dan bijinya banyak, semangka tanpa biji, ayam yang telurnya banyak, ternak sapi yang cepat gemuk, sapi perah yang susunya, dan organisme lain yang memberikan keuntungan lebih kepada manusia. Kini, seiring dengan kemajuan dan perkembangan ilmu pengetahuan, untuk mengubah sifat suatu makhluk hidup telah dikembangkan teknik rekombinasi gen. Rekombinasi artinya penggabungan, sedangkan gen yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) adalah unit fungsional meteri genetis. Jadi, rekombinasigen dapat diartikan sebagai penggabungan gen (DNA) yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk gen (DNA) rekombinasi. Teknologi rekombinasi gen telah memberikan banyak manfaat bagi kehidupan manusia sehari-hari misalnya untuk membuat insulin dan organisme transgenik.

Membuat insulin Insulin digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobeti dengan insulin manusia. Sebelumnya, insulin dibuat untuk mengekstraknya dari pankreas hewan. Masalahnya, insulin hewan tidak sama dengan insulin manusia sehingga sering ditolak oleh sistem pertahanan tubuh. Untuk mendapatkan insulin yang sama dengan manusia, digunakan teknik rekomendasi gen. Contohnya, gen pembentuk insulin dari sel pankreas manusia dimasukkan ke dalam gen bakteri sehingga bakteri mampu menghasilkan insulin manusia.

Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara massal dengan menggunakan bakteri Escherichia coli.

Rekombinasi gen dalam pembuatan insulin ini mempunyai keunggulan sebagai berikut. 1. Insulin yang dihailkan lebih murni karena menghasilkan protein manusia. Protein manusia lebih dapat diterima oleh tubuh manusia dan jarang ditolak sistem pertahanan tubuh.

2. Dapat dibuat dalam jumlah besar sehingga biayanya lebih murah dan mudah diperoleh. Biaya pembuatan insulin dengan pembuatan insulin menggunakan pankreas hewan. 3. Proses dapat dilakukan atau dihentikan kapan saja karena bakteri dapat disimpan sampai diperlukan lagi.

Organisme transgenik Organisme transgenik adalah oraganisme yang mendapat pindahan gen dari organisme lain. Gen yang ditransfer dapat berasal dari jenis (spesies) lain seperti bakteri, virus, hewan, dan tanaman lain.

Tujuan memindahkan gen tersebut mendapatkan orgnisme baru yang memiliki sifat lebih baik. Saat ini sudah banyak jenis tanaman pangan dan sandang yang merupakan tanaman transgenik misalnya padi, jagung, kentang, kacang kedelai dan kapas. Keunggulan dari tanaman transgenik tersebut umumnya adalah tahan terhadap serangan hama penyakit, sehingga produksinya meningkat.

Rekayasa genetika seperti dalam perbuatan tanaman trasngenik dilakukan untuk kesejahteraan manusia. Akan tetapi, terkadang muncul dampak yang tidak diinginkan, rekayasa genetika bisa menguntungkan atau menimbulkan masalah.

Menguntungkan: 1. Rekayasa organisme dapat menghasilkan produk lebih banyak dari sumber yang sedikit. Contohny tanaman, memerlukan lebih sedikit peptisida dan pupuk. 2. Rekayasa tanaman yang dapat hidup dalam kondisi lingkungan ekstrem akan memperluas daerah pertanian dan mengurangi bahaya kelaparan. 3. Makanan dapat direkayasa supaya lebih lezat dan menyehatkan. Misalnya, kentang yang hanya menyerap sedikit minyak saat digoren atau bahkan mengandung vaksin tertentu.

Masalah: 1. Tanaman yang direkayasa tahan pestidiadapat melakukan persilangan dengan jenis liarnya menghasilkan yang gulma tahan pestisida. 2. Bakeri hasil rekayasa dapat lolos dari laboratorium atau pabrik yang dampaknya tidak dapat diperkirakan. 3. Pematenan organisme baru. Perubahan yang telah menghabiskan banyak uang untuk mengembangkan suatu oraganisme mungkin menolak berbagi memiliki kekuatan dan kekuasaan yang besar. 4. Kemungkinan timbilnya transfer gen pada manusia.

DAFTAR PUSTAKA Campbell, Neil A., Reece, Jane B., Lawrence G, Mitchell. 2002. Biologi. Edisi ke 5. Ahli Bahasa:Rahayu Lestari. Erlangga. Jakarta