Bif Mihai Dan Cristian, Cristina Toader.docx

Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicina Veterinara Facultatea de Biotehnologii Comparatie intre distilare-extractie simultana la scara microscopica si extractia prin sorbtie cu agitator in cazul determinarii compusilor organici volatili din sucul si mustul de struguri

Studenti: Mihai Dan-Cristian Toader Cristina

Bucuresti 2019

1.Introducere Distilarea reprezinta totalitatea modalitatilor de separare a componentelor unui amestec lichid omogen,bazate pe diferenta dintre temperaturile de fierbere ale constituentilor, carora le corespund si presiuni de vapori diferite. Extractia reprezinta operatia de separare partiala sau totala a componentelor unui amestec pe baza diferentei de solubilitate,in unul sau mai multi dizolvanti. Este cunoscut faptul ca,in general,compusii organici volatili(componentele de “aroma” si “gust”) din sucul sau mustul de struguri contribuie intr-o mare masura la aroma vinului obtinut din acesta,desi au loc o serie de transformari chimice in timpul procesului de fermentatie,care conduce la transformarea mustului in vin.Astfel,acesti compusi de aroma sunt foarte importanti pentru ca sunt luati in calcul atunci cand se face aprecierea senzoriala a vinului,dar si la evaluarea economica a acestuia.Acest lucru se ia in calcul,in special,in cazul varietatilor “aromate” de vita-de-vie(Vitis vinifera),in special acele specii inrudite cu Gewurztraminer,Muscat si Riesling alb,din moment ce aceste vinuri sunt bogate in compusi de aroma proveniti direct din musturile respective. De asemenea,compusii organici volatili specifici pot fi prezenti in concentratie mare,in functie de origine.A fost estimat faptul ca valorile concentratiilor compusilor organici volatili din vin(cu exceptia etanolului) variaza intre 1 ng/l si 1 g/l.Metode anterioare care implica extractie cu solventi si distilareextractie simultana,urmate de analize spectrometrice cu gaz cromatografic au fost folosite intr-o masura mai mare pentru a studia compusii de aroma din fructe si vin.In ultimii ani a fost utilizata metoda de extractie a fazei solide,aceasta oferind avantaje importante fata de tehnicile mai vechi.Totusi,chiar si utilizand extractia fazei solide,limita de detectie a compusilor de aroma este de ordinul μg/l.Metoda de extractie sorbtiva cu agitator(SBSE) a fost implementata in anul 1990 de Baltussen,Sandra si altii.Aceasta tehnica utilizeaza un Twister-un agitator din sticla acoperit de o faza sorbtiva,cel mai adesea polidimetilsiloxan,in cantitati mai mari decat cele aflate pe fibrele de microextractie a fazei solide. Prin urmare, pentru multe analize spectrometrice cu gaz cromatografic,SBSE s-a dovedit a fi mai sensibila decat microextractia fazei solide,mai ales daca este utilizata o separare prin desorbtie-separare prin injectie. SBSE poate fi utilizata ca si microextractia fazei solide in ambele tipuri de imersie.Agitatorul este amplasat intr-un sistem termic de desorbtie,de unde compusii de aroma extrasi prin sorbtie sunt in primul rand supusi desorbtiei de pe agitator intr-un crioseparator,care contine Tenax. In literatura nu se gasesc decat cateva exemple de utilizare a metodei SBSE la analizarea bauturilor alcoolice si mustului de struguri.In

continuare este expusa aplicarea unui procedeu de imersie a metodei SBSE,realizata cu folosirea unui suc sintetic de struguri,pentru analizarea compusilor organici volatili din mustul Huxelrebe. 2.Experimental. 2.1.Reactivi,norme si probe. S-a utilizat: -diclormetan; -acetona; -apa; -concentrat deionizat de struguri(greutate specifica 1.3154-1.3221); -compusi de aroma specifici si suc model de struguri,din resurse interne. Sucul model de struguri a fost realizat conform cu datele anterioare in ceea ce priveste compozitia: -suc deionizat de struguri concentrat(0.3 kg); -acid tartric(15 g); -acid malic(10.5 g); -citrat tripotasic monohidrat(11,1 g); -dihidrogen o-fosfat de potasiu(1.55 g); -clorura de sodiu,NaCl(0.08 g); -clorura de magneziu hexahidrat(2.2 g); -lactat de calciu pentahidrat(3 g); Toate acestea au fost dizolvate in apa super pura,astfel incat masa totala a amestecului sa fie de 5 kg.Pentru producerea mixului aromat sintetic de struguri au fost amestecate cantitati egale(0.1 g) din 46 de compusi de aroma specifici sucului de struguri.Sucul sintetic de struguri,utilizat pentru optimizarea si validarea metodei a fost realizat prin amestecarea unor cantitati mici de mix aromat diluat de struguri cu suc model de struguri,dupa descrierea de la 2.3. si 2.4. Pentru metoda SBSE,n-tetradecanul a fost diluat in acetona(200mg/l).Sucul de struguri Huxelrebe(din struguri culesi in 2001) a fost obtinut din podgoria

Chilford Hundred (Cambridge,UK) si a fost conservat cu SO2(1000 mg/l) si depozitat la 0ºC,inainte de a fi analizat. 2.2.Aparatura pentru metodele studiate(SDE si SBSE). Aparatele necesare analizelor sunt urmatoarele: -dispozitiv de distilare cu vapori-extractie cu solventi simultana la scara microscopica; 2.3.Conditiile de preluare a probelor pentru analiza SDE. Pentru a prepara sucul sintetic de struguri,250 ml din sucul model au fost tratati cu 10 % solutie de diclormetan in mixul aromatic de struguri(50 μl),totul amestecat intr-un balon cu fund rotund cu capacitatea de 500 ml.Un agitator magnetic PTFE a fost adaugat,iar balonul a fost asezat intr-un incalzitor cu manta de 500 ml.Din solutia de diclormetan(n-tetadecan 100mg/l) s-a prelevat 1 ml,care a fost adaugat in balonul cu solvent al aparatului de distilare-extractie simultana,cu o granula anticoroziva.Distilarea a fost oprita dupa 1 ora,in timp ce extractia cu solvent a fost continuata pentru inca 30 minute. In fiecare caz,punctul minim de temperatura a fost mentinut la -5ºC,cu un reflux a diclormetanului la temperatura de 60ºC.Pentru analizarea probelor martor de apa si a sucului de struguri,au fost extrasi 250 ml in conditii identice. Concentratii semicantitative ale aromelor volatile identificate sigur au fost determinate prin compararea zonelor cu reactie specifica standardelor interne. 2.4.Conditiile de prelevare a probelor pentru analiza SBSE. Inainte de folosire,agitatoarele au fost conditionate la 300ºC cu un debit de heliu de 100 ml/min,timp de o ora,folosind o cuva de conditionare.Pentru SBSE, agitatoarele au fost puse intr-o fiola de sticla de 20 ml,impreuna cu sucul model(20 ml) care a fost tratat cu 1% solutie de mix aromatic sintetic de struguri in acetona(1 μl).SBSE a fost realizata la temperatura camerei timp de 2 ore,iar agitarea a avut loc cu o viteza de rotatie de 1000 rot/min. Pentru analiza probelor martor si a celor cu suc natural de struguri au fost extrasi 20 ml de proba.Concentratii semicantitative ale aromelor volatile identificate au fost determinate prin compararea zonelor cu cele din standardul intern. 2.5.Folosirea instrumentelor si conditii de lucru. Analizele au fost facute utilizand un sistem cu gaz cromatografic Agilent 6890, cuplat la ionizare cvatrupla de electroni(70 eV). Agilent este un spectrometru de masa,echipat cu o coloana capilara Agilent Innovax

(polietilenglicol reticulat).Gazul purtator este reprezentat de heliu,cu o coloana constanta si un debit de 1 ml/min(viteza medie de 36 cm/s). Pentru a face analiza extractelor prin SDE,temperatura cuptorului cu gaz cromatografic a fost programata de la 40ºC(5 minute) pana la 240ºC(20 de minute),cu o crestere a temperaturii de 3ºC/min.Temperatura separatorului cu injectie a fost reglata la 220ºC,iar volumul injectat a fost de 2 μl.Pentru extractul obtinut din sucul sintetic de struguri a fost folosit un raport de separare de 50:1,iar spectrometrul de masa a fost actionat intr-un mod selectat de monitorizare cu ioni,cu o durada de supravietuire de 100 ms pentru toti ionii.Pentru extractul martor si pentru extractul din sucul natural de struguri a fost folosit un raport de separare prin injectie de 20:1.In acest caz spectrometrul a fost actionat in modul de scanare(30-300 amu).Temperatura liniei de transfer a polidimetilsiloxanului a fost mentinuta pe parcursul operatiei la 250ºC.Analiza SBSE a fost facuta cu un sistem de desorbtie automat(TDS-2)-o unitate termica de desorbtie(Gerstel), montata pe acelasi sistem gaz cromatografic-polidimetilsiloxan.Probele de analizat au fost crioconcentrate cu azot lichid intr-un vaporizator cu injectie (CIS4),cu temperatura programata, mentinute la -50ºC,inainte de injectare. Agitatoarele au fost desorbite termic in curent de heliu cu un debit de 70 ml/min, iar TDS-2 a fost programat de la 20ºC pana la 300ºC(5 min),cu o rata de 60ºC/min.Dupa desorbtie si crioconcentrare,CIS-4 a fost programat de la -50ºC pana la 260ºC(20 min),cu 12ºC/s pentru a transfera compusii de aroma volatili captati,in coloana analitica.TDS-2 a fost actionat in modulde imprastiere,in timp ce CIS-4 a fost actionat in modul de separare,pentru a furniza un raport de separare de 50:1 si 20:1 pentru compararea directa cu sucul sintetic de struguri si cu cel natural,probe extrase prin metoda SDE.Cuptorul cu gaz cromatografic cu program de temperatura si spectrometrul au fost,de asemenea,actionate in conditii identice cu cele utilizate la metoda SDE(modul de monitorizare cu ioni pentru probele extrase din sucul sintetic de struguri;modul de scanare pentru probele extrase din probele martor si sucul natural de struguri).Pentru identificarea compusilor volatili din probele martor si din probele de suc natural de struguri a fost utilizat un program software Agilent MS Chemstation,echipat cu un aparat Wiley 275L,NIST 98 si.S-au determinat,ca o confirmare secundara si indicii de retentie prin injectarea aromelor autentice standard in conditii identice,cu gaz cromatografic si calcul prin interpolare liniara,cu referinta la timpul de retinere a esterilor C2-C20. 3.Rezultate si discutii. 3.1.Avantajele desorbtiei termice

Optimizarea metodei SDE(distilare-extractie simultana) se face prin proceduri standard. Avantajele metodei SBSE: Pentru optimizarea sistemului termic de desorbtie TDS-2 si a vaporizatorului CIS-4 s-a aplicat metoda SBSE asupra sucului sintetic de struguri dupa descrierea de la 2.4.si,de asemenea,prin analize directe asupra mixului sintetic de arome din struguri.Desorbtia agitatoarelor a fost facuta prin programarea TDS-2 de la 20ºC pana la 220,240,260 sau 300ºC cu o rata de 60ºC/min,cu un debit de heliu de 25,50,70 sau 100 ml/min,timp de 5 sau 10 min.Probele supuse desorbtiei au fost crioconcentrate in vaporizator cu temperatura programabila CIS-4 la -50ºC sau -150ºC.Dupa aceea ,vaporizatorul a fost programat de la -50ºC/-150ºC pana la 220,240,250 sau 260ºC(temperatura superioara a fost mentinuta 10 sau 20 minute),cu o rata a temperaturii de 12ºC/s, astfel avand loc transferul substantelor capturate,in coloana. Conditiile optime pentru desorbtia termica au fost stabilite ca fiind: -debitul de curgere a heliului =70 ml; -temperatura finala de desorbtie =300ºC,timp de 5 min. Conditiile optime ale criotrapei si ale vaporizatorului au fost stabilite ca fiind: -temperatura de captare =-50ºC; -temperatura finala crescuta pana la 260ºC,timp de 20 min. Aceste conditii asigura transferul complet al compusilor de aroma de pe agitator in criotrapa/coloana analitica.Conditiile acestea au fost utilizate pentru toate experimentele ulterioare. 3.3.Optimizarea conditiilor SBSE. Pentru a optimiza timpul de extractie si viteza de agitare,sucul sintetic de struguri a fost supus SBSE cu o durata de extractie de 30 min,1,2,3,4,5,6 si 24 de ore,cu o viteza de agitare de 1400 rot/min.S-a observat ca nivelul de detectie a majoritatii compusilor din sucul sintetic de struguri a crescut pana la 2 ore de extractie,apoi a ramas aproape constant pentru toate celelalte durate de extractie, la aceeasi viteza.Alte cresteri ulterioare ale nivelului de detectie in intervalul 3-24 ore nu au fost considerate suficiente pentru a mari timpul de extractie.Mai mult,echilibrarea probelor nu este necesara pentru analiza cantitativa. Analize ulterioare au fost facute cu o durata de extractie de 2 ore si viteza de agitare de 500,1000,1100 si 1400 rot/min.Sensibilitatea maxima a fost atinsa la o viteza de

agitare de 1000 rot/min.Ca urmare,toate celelalte extractii prin sorbtie au fost facute utilizand o durata de extractie de 2 ore,la o viteza de agitare de 1000 rot/min. 3.3.Analizele SDE si SBSE asupra sucului sintetic de struguri. Pentru a determina recuperarile si reproductibilitatea,a fost realizata o serie de 11 extractii consecutive din sucul model tratat(dupa metoda descrisa anterior), utilizand ambele metode(SDE si SBSE).Pentru SDE,concentratia fiecaruia dintre cei 46 de compusi de aroma din sucul sintetic de struguri a fost de 400 μg/l.Pentru realizarea unei solutii etalon,o solutie 10% de mix de arome din struguri in diclormetan(50 μl) a fost adaugata in in solventul de extractie standard intern(1ml solutie de n-tetradecan in diclormetan,100 mg/l) intr-o fiola standard cu gaz cromatografic,din sticla,de 2 ml.Pentru SBSE,concentratia fiecarui compus de aroma din sucul sintetic de struguri a fost de 10 μg/l.Pentru calibrarea injectiei,un tub de desorbtie termica continand un dop mic de vata a fost tratat direct cu 1 μl de solutie standard intern de n-tetradecan in acetona(1 μl).Astfel cu un raport de separare prin injectie de 50:1,masa maxima a fiecarui compus de aroma din coloana capilara cu gaz cromatografic cu 4 ng in exces pentru fiecare metoda de extractie folosita. Recuperarile au fost determinate prin compararea raportului zonei de raspuns a fiecarui compus de aroma cu standardul intern al extractelor produse cu aceeasi proportie de raspuns obtinute din standardele corespunzatoare.Pentru a garanta faptul ca experimentele de recuperare ale celor doua tehnici au fost conduse in limitele abaterilor liniare ale MSD,a fost preparata o serie de solutii cu un continut fix de concentratii ale solutiilor standard intern(probe martor) si compusii de aroma din sucul sintetic de struguri de concentratii diferite. Pentru SDE,aceste solutii contin 25-800 mg/l din fiecare compus volatil,iar pentru SBSE aceste solutii contin 50-1600 mg/l din fiecare compus volatil.Din fiecare curba de etalonare a fost calculat indicele de regresie(r²).Au fost facute, de asemenea,si grafice pentru fiecare compus de aroma cu analiza vizuala a detectorului de liniaritate.Dupa cum se poate vedea din tabelul 1,sunt diferente intre duratele de retentie cu gaz cromatografic in cazul compusilor de aroma extrasi prin SDE(cu injectie directa de gaz cromatografic) si SBSE(cu injectie de gaz cromatografic,urmata de desorbtia din criotrapa).Aceste diferente au loc din cauza a doi factori implicati in aplicarea metodei SBSE: -criotrapa Tenax necesita cam 30 s pentru a incalzi de la -50ºC pana la 260ºC,pe durata injectarii compusilor pe coloana de gaz cromatografic; -compusii de aroma au durate diferite de retentie in criotrapa.

Recuperarile relative rezultate in urma aplicarii metodei SDE se situeaza in intervalul 15-150%(recuperare medie de 86.9%).Coeficientul de variatie are valori in intervalul 2.1-38.6%(cu o valoare medie de 6.3%).Metil-antranilul are cea mai mare valoare a coeficientului de variatie si,respectiv,cea mai mica valoare a reproductibilitatii.Cele mai mici valori ale recuperarilor relative s-au obtinut pentru 3-hidroxi-2-butanona,acid i-butiric,acid valeric,2-feniletanol si metilantranilat.Per total, metoda SDE optimizata la scara microscopica ofera recuperari excelente si capacitate de refacere pentru majoritatea aromelor volatile din struguri,extrase din sucul etalon,la concentratiile(400 μg/l pentru fiecare compus). Recuperarile relative obtinute la aplicare metodei SBSE au valori situate in intervalul 0.3-110%(racuperare medie de 28.4%).Coeficientul de variatie are valori situate in intervalul 1.2-63.9%(valoare medie de 8.5%).Eficienta extractiei creste cu cresterea valorii log ko/w.De exemplu,recuperari scazute au fost obtinute pentru acidul i-butiric(0.3%,log ko/w=1.00),in timp ce,recuperarile pentru acidul nonanoic sunt de 13%(log ko/w=3.52).Desi recuperarile sunt,in general,mai mici decat cele obtinute prin metoda SDE,se observa ca are loc o crestere a regenerarii lungimii portiunii hidrocarbonate a moleculelor,iar caracterul hidrofob al moleculelor creste.Extractia sorbtiva este o tehnica echililibrata,iar pentru compusii analizati dintr-o matrice apoasa,eficienta extractiei este controlata doar de coeficientul de separare a solutului dintre faza polidimetilsiloxan si faza apoasa.Desi teoria este aplicabila pentru toate tehnicile de extractie care utilizeaza un solvent de extractie pentru a extrage compusii de aroma dintr-o matrice apoasa,metoda SDE nu se bazeaza doar pe principiul de separare,ci si pe simplu fapt ca aburul generat pe durata procesului de extractie duce la cresterea presiunii vaporilor.Acest lucru duce la micsorarea punctului de fierbere a apei si a compusilor de aroma,ceea ce creste probabilitatea transferului complet sau semicomplet al fazei solventului organic,prin urmare duce la cresterea recuperarilor pe durata aplicarii SDE cu aburi. Datele SBSE arata o variatie in concordanta cu recuperarile relative teoretice si experimentale. Aceasta metoda produce si cele mai mari recuperari posibile,fara a tine cont de durata de agitare sau de viteza de agitare in timpul extractiei;din motive evidente extractia optima a fiecarui compus analizat nu poate fi niciodata obtinuta pentru variatii mai mari ale compusilor de aroma(cu diferite valori ale log ko/w) din probe.Desi recuperarile obtinute au fost,in general,mai mici utilizand metoda SBSE,se subliniaza faptul ca rata de tratare a compusilor de aroma din sucul model a fost de 40 de ori mai mica decat proportia utilizata in studiul SDE.Acest

lucru asigura faptul ca o cantitate identica,din fiecare compus de aroma,a fost introdusa in aparatul cu gaz cromatografic-dimetilsiloxan,pe durata analizelor, pentru a se face o comparatie corecta intre tehnici.In orice caz,concentratiile folosite in studiul SDE depasesc capacitatea de extractie a celor 24 μl de faza polidimetilsiloxan care acopera agitatoarele Twister. 3.4.Analizele SDE si SBSE asupra mustului Huxelrebe (Observatii). Inainte de realizarea analizei mustului natural de struguri,a fost facuta extractia probelor martor, utilizand ambele metode, SDE si SBSE, in aceasta ordine,pentru a identifica impuritatile.In TABEL 2 sunt grupati compusii pozitivi identificati din proba martor de apoasa prin extractie.Desi a fost detectat un numar mare de compusi prin tehnica de agitare,este de notat faptul ca cromatografia SBSE a fost semnificativ mai curata,deoarece s-au detectat cantitati mult mai mici de contaminanti decat presupune utilizarea extractiei cu solventi, dupa cum se observa in cromatografia SDE.Tabelul 3 prezinta rezultatele semicantitative ale compusilor organici volatili,in urma extractiilor in triplu exemplar. Huxelrebe este o varietate de vita-de-vie ce se inrudeste cu Muscatul,prin urmare,mustul si vinul sau contin caracteristici de aroma puternice specifice Muscatului.Planta originala a fost hibridizata din Chasselas d’Or si Courtillier Musque,varietati franceze de struguri de masa Muscat,in 1927.De atunci a devenit o varietate importanta de struguri in podgoriile din zona temperata (Germania si UK),datorita maturizarii timpurii si vinului aromatic obtinut din acestia.Se gasesc,de asemenea,mici plantatii de Huxelrebe in Willamette (Oregon),vestul Whashingtonului si in vestul British Columbia.In literatura nu se gasesc materiale si cercetari privind compusii din mustul Huxelrebe,insa se gasesc despre compusii din vinul si mustul de Muscat.Caracterizarea compusilor de aroma din mustul Huxelrebe s-a facut in comparatie si in functie de natura compusilor din varietatile de Muscat. Multi dintre compusii terpenoidici gasiti anterior in mustul sau vinul de Muscat pot fi gasiti si in mustul Huxelrebe(Tabel).Printre acestia sunt: -3,7-dimetil-1,5-octadieno-3,7-diolul; -geraniolul; -hotrienolul; -linaloolul; -oxidul de linalool(forma furanozica si piranozica); -nerolul;

-α-terpineolul; La acestia se mai adauga alcoolul benzilic si 2-feniletanolul, de asemenea compusi descoperiti in mustul Huxelrebe,care se gasesc si in vinurile Muscat. Toate aceste caracteristici se pot gasi la vinurile englezesti din Huxelrebe. Originea benzotiazolului si a 2-(metiltio)-benzotiazolului nu este cunoscuta. Primul,care este un aditiv(o guma),a fost descoperit printre compusii de aroma din diferite tipuri de musturi si vinuri. 4.Concluzii. S-a demonstrat ca metoda de extractie prin sorbtie cu agitate(SBSE) este un mijloc eficient si de viitor pentru descoperirea si caracterizarea compusilor de aroma din sucul/mustul de struguri,fiind o metoda mult mai sensibila si eficienta decat metoda traditionala de distilare-extractie simultana(SDE).Prin SBSE,din mustul de struguri Huxelrebe au fost descoperiti 126 de compusi organici de aroma,in timp ce,prin SDE s-au descoperit doar 98 de compusi de aroma,iar 5 dintre acestia sunt considerati produsi de descompunere termica a glucidelor. Reproductibilitatea metodei SDE este excelenta,cu un coeficient mediu de variatie de 6.3% si recuperare medie de 86.9%.Per total metoda SDE la scara microscopica prezinta excelente recuperari si reproductibilitate pentru majoritatea compusilor de aroma volatili extrasi din sucul model de struguri,la concentratia studiata(400 μg/l pentru fiecare compus) .Desi recuperarile relative si reproductibilitatea sunt,in general, mai mici in cazul tehnicii SBSE,se pune insa accentul pe faptul ca aceasta tehnica este mult mai sensibila decat SDE,iar concentratiile compusilor de aroma din sucul sintetic de struguri folosit la aplicarea SBSE au de 40 de ori mai mici decat cele utilizate la aplicarea SDE. Plecand de la aceste premise,metoda poate fi utilizata in controlul calitatii si in alte domenii inrudite.

Bibliografie: 1. Tardea,C.,Tardea,A.,Sarbu,G.,2000.Tratat de vinificatie.Editura Ion Ionescu de la Brazi,Iasi. 2. Cebotarescu,I.D.,Neagu,C.,Bibire,L.,1997.Utilaj tehnologic pentru vinificatie. Editura Tehnica,Bucuresti. 3. ***1998. Manualul inginerului de Industrie Alimentara, vol.1.Editura Tehnica, Bucuresti. 4. www.sciencedirect.com