Bakteri Kel. 5 Identifikasi Bakteri.docx

BAB II PEMBAHASAN

A. Pengertian Identifikasi bakteri Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri adalah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium. Pencirian bakteri yang diisolasi dari pasien, makanan dan minuman, harus dilaksanakan dengan cepat dan tepat sehingga dapat diketahui nama bakter, dan menentukan pilihan pengobatan dengan tepat (Boleng, 2015: 111). Bakteri yang akan diisolasi, dapat berupa biakan murni atau populasi campuran. Bila biakan bakteri yang akan didentifikasi ini tercemar, maka perlu dilakukan pemurnian terlebih dahulu. Lazimnya, pemurnian dilakukan dengan cara menggores suspensi bakterl yang akan diisolasi pada Agar lempengan. Setelah diperoleh koloni terpisah, memudian dibuat pewarnaan Gram dari beberapa koloni untuk melihat kemurnian biakan. Setelah diperoleh biakan murni dapat dilakukan serangkaian pemeriksaan dan uji untuk memperoleh ciri morfologi dan biokimia dari isolat. Pemeriksaan yang dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh data tentang morfologi bakteri. Setiap uji yang dilakukan pada sel atau produksi sel bakteri, kontrol untuk mengetahui apakah media serta reagens yang digunakan mernenuhi persyarata. Selain itu, kontrol digunakan untuk melihat bahwa teknik yang digunakan benar dan tepat (Boleng, 2015: 111). Umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat alau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikroba yang tidak mempunyai zat warna, seperti umumnya yang didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang jelas mempunyai butir-butir atau serat warna dalam selnya. Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun 3|identifikasi bakteri

sifat-sifal morfologi lainnya. Bakteri tunggal, yaitu yang berupa satu sel saja hanya kelihalan bening saja, walaupun bakteri itu diambilkan dari suatu koloni tertentu. Oleh karena itu, untul memperlihatkan bagian-bagian sel diperlukan pewarnaan Untuk memperlihatkan inti atau bahan inti ada pewurnaun sendiri, untuk melihat flagel ada cara lain lagi, demikian pula untuk melihat spora ada cara yang khusus untuk itu saja. Misalnya, pewurnaan inti disebut juga pewarnaan secara Feulgen. Pewarnaan yang lain adalah cara Giemsa, pewarnaan secara Gram, secara Neisser, dan masih banyak lagi (Waluyo, 2007: 55-56). Pemahaman yang benar tentang ciri-ciri bakteri tertentu, merupakan syarat yang harus dikuasal oleh seseorang yang melakukan identifikasi bakteri. Ciri-ciri bakteri tersebut menyangkut morfologi sel bakteri, serta hasil yang diperoleh dari suatu uji kimiawi,

Ciri-ciri

bakteri,

menjadi

penuntun

dalam

setiap

langkah

pengidentifikasian bakteri, sehingga memungkinkan penemuan atau pemberian nama yang benar terhadap suatu spesies bakteri (Boleng, 2017: 101). B. Macam- macam identifikasi bakteri Kriteria yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri secara mikroskopis didasarkan pada bentuk, ukuran, kelompok, reaksi pengecatan Gram dan motilitas. Observasi mikroskopik dikombinasi dengan data natural environment sangat penting untuk mengidentifikasi bakteri. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology

merupakan

buku

panduan

untuk

mengidentifikasi

bakteri

berdasarkan karakter mikroskopik dan fisiologik. Identifikasi dengan tes biokimia digunakan untuk membedakan genus dari famili dan spesies dari genus. Galur (strain) dalam single species dibedakan dengan cara genetik atau imunologik. Seseorang yang dicurigai terinfeksi bakteri dapat diambil spesimen untuk dibiakan dan disolasi serta diidentifikasi berdasarkan prinsip taksonomi. Tes harus mudah dilakukan, biaya rendah dan hasilnya cepat. Metode klasik diagnostik didasarkan atas ciri morfologi dan metabolisme sedangkan saat ini telah lazim digunakan teknik biologi molekuler. Taksonomi modern merupakan metode yang kompleks mencakup analisa molekuler dan kimiawi. Taksonomi bakteri meliputi Family: 4|identifikasi bakteri

Kelompok yang berkerabat pada tingkat genus. Genus: kelompok yang berkerabat pada tingkat spesies. Species: kelompok yang berkerabat pada tingkat strain. Type: suatu kelompok (set) strain dalam satu spesies misalnya biotypes, serotypes. Strain: satu galur atau satu isolat yang diperoleh dari biakan spesies. Penamaan yang lazim adalah binomial yaitu genus diawali huruf besar dan spesies dengan huruf kecil, ditulis digarisbawahi atau dimiringkan misalnya Streptococcus pyogenes atau disingkat S. pyogenes. 1. Pengamatan Makroskopik Menurut Dwijoseputro (1989) Pengamatan makroskopik dilakukan untuk mengamati karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi pada media NA datar berdasarkan: a. Bentuk koloni (dilihat dari atas): berupa bulat (circulair), berbenang (filamenthus), tak teratur (irregular), serupa akar (rhizoid), serupa kumparan (spindle).

Gambar 1. Bentuk Koloni Bakteri Sumber: (www.google.com) b. Permukaan koloni/elevasi (dilihat dari samping): rata (flat), timbul-datar (raised), timbul-melengkung (convex), membukit (umbonate).

5|identifikasi bakteri

Gambar 2. Permukaan Koloni Bakteri Sumber: (www.google.com) c. Tepi koloni (dilihat dari atas): utuh (entire), berombak (lobate), bergerigi (serrate), berbenang (filamenthus), keriting (undunate).

Gambar 3. Tepi Koloni Bakteri Sumber: (www.google.com) d. Warna koloni: keputih-putihan, kelabu, kekuning-kuningan atau hampir bening. 2. Pengamatan Mikroskopik Pengamatan mikroskopik dilakukan untuk melihat bentuk sel serta sifat bakteri. Pengamatan mikroskopis meliputi pewarnaan gram dan uji biokimia (Holt et al., 1994). Uji yang digunakan dalam identifikasi bakteri, tidaklah untuk semua kelompok. Sebagai contoh untuk proses identifikasi bakteri kelompak Enterbacteriaceae, salah satu langkah pengujiannya adalah digunakan 6|identifikasi bakteri

kemampuan bakteri tersebut memfermentasi laktosa. Namun demikian, tahap mengujian sifat fermentasi laktosa ini tidak dapat dipakai untuk proses identifikasi bakteri kelompok Staphylococcus dan Streptococcus. Untuk kedua kelompok hakteri kokus tersebut, digunakan uji katalase (Boleng, 2015: 111). a. Pewarnaan Gram Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting ialah pewarnaan gram. Dalam proses ini, olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutanlarutan berikut dalam urutan yang terdaftar pada tabel 2.1: ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 42 dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna merah. Menurut (Subandi, 2012: 186-189), dalam pewarnaan gram digunakan 4 zat kimia yang berbeda, bahan-bahan kimia tersebut adalah: 1.

Zat wama primer, yaitu kristal violet berfungsi sebagai zat warna primer dan memberikan warna pada seluruh bagian sel berwarna biru ungu

2.

Mordan yaitu lodin gram. Zat ini berperan sebagai mordan, yaitu zat kimia yang membentuk komplek yang tidak larut dengan mengikat zat warna primer. Hasilnya adalah komplek kristal violet-iodin (CV-I) yang berfungsi mengintesifkan warna zat warna primer sehingga seluruh sel akan tampak ungu-gelap. Pada sel bakteri gram-positif, komplek CV-I akan terikat pada asam ribonukleat-magnesium yang merupakan komponen dinding sel dan membentuk kompleks asam ribonukleatmagnesium-kristal violet-iodin (Mg-RNA-CV-1) yang sifatnya sangat sulit dipisahkan atau dihilangkan warnanya. 7|identifikasi bakteri

3.

Zat Decolourizing , yaitu etil alkohol dengan konsentrasi 95 % . Zat itu berperan ganda sebagai pelarut lipida dan sebagai zat dehidrasi protein Efektif-perannya bergantung pada konsentrasi lipida dari dinding sel mikroorganisme.

4.

Lawan-warna (Counterstain), yaitu safranin. Zat ini merupakan zat kimia terakhir yang digunakan untuk mewamai sel yang telah kehilangna warnanya oleh alkohol. Karena hanya pada sel gram-negatif yang mengalami kelenturan wananya, maka gram-negatif itu yang akan menerima zat warna safranin, sedangkan sel bakteri gram-positif akan tetap bewarna seperti zat warna primer Menurut Gruber (201: 150-155) perbedaan warna gram positif dan Gram

negatif yaitu: 1.

Gram positif: dindingsel terluar terdiri dari peptidoglikan tebal tanpa lapisan lipoprotein atau lipopolisakarida seperti pada bakteri Gramnegatif, sehingga pada saat diberikan larutan kristal ungu, kemudian dikuti dengan pemberian larutan lugol maka akan terbentuk kompleks kristal ungu dan yodium yang melekat kuat pada dinding selnya. Walaupun diikuti prosedur pencucian dengan larutan pemucat serta pemberian pewama tandingan, serta pencucian dengan air, maka wama ungu tidak akan mudah terlepas dari dinding selnya.

2.

Gram negatif: tidak seperti Gram-positif, dinding sel bakteri poprotein atau lipooakarida. Pada saat Gramnegatif terdiri dari peptidoglikan tipis yang dibungkus vemberian larutan kristal ungu, larutan ini akan diserap/ tersebar pada lapisan lipoprotein atau lipopolisakarida. Walaupun diberikan larutan lugol, tidak akan terbentuk kompleks kristal ungu dan yodium pada dinding se (peptidoglikan), sehingga pada saat diberikan larutan pemucat maka kristal ungu yang mengendap pada lapisan ipopotein atau lipopolisakarida serta-merta akan tercuci atau larut bersama dengan lapisan tersebut. Pada akhimya, pemberian pewarna 8|identifikasi bakteri

tandingan (safranin) akan memberikan warna merah muda pada dinding sel bakteri tersebut

Gambar 4. Bakteri Gram Positif dan negative Sumber: (www.google.com) b. Uji biokimia Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melalui sifat-sifat fisiologinya. Proses biokimia erat kaitannya dengan metabolisme sel, yakni selama reaksi kimia yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan selular, seperti pergerakan. Suatu 43 bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya (Cowan, 2004). Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologi biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai kandungan organik yang diperiksa maka penetuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti bakteri berdasarkan pada reskasi 9|identifikasi bakteri

enzimatik maupun biokimia. Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yangb dapat menghasilkan perubahan warna reagen (Cowan, 2004). Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Uji lain dapat dilakukan dengan cara melihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi. Uji-uji biokimia ditujukan untuk memastikan bakteri yang dianalisa benar-benar bakteri yang diharapkan. Uji biokimia bertujuan untuk memperkecil kesalahan, karena beberapa spesies memiliki sifatsifat yang hampir sama (MacFaddin, 1980). Beberapa jenis uji biokimia antara lain: 1) Uji Indol Media yang dipakai adalah pepton 1%. Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac‟s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Interpretasi hasil: negatif (-): Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, arinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tripthopan sebagai sumber karbon. Positif (+): Terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon (Cowan, 2004). 2) Uji MR (Methyl Red) Media yang digunakan adalah pepton glukosa phospat. Uji ini digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran (metilen glikon). Interpretasi hasil: negatif (-): tidak terjadi 10 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

perubahan warna media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1%. Positif (+): Terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR (Cowan, 2004). 3) Uji VP Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin) dari hasil fermentasi glukosa. Interpretasi hasil: negatif (-): tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%. Positif 45 (+): terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil karbinol (asetoin) (MacFaddin, 1980). 4) Uji Citrat Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada media simons citarat berisi indikator BTB (Brom Tynol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil: negatif (-): tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan sitrat sebagai salah satu/satusatunya sumber karbon. Positif (+): terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah satu/satusatunya sumber karbon (Ratna, 2012). 5) Uji Motilitas 11 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandungan agar-agar 0.2-0.4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi hasil: negatif (-): terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih akar hanya pada bekas tusukan inokulasi. Positif (+): terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar di sekitar 46 inokulasi. Hal ini menunjukkan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel (Burrows, 2004). 6) Uji Katalase Uji katalase berguna dalam mengidentifikasi kelompok bakteri yang dapat menghasilkan enzim katalase. Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan hidrogen peroksida (H2O2) pada gelas objek yang bersih. Biakan dioleskan padagelas objek yang sudah ditetesi H2O2 dengan usa. Suspensi dicampur secara perlahan menggunakan usa, hasil yang positif ditandai oleh terbentuknya gelembung-gelembung udara (Hadioetomo, 1993). 7) Uji Koagulasi Uji koagulasi dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri yang menghasilkan enzim yang dapat menggumpalkan fibrin. Uji koagulase dilakukan dengan cara, dari media agar darah, diinokulasikan 1-3 koloni bakteri ke dalam media HIB. Kemudian diencerkan 1 mL plasma dengan 4 mL aquadest, lalu dipipet 0.5 mL dan masukkan ke dalam biakan HIB dan dihomogenkan. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Diamati pembentukan gumpalan pada medium, adanya gumpalan seperti awan menunjukkan hasil positif (Hadioetomo, 1993). 12 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

C. Tahap- tahap identifikasi bakteri Sampel berupa cairan seperti darah, urin dan cairan serebrospial dimasukkan dalam cawan biakan dan koloni akan tampak dalam beberapa hari. Tiap koloni mengandung jutaan sel. Koloni diamati ukuran, tekstur, warna dan jika tumbuh dalam agar darah diamati ada tidaknya hemolisis merupakan langkah awal paling penting dalam identifikasi. Apakah organisme membutuhkan oksigen 9 untuk tumbuh merupakan ciri penting lain untuk membedakan. Koloni diwarnai dengan pengecatan Gram dan diamati dibawah mikroskop. Bakteri diidentifikasi hingga tingkat spesies (speciated) menggunakan koloni tersebut. Sering membutuhkan waktu lebih dari 24 jam. Langkah-langkah pewarnaan Gram: 1. Koloni dikeringkan dan diletakkan di atas gelas obyek - Diwarnai dengan crystal violet. 2. Fiksasi dengan iodine akan menstabilkan crystal violet staining. Bakteri akan menyisakan warna merah (purple) atau biru. 3. Ekstraksi dengan alkohol atau pelarut lainnya. Bakteri akan kehilangan warna (Gram negatif) atau tidak (Gram positif). 4. Counterstaining dengan safranin. Gram positif akan tetap terwarnai dengan crystal violet dan berwarna purple sedangkan Gram negatif akan terwarnai pink/biru. Selain pengecatan Gram juga dikenal pengecatan umum lainnya yaitu untuk mewarnai spora dan kapsul. Koloni lain dari isolat yang sama diamati reaksi biokimianya misalnya apakah memfermentasi gula atau laktosa. Cara lainnya adalah identifikasi serologis dan molekuler. Pada beberapa tahun ini sekuensing 16S ribosomal RNA (16S rRNA) menjadi "gold standard" dalam taksonomi. Molekul ini memiliki panjang sekitar 1600 bp (base pairs). Sekuen 16S rRNA bakteri yang berdekatan spesiesnya akan identik. Beberapa patogen seperti penyebab tuberkulosis, Lyme disease dan syphilis tidak dapat diisolasi atau sangat

13 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

buruk tumbuhnya. Deteksi langsung merupakan cara terpilih. Cara yang paling sederhana misalnya deteksi antigen atau sekuensing. D. Manfaat identifikasi bakteri Manfaat dari identifikasi bakteri adalah: 1. Untuk menentukan nama yang benar dan tempatnya yang tepat dalam klasifikasi bakteri 2. Untuk mengetahui struktur bentuk, tepi, permukaan dan warna dari koloni bakteri 3. Untuk membantu dalam mengklasifikasikan bakteri tersebut termasuk dalam bakteri Gram positif dan Gram negative 4. Dan untuk mengetahui peranan bakteri dalam kehidupan manusia

14 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

BAB III PENUTUP

A. Kesimpulan’ Berdasarkan pembahasan yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Identifikasi bakteri adalah pencirian bakteri yang diisolasi dari pasien, makanan dan minuman, harus dilaksanakan dengan cepat dan tepat sehingga dapat diketahui nama bakteri dan menentukan pilihan pengobatan dengan tepat. 2. Macam macam dari identifikasi bakteri adalah berdasarkan pengamatan makroskopik yaitu pada bentuk koloninya, permukaan koloni, tepi koloni dan warna koloni bakteri. Berdasarkan pengamatan mikroskopiknya yaitu pewarnaan gram (bakteri gram positif dan negative) serta uji biokimia. 3. Manfaat dari indentifikasi bakteri ini adalah untuk memberi nama bakteri dan untuk mengidentifikasi bakteri

15 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i

Daftar Rujukan

Boleng, Didimus. Tanah. 2015. Bakteriologi. Malang : UMM Press. Ijong, Grube. F. 2015. Mikrobiologi Prikanan dan Kelautan. Jakarta: PT. Rineka Cipta. Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: Yrama Widya. Subandi, M. H. 2012. Mikrobiologi. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya Offset. Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.

16 | i d e n t i f i k a s i b a k t e r i